השפעה חמורה של חומרי הדברה על דבש מלכות דבורים Neonicotinoid pesticides severely affect honey bee queens

השפעה חמורה של חומרי הדברה על דבש מלכות דבורים

ג’פרי ר.ווילאמס, אלין טרוסלר, ג’ינה ריטצ’ניג, קספר רות, אורלנדו יאנז, דייב שוטלר, פיטר נאומן, ולורן גוטייר

בריאות המלכה היא חיונית להישרדות המושבה של דבורים חברתיות. לאחרונה, כישלון המלכה הוצע כדי להיות המניעי המרכזי בהפסדי ניהול מושבות דבורי דבש, יחד עם זאת קיימים מספר נתונים לגבי ההשפעות של לחץ סביבתי על המלכות. כאן אנו מדגימים לראשונה כיצד חשיפה של ריכוז חומרי הדברה ניאוניקוטינואידים (רעלנים מלאכותיים) במהלך ההתפתחות יכול להשפיע קשות על מלכות של דבורי דבש מערביים (מסוג Apis mellifera).   בזמן חשיפה לחומרי ההדברה אנטומית הרבייה (השחלות) והפיזיולוגיה (אכסון הזרע, איכות וכמות זרע), יותר מאשר בזמן תעופה, היו בסיכון והפחיתו באופן צפוי את הצלחת המלכה (בחיים ולייצר צאצאים פועלות). מחקר זה מדגיש את ההשפעות של  הרעלנים על המלכות באופן סביבתי וכלכלי והחשיבות להתנהגות החברתית של הדבורים, ומחזק עוד יותר את הצורך בהערכות סיכונים מחמירות כדי להגן על המגוון הביולוגי ועל שירותי המערכת האקולוגית כי הם פגיעים לחומרים אלה.

        הדבורים חיוניות למגוון הביולוגי העולמי וביטחון המזון באמצעות האבקה של צמחים, כולל מספר גידולי מפתח. עדויות חדות מעידות על כך שאוכלוסיות דבורים רבות נמצאות בירידה, כנראה בגלל לחצים סימולטניים מרובים, כולל טפילים פולשניים, שינויי האקלים ושינוי השימוש בקרקע. זה הוביל לחששות על ביטחון המזון האנושי ותחזוקת המגוון הביולוגי. המעמד הרעלני של חומרי הדברה כימיים קיבל לאחרונה תשומת לב בגלל הסיכונים האפשריים שהוא מציב לתפקוד המערכת האקולוגית ולשירותיה בכל מקום המשמשים לניהול חרקים מזיקים בעשור האחרון, כימיקלים כימיים אלה נשארים בסביבה, וכך מקדמים את הקשר שלהם עם אורגניזמים שאינם היעד שלהם כגון האבקת הדבורים.

        באופן מדאיג, החשיפה לריכוזים של הרעלנים בשדה פוגעת ביעילות של האבקת הדבורים החברתיות,  בנקבות ביעילות חלוקת עבודת הרבייה בין העובדים ובין המלכות. שפע של ספרות הוכיח השפעות קטלניות ותת-קטלניות של רעלנים וחומרי הדברה על דבורים חברתיות בשדה ובמעבדה. בדיקות אלה התמקדו במידה רבה בפועלות (הנקבות האחראיות בעיקר על ניהול משק הבית החיוני ועל חיפוש מזון ולא על רבייה, הייצור שלהם של צאצאים פלואידים מוסדר בעיקר על ידי פרומונים של המלכה ועוד תנאים במושבה), ובמידה פחותה לתפקוד כולל של המושבה. תפקיד המלכות (נקבות פוריות שיכולות לייצר צאצאים דיפלואידים) בהישרדות מושבת הדבורים החברתית היא הכרחית, והיא מסתמכת במידה רבה על התפתחות מוצלחת ועל מעוף הזדווגות מוצלח המפעיל שינויים מולקולרים עמוקים, פיזיולוגיים והתנהגותיים. חקירות קודמות נצפו כי מושבות דבורים מסוג ‘במבל’ שנחשפו לרעלנים הפיקו פחות מלכות עתידיות, ומושבות דבורים אלו החליפו מלכות בתדירות גבוהה יותר, יחד עם זאת, המנגנונים האחראים לתצפיות אלו לא זוהו. זה מדהים בהתחשב בדוחות אנקדוטיים של “מלכות באיכות ירודה” (כלומר כישלון המלכה) של מינים חשובים מאביקים, דבורי הדבש המערבי (‘אפיס מליפרה’, להלן דבורת הדבש), בכל חצי הכדור הצפוני.

במחקר זה, הנחנו כי חשיפה לריכוז שדה מציאותי של חומרי הדברה ניאונוטינואידים  (רעלנים) יפחית באופן משמעותי את הביצועים של הדבורה המלכה עקב שינויים אפשריים בהתנהגות, ובאנטומית הרבייה והפיזיולוגיה. כדי לבדוק זאת, חשפנו מלכות דבורי דבש מתפתחות לריכוזים סביבתיים רלוונטיים של חומרי הדברה נפוצים. שני חומרי ההדברה מוחלים באופן נרחב במערכות האקולוגיות הגלובליות בעולם ונגישים למאביקים כגון של דבורים חברתיות, אך כיום הן כפופות לשימוש מוגבל למשך שנתיים באירופה בשל חששות לגבי בטיחותם. על בקיעה של גולם, מלכות הורשו להתבגר מינית. התנהגות תעופה נצפתה מדי יום במשך 14 יום, בעוד הייצור של צאצאי פועלות נצפתה באופן שבועי במשך 4 שבועות. מלכות ששרדו הוקרבו כדי לבחון את מערכות הרבייה שלהם.

תרשים 1: דבורים ששרדו לאחר 4 שבועות. אחוז מלכות דבורי דבש שנשאר בחיים לאחר 4 שבועות. לא נמצא אפקט מובהק בין התנאים (בהשוואה לקבוצת ביקורת). . *P ≤ 0.1, **P ≤ 0.05, ***P ≤ 0.01

תוצאות

הצלחת גידול המלכה. לא נצפה הבדל משמעותי בין תנאי הניסוי עבור הצלחת גידול המלכה. הצלחה (כלומר גידול  לצמיחה)  מבחן חי בריבוע (P = 0.6  , 0.3 =) הצלחה הייתה  9.5%  ± 38.1 ו- 14.6% ±44.0 בקבוצת ביקורת  וברעלנים, בהתאמה (ממוצע   ± שגיאת תקן).

תצפיות הזדווגות גרעין המושבה. לאחר ארבעה שבועות שלאחר הופעת המלכה, 25% פחות מלכות שנחשפו לרעלנים  היו בחיים לעומת הביקורת. מבחן חי בריבוע טיב התאמה (P = 0.11  , 2.6=, תרשים 1). ללא קשר האם הם שרדו עד ארבעה שבועות, 38% פחות מלכות שנחשפו לרעלנים הפיקו פועלות בהשוואה לקבוצת ביקורת    P = 0.0004) , 8.2=, תרשים 2א). אפילו בתוך תצפית האינטרוול המקוצרת שלנו, ירידה משמעותית של 34% בהצלחה (כלומר, חיים ויצירת צאצאים של פועלות) נצפתה בקרב מלכות חשופות לרעלים בהשוואה לביקורת          (P = 0.03, 4.5=תרשים 2ב).

תרשים 2: הטלת ביצים של המלכה והשרדות לאחר 4 שבועות. (א) אחוז מלכות דבורי דבש שהטילו ביצים של פועלות. (ב) אחוז מלכות דבורי הדבש שהיו בחיים והניבו צאצאים דיפלואידים עד סוף הניסוי (= הצלחה). הבדלים משמעותיים בין תנאי הניסוי ** P ≤ 0.05, *** P ≤ 0.01 * P ≤ 0.1.

.

תרשים 3: תעופת המלכה על פני אינטרוול של 4 שבועות.  (א) מספר טיסות לפי מלכות דבורי דבש. (ב) סך הכל משך הטיסות לפי מלכות דבורי הדבש (ג) מספר סימני ההזדווגות. תיבת חלוקה הראתה טווח רבעוני (תיבה), חציון (קו שחור בטווח הבין-רבעוני), ממוצע (כוכבית אפורה), טווח נתונים (קו אנכי מקווקו), וחריגים (נקודות פתוחות). לא נצפה הבדל משמעותי בין תנאי הניסוי בכל קנה מידה. * P ≤ 0.1, ** P ≤ 0.05, *** P ≤ 0.01 (השוואה עם ביקורת).

תרשים 4: מלכה מסומנת חוזרת לכניסה של צאצא הזדווגות בגרעין הכוורת במהלך תצפיות הניסוי, חץ מציין סימן הזדווגות (שרידים של זכר האנדופאלוס בולט מן הנרתיק של המלכה).

לא נמצא הבדל בין תנאי הניסוי עבור כל פרמטר מעוף של המלכה הנמדדת, בשתי הקבוצות המלכות התחייבו למספרים דומים (מבחן חד כיווני (P = 0.99  , 0.1=, תרשים 1ג). ומשך (מודל מעורב עם מלכה כגורם אקראי, factor, F1,174 = 0.2, P = 0.67  של טיסות, והיו בהם סימנים דומים של הזדווגות (כלומר שרידים של זכר האנדופאלוס מוחדר לכניסה של דרכי הרבייה של המלכה. (P = 0.17 , 1.9=, תרשים 3ג ותרשים 4) .

תרשים 5: אנטומיה והפיזיולוגיה של המלכה לאחר 4 שבועות. (א) גודל השחלה, המיוצג במספר השחלות, של מלכות דבורי דבש (ב) מספר זרעונים מאוחסנים בתיבת זרע של מלכות דבורי דבש. (ג) אחוז זרע קיים מאוחסן בתיבת זרע של מלכות דבורי דבש. תיבות זרע מציגות טווח בין רבעוני (תיבה), חציון (קו שחור בטווח הבין-רבעוני), ממוצע (כוכבית אפורה), טווח נתונים (קווים אנכיים מקווקוים), וחריגים (נקודות פתוחות). * P ≤ 0.1, ** P ≤ 0.05, *** P ≤ 0.01 (השוואה עם ביקורת).

ניתוחי המלכה ומדידות מעבדה עבור מלכות ששרדו את התצפית של ארבעה שבועות, גודל השחלה של אלה שנחשפו  לרעלנים היו 6.8% יותר לעומת הביקורת (ANOVA F1.35 = 9.0, P = 0.005, איור 5 א). מלכות שנחשפו היו 20% פחות זרעונים מאוחסנים (F1.35 = 4.8, P = 0.03, איור 5ב) ו 9% נמוך יותר של זרע חי לעומת מת (F1.35 = 3.3, P = 0.08; איור 5 ג). עבור המלכות ששרדו והניבו צאצאים של פועלות (N = 37), לא היה מתאם משמעותי בין כמות ההופעה, מספר שחלות, מספר זרע או חיוניות הזרע (הכל | r | <0.26, all|| | P> 0.13). באופן דומה, לא נמצאו הבדלים משמעותיים כאשר המלכות הופרדו על ידי טיפול, ביקורת: מקסימום |r| = 0.24מינימום p=0.29 N)=22), רעלנים: מקסימום |r| = 0.21 מינימום p=0.44 (N=15).

דיון

התוצאות מדגימות בפעם הראשונה מנגנוניים אפשריים לפיהם החשיפה בשדה המציאות לריכוזים של חומרי הדברה רעלנים במהלך ההתפתחות יכול להשפיע באופן משמעותי על מלכות של דבורים חברתיות. בשנים האחרונות דווח על עלייה בכישלון בשיעורי מלכת דבורי הדבש. אפילו בתוך טווח התצפית שלנו, ראינו השפעות משמעותיות של רעלנים על דבורת הדבש המלכה מבחינה אנטומית ופיזיולוגית, אך לא התנהגות שהביאה להצלחה מופחתת (כלומר, מלכות מתות או בחיים אך אינן מייצרות צאצאים של פועלות). בנוסף, לא מצאנו השפעה משמעותית על הצלחת גידול המלכה (פרופורציה של היוצרות המלכות) בין הטיפולים, דבר המצביע על כך שלא היו השפעות קטלניות של חומרי הדברה במהלך שלב זה של התפתחות המלכה. בגלל שהדבורים הן פלואידילואידיות, זכרים הם בדרך כלל תוצאה של ביצים לא מופרות ונקבות (כלומר, פועלות או מלכות) מתפתחות מביצה מופרית, ייצור של פועלות מאשר הזדווגות מוצלחת של המלכה. מלכות דבורי דבש רק לעתים רחוקות דוגרות מעל 3 שבועות של היווצרות, כך שהיעדר פועלות במושבה במהלך 4 שבועות התצפית שלנו, תקופה שבה סביר להניח המלכה לא הזדווגה או מסיבה כלשהי אחרת לא הייתה מסוגלת להניח ביצים מופרות.

מלכות דבורי דבש הם מאוד דיפלואדיות , ובדרך כלל עולות על סדרה של מעוף ההזדווגות לאחר 14 יום של יציאה מן התאים שלהם שבמהלכו הם צריכות להיות מופרות עם מספר מספיק של זרעונים כדי להימשך את חייהם, הן בדרך כלל לא עוזבות את המושבה ברגע שהן מתחילות לדגור. המחקר מראה כי טיסות המלכה לא הושפעו בשל חשיפת הרעלנים בגלל שתדרים דומים ואורכים נצפו בקבוצת הביקורת. זה היה בלתי צפוי כי הרעלנים יכולים להשפיע לרעה על התנהגות מעוף דבורה פועלת. יכול להיות שבמחקר שלנו לא ניתן להשוות את מעוף המלכה ישירות למחקרים אלה בשל הבדלים בין מעמדי הנקבות (מלכה לעומת פועלת), מודל מינים (דבורת הדבש לעומת דבורת  במבל), טיפול ניסיוני (סוגי רעלנים וחומרי הדברה שונים) שיטה ניסיונית (תצפיות חזותיות לעומת תיוג זיהוי תדר רדיו), חשיפה לטיפול (מושבה לעומת אדם), או המשימה הנמדדת (הזדווגות לעומת חיפוש מזון).

אריכות ימים של מלכות דבורי דבש  תלויה במידה רבה בהתפתחות נאותה לבגרות מינית והתנהגות מתאימה לשינויים אנטומיים ופיזיולוגיים המתרחשים בעקבות הזדווגות מוצלחות. לכן, השפעות שליליות על מערכות הרבייה של המלכה שתוצאותיהן פיזיולוגיה או אנטומיה חריגה, או פגיעה באחסון של זרע או בהטלת ביצים, עלולה לגרום להחלפת המלכה על ידי המושבה. באופן מפתיע, ראינו הִיפֶּרְפְּלַזְיה בחשיפה לרעלנים לעומת קבוצת הביקורת. הגדלת גודל השחלה מציעה כי הרעלנים יכולים להשפיע על התפתחות מערכת הרבייה, לא ברור כיצד היפרפלזיה שנצפתה עשויה להשפיע על ייצור הביציות והפריה, או עשויים לגרום לשינויים אנטומיים או פיזיולוגיים אחרים. יתר על כן, ראינו ירידה משמעותית במספר ואיכות של זרעונים מאוחסנים בתוך המלכה. זה ייתכן כי רעלן מעורר עצבים יכול לגרום לתפקוד לקוי של פיזיולוגיה והאנטומיה האחראית על הובלה ואחסון חדש של זרע מהזכר במהלך ההזדווגות. אחסון נאות של כמויות נאות של זרעונים הוא חיוני להישרדות המלכה כי המלכה תוחלף במהירות על ידי מושבה לאחר דלדול של זרע בריא.

חוסר בריאות המלכה נחשב לגורם חשוב בתמותה של דבורי דבש בצפון אמריקה ובאירופה, אך נתונים מעטים יכולים להסביר תצפיות אלה על פני אזורים רחבים. בהתחשב  בשימוש נרחב של רעלנים במדינות מפותחות, המחקר שלנו עולה כי חומרים אלה, לפחות באופן חלקי, אחראים על פגיעה במלכות וגורמת לירידות האוכלוסייה של זן דבורים חברתיות. מלכות שנחשפו לניאונוטינואידים כשלו במהלך ההתפתחות בהטלת ביצים מופרות בהצלחה, ולאחר מכן בהתפתחות לפועלות או מלכות, זהו נתון מדאיג, שתי המעצמות חיוניות להישרדות המושבה, במיוחד כאשר נדרשת החלפת מלכה בחירום. זה חשוב במיוחד עבור דבורים חברתיות בטבע שלא יכולות לסמוך על התערבות האדם כדי למתן את ההשפעות של כישלון המלכה או תמותה של המושבה.

הדרישות הרגולטוריות הנוכחיות להערכת הבטיחות של חומרי הדברה לדבורים אינן מתייחסות על השפעות על רבייה. זה מטריד בהתחשב בחשיבות המפתח של המלכות להישרדות המושבה בהתאמת הפיריון שלהן לתנאי הסביבה. הממצאים שלנו מדגישים את הפגיעות לכאורה של אנטומיה ופיזיולוגיה המלכה לחומרי הדברה ורעלנים נפוצים, ומדגימים את הצורך במחקרים עתידיים כדי לזהות אמצעים מתאימים לתגובת לחץ של המלכה, כולל ויטלוגנין. הם גם מדגישים את חוסר הידע הכללי הן הקטלני והן תת-קטלני של ההשפעות של חומרים אלה על מלכות הדבורים, ואת החשיבות של הערכה נכונה של בטיחות חומרי הדברה כדי לשכפל חרקים, במיוחד עבור סוג דבורים חברתיות.

שיטות

הכנת הכוורת. המחקר בוצע בברן, שוויץ, בחודשים מאי – ספטמבר 2013 בשימוש דבורים מסוג מ’ליפרה  קרניקה’. בתחילת מאי הוקמו שש מושבות ניסיוניות של מלכות אחות. כל אחד מהם הכיל כמויות טיפוסיות של דבורים בוגרות, מזון (דבש ולחם דבורים) עבור העונה. מושבות חולקו באקראי לתנאי ניאונוטינואידים או לתנאי ביקורת, כאשר כל קבוצה יוצגה באופן שווה.

טיפול בחומרי הדברה. הטיפולים ניתנו באמצעות תוספי אבקה שהוכנו מאבקה שנאספה מדבש דבורים (3: 1 יחס לפי מסה בהתאמה) המתקבלים משטחים חקלאיים לא אינטנסיביים של שווייץ. תוספים של חומרי ההדברה היו גם מעורבבים עם רעלנים שונים (ppb thiamethoxam4 ו (ppb1 clothiandin ,לייצג ריכוזים רלוונטיים לסביבה נצפתה אבקה של יבולים מטופלים. כמויות אלה אושרו על ידי המרכז הלאומי הצרפתי למחקר מדעי באמצעות ספקטרומטריית מסה גבוהה במיוחד (UHPLC-MS / MS). מושבות היו מורכבות עם מלכודת אבקה לפני מתן טיפולים. מקדם תוסף אבקה זה נצרך על ידי הסרת אבקה שנאספה על ידי דבורים מלקטות. כל מושבה קיבלה 100 גרם אבקה להשלים כל יום במשך 36 ימים על מנת להבטיח כי המושבות הכילו דבורים צעירות שנחשפו לרעלנים במהלך גידול המלכה, ספקים התקבלו היטב, אך מעולם לא נצרכו לחלוטין במהלך כל תקופת האכלה.

גידול המלכה. מלכות של דבורי דבש סטנדרטיות גודלו במושבות ניסיוניות בטכניקות גידול מלכות. בקצרה, אחות המלכה המקורית הוסרה מהמושבה 27 ימים לאחר החשיפה הראשונית ליצירת גרעין של תאים ללא מלכה, שכל אחד מהם מורכב מ -2 מסגרות מזון ו- 1 ק”ג של פועלות לקן הדגירה. בכל יום זחלים ישנים מכל המושבה היו מורכבים לתוך תאי המלכה המלאכותית ולאחר מכן הוצבו בגרעינים בתאי הכוורת בלילה. כל גרעין של בניית תא, כולל תאי מלכות מלאכותיים, הוחזרו למחרת למושבה הניסיונית המקורית שלהם להבטיח התפתחות נכונה של המלכה, המושבות המשיכו לקבל תוספי אבקה עד אחרי שהמלכה מיצתה את התא. לפני הופעתה, מלכות הועברו לכלובים שסופקו עם דבק מזון (חלק אחד דבש: 3 חלקים אבקת סוכר על ידי מסה) אשר נשמרו במעבדה בחושך מוחלט ב 34.5 ° C ו 60% לחות). תאי המלכה נצפו כל 6 שעות החל מהיום ה- 11 לאחר ההרכבה. מלכות נבדקו ויזואלית, מוספרו על גבי בית החזה באמצעות סימון מספרים, ונכלאו מחדש עם חמש פועלות ממושבת האם עד הושבת המלכה (למשך יום אחד). לאחר מכן, כל המלכה הוצבה בגרעין ההזדווגות בכוורת עם 300 גרם ממתקים מיוחדים ו -100 גרם פועלות דגירה מהמושבה המקורית שלה, והוחזקו במשך 3 ימים בחושך ב 12 מעלות צלזיוס כדי לקדם את הקמת המושבה לפי המיקום בחוץ. בסך הכל, 29 מלכות שנחשפו לרעלנים ו -28 מלכות בקרה הועסקו להמשך מדידת ביצועים.

תצפיות על גרעין הזדווגות במושבה. הכניסות לגרעין ההזדווגות במושבות נצפו מדי יום מ 11.00-17.00 במשך 14 יום, תקופה טיפוסית של מעוף המלכה. כל המושבה היתה מצוידת בתצפית לוח הנחיתה שנבנה באמצעות בקבוק פלסטיק שטוח, ומסך לתיעוד יציאה וחזרה של המלכה ללא הפרעה לפועלות (תרשים 6). טיסות של מלכות הוגדרו כתקופות מחוץ למושבות, כולל תצפיות על לוחות נחיתה. לאחר תקופת ההתייחסות הראשונית ל -14 יום היתה נוכחות המלכות והתפתחות הפועלות בוצעה הערכה שבועית במשך 14 ימים נוספים על ידי בדיקה ויזואלית של כל המסגרות של כל גרעין הזדווגות.

איור 6. גרעין ניסיוני להזדווגות, כל גרעין מצויד עם כניסה המורכבת מבקבוק פלסטיק שטוח ומסך כוורות ללא מלכה כדי לצפות ביציאה ובחזרה של המלכות ללא הפרעה לפועלות.

ניתוחים שבוצעו למלכה ומדדי מעבדה. מלכות ששרדו את גרעין ההזדווגות בן 4 השבועות שכלל הערכה ותצפיות (16 מלכות ניסוי ו22 ביקורת) הוסרו מהמושבות שלהם והורדמו באמצעות דו תחמוצת הפחמן כדי לאפשר בדיקה של אנטומית הרבייה. תאי זרע ושחלות הוסרו והושמו במאגרים בתוספת פרפורמלדהיד  2%. מספרים של זרעונים מאוחסנים בכל תא חושבו באמצעות כלי מדידה באמצעות מתחם מיקרוסקופיה (דגם BX41, אולימפוס). החיוניות של זרע בתא נקבע באמצעות ערכת מעבדה (חי/מת, ערכת חיוניות, טכנולוגיות לייף) שבו ההשעיה aliquot 50 μ l של שעון, התא היה צבוע באמצעות יודיד SYBR-14  להצגת 10 שדות של זרעים חיים או מתים באמצעות מיקרוסקופ מתחם ניאון (דגם BX41, אולימפוס). מספר אברונים הקשורים לשחלה נקבע על ידי ספירה בזמן אמת תחת מיקרוסקופית סטריאו (דגם SZX10, אולימפוס) באמצעות מחט דקה.

סטטיסטיקה. תוכנה סטטיסטית שימשה לביצוע ניתוחים (SAS 9.3, SAS Institute). השוואה בין מספר המלכות מכל תנאי טיפול שהיו בחיים ופעילות בייצור (מוצלח) לעומת מת או לא מייצרות פועלות (נכשלו) נעשו עם ניתוחי טבלה, כמו גם השוואות של מספרים של מלכות בחיים לעומת מתים, ומספרים של מלכות מייצרות פועלות לעומת אלו שלא. להשוואת מעוף ברוב המלכות הופיע פעמים רבות בנתונים; כדי לספור מספר דגימות היה גורם אקראי במודלים מעורבים. עבור פרמטרים הרבייה, בוצע ניתוח שונות חד כיווני לטיב התאמה כאשר הנתונים לא היו ידועים בדרך כלל, ואילו מבחן הנובה שימש כאשר הנתונים היו בדרך כלל ידועים. ניתוח מתאם (פירסון וספירמן נתן תוצאות דומות מבחינה איכותית) שימשו להעריך אסוציאציות בין מסת העצם, מספר אברי שחלות, מספר זרעונים, וחיוניות הזרע.