Inhibitory kinetics of DABT and DABPT as novel tyrosinase inhibitors

הקינטיקה המעכבת של DABT ו-DABPT כמעכבי טירוזינאז חדשניים

דימתיל-אמינו-בנזלדהיד-תיאוסמיקרבזון-4 (DABT) ודימתיל-אמינו-בנזלדהיד-N-פניל-תיאוסמיקרבזון-4 (DABPT) סונתזו ונקבעו על ידי 1H ו-13C NMR וספקטרום מאסות. שתי התרכובות נבדקו עבור הפעילות המעכבת שלהם על טירוזינאז פטרייה, ובנוסף נבדקה קינטיקת האנטי-טירוזינאז שלהם. התוצאות הראו כי שתי התרכובות הציגו השפעות מעכבות משמעותיות על פעילות המונופנולאז והדיפנולאז; DABT ו-DABPT הפחיתו את הקצב הקבוע עם 1.54 µM ו- 1.78 µM כערכי IC50 שלהם, בהתאמה. ההשפעות המעכבות של פעילות הדיפנולאז הוצגו באופן חד באופן תלוי-מינון, וערכי ה- IC50 שלהם נאמדו כ- 2.01 µM ו-0.80 µM בהתאמה. הניתוח הקינטי הראה כי המנגנון המעכב שלהם הינו הפיך. סוג המעכב של DABT היה מעורב, עם קבועי מעכבים Ki = 1.77 µM ו- Kis = 6.49 µM, בעוד שאלו השייכים ל-DABPT היו בלתי-תחרותיים עם קבועי מעכבים Ki = 0.77 µM.

טירוזינאז (EC 1.14.18.1), הידוע גם בתור פוליפנול אוקסידאז (PPO), הינו אוקסידאז דו-נחושת רב-תפקודי אשר מזרז את ההידרוקסילציה של מונופנול ל-0-דיפנול ואת האוקסידציה של 0-דיפנול ל-0-קינונים, אשר עוברים פולימריזציה לא-אנזימית נוספת המובילה ליצירה של מלאנין. ניתן למצוא טירוזינאז בקרב כמעט כל המינים, מפרוקריוציטים עד לאאוקריוטים והוא מעורב בתהליכים פיזיולוגיים רבים. עבור בני אדם, הטירוזינאז ממלא תפקיד חשוב בייצור פיגמנט המלאנין, שהוא משמעותי בהגנה מפני פציעות עור הנובעות מקרינה על-סגולית UV)), ואחראי למספר הפרעות היפר-פיגמנטציה, כמו מלזמה, כתמי גיל, ואתרי נזק אקטיני. לפיכך, ויסות של סינתוז המלאנין על ידי עיכוב הטירוזינאז מהווה נושא מחקר עדכני בתחום המניעה של היפר-פיגמנטציה. בנוסף, הטירוזינאז משתתף בהתקדמות תהליך ההשחמה האנזימי הבלתי רצוי בפירות וירקות, הפוגע באיכות והערך של תוצרים אלו. למיטב ידיעתנו, מספר מעכבי טירוזינאז, בעיקר חומצות בנזואיות והנגזרות שלהן, משמשים כסוכנים נוגדי-השחמה. בנוסף, תהליכי הגנת המארח, החלמת פצעים, התנשלות וסקלרוטיזציה אצל חרקים שהושפעו על ידי מעכבים, נשקלו כמטרה חלופית להדברת חרקים.

נעשו מאמצים רבים למציאת מעכבי טירוזינאז יעילים ומעשיים, ודווח על מספר רב של מעכבי טירוזינאז טבעיים וסינתטיים. במחקרים הקודמים, מספר מעכבי טירוזינאז, מספר נגזרות בנזלדהיד, נגזרות חומצה בנזואית, ו-0-דיפנולים נמצאו כבעלי השפעות מעכבות קלות עד משמעותיות על טירוזינאז פטריות. בנוסף, המחקרים הקודמים חשפו כי פניל-תיאואוריאה ואלקיל-תיאואוריאה יכולים למתן פעילות טירוזינאז. לאחרונה, נגזרות של תיאוסמיקרבזון בנזלדהיד נמצאו כמעכבות טירוזינאז יעילות.

במחקר זה, ביצענו סינתזה של שני סוגים של נגזרות תיאוסמיקרבזון: DABT ו-DABPT. מצאנו כי שתיהן מסוגלות לשמש כמעכבות טירוזינאז יעילות והפיכות. מטרת מאמר זה היא, לפיכך, לבצע מחקר קינטי של עיכוב האנזים. המחקר הקינטי האנטי-טירוזינאזי יאפשר הבנה מוצלחת יותר של המנגנון המעכב של נגזרות התיאוסמיקרבזון וישמש כבסיס לתכנון עתידי של מעכבי טירוזינאז.

תוצאות

השפעות ה-DABT ו-DABPT על פעילות המונופנולאז של טירוזינאז הפטרייה. ההשפעות המעכבות של ריכוזים שונים של DABT ו-DABPT על החמצון של L-Tyr באמצעות האנזים נחקרו. מעקומת ההתקדמות של חמצון ה- L-Tyr ללא מעכבים, נצפתה תקופת השהיה ברורה, שהיא מאפיין של פעילות מונופנולאז (עקומה 0 באיור 2a). המערכת הגיעה לקצב קבוע (קצב ה-steady-state) לאחר תקופת ההשהיה, שנאמדה באמצעות עקומת אקסטרפולציה לאבסיסה. עם עליית ריכוזי המעכבים, המסלול הקינטי של חמצון ה-L-Tyr הוצג באיור 2a, עקומות 1-6, וכפי שניתן לראות באיורים 2b ו-c, זמן ההשהיה התארך ככל שריכוז המעכבים עלה, וקצב ה-steady-state הופחת באופן מובהק ותלוי-מינון. ההשפעות המעכבות של DABPT על חמצון ה-L-Tyr פעלו באופן דומה. הריכוז שהוביל לאובדן של 50% בפעילות אנזימים (IC50) נקבע כ-1.54 µM ו-1.78 µM, בהתאמה.

השפעות ה-DABT ו-DABPT על פעילות הדיפנולאז של טירוזינאז הפטרייה. ההשפעה של DABT ו-DABPT על פעילות טירוזינאז הפטרייה עבור החמצון של L-DOPA נאמדה גם היא. כאשר פעילות הדיפנולאז של הטירוזינאז נבדקה באמצעות L-DOPA כסובסטרט, מסלול התגובה הגיע לקצב steady-state באופן מיידי. שתי התרכובות מסוגלות לעכב את פעילות הדיפנולאז של הטירוזינאז באופן תלוי-מינון. כאשר ריכוז המעכבים עלה, פעילות האנזימים הנותרת פחתה באופן מעריכי. ריכוז המעכבים שהוביל לאובדן פעילות של 50% (IC50) נאמד כ-2.02 µM ו-0.80 µM, בהתאמה.

המנגנון המעכב של DABT ו-DABPT על פעילות הדיפנולאז של טירוזינאז הפטרייה נמצא כהפיך. המנגנון המעכב את טירוזינאז הפטרייה על ידי DABT ו-DABPT עבור החמצון של L-DOPA נבחן גם הוא. שני המעכבים פעלו באותו אופן. איור 3 מדגים את יחסי הגומלין בין פעילות האנזימים והריכוז שלהם בנוכחות DABT. ההתקדמות של פעילות האנזימים הנותרת מול ריכוז האנזימים בריכוזי מעכבים שונים הפיקה משפחה של קווים ישרים, שכולם עברו דרך המקור. ריכוז גבוה יותר של מעכבים הוביל לירידה בשיפוע הקו, דבר המלמד כי נוכחות המעכב רק עיכבה את פעילות האנזימים ולא הפחיתה את כמות האנזימים. שתי התרכובות נמצאו כמעכבות טירוזינאז הפיכות.

סוג העיכוב של DABT על פעילות הדיפנולאז של טירוזינאז הפטרייה היה מסוג מעורב. תחת התנאים שהוצגו במחקר זה, תגובת החמצון של L-DOPA על ידי טירוזינאז הפטרייה פעלה לפי קינטיקת מיכאליס-מנטן.  איור 4 מראה את סוג המעכב של DABT על פעילות הדיפנולאז של טירוזינאז הפטרייה. מתווי לינוויבר-בורק הדדיים כפולים הניבו קבוצה של קווים שנעצרו ברבע השני, עובדה המצביעה על כך ש-DABT הינו מעכב מעורב. קבוע שיווי-המשקל עבור קשירת מעכבים עם האנזימים החופשיים וקומפלקס סובסטרט האנזימים, Ki ו-Kis, נלקחו מהמתווה השני (איור 4b ו-c), והערכים שלהם היו 1.77 µM ו-6.49 µM.

סוג המעכב של DABPT על פעילות הדיפנולאז של טירוזינאז הפטרייה היה בלתי-תחרותי. באופן מנוגד, DABPT הינו מעכב בלתי-תחרותי, מכיוון שהמתווה של 1/v מול 1/[s] הניב משפחה של קווים ישרים עם שיפועים שונים שחצו זה את זה בציר X (איור 5a). קבועי שיווי המשקל Ki  ו-Kis נאמדו כ-0.77 µM ו-0.77 µM. קבועי המעכבים סוכמו בטבלה 1, לשם ההשוואה.

דיון

טירוזינאז מסווג כחלק ממשפחת חלבוני הנחושת מסוג 3, המערבים מרכז תגובה נחושתי דו-גרעיני. כל יון נחושת עובר ליגציה על ידי שלושה אימידזולי היסטידין, המחזיקים חמצן מולקולרי בצורת קשירת side-on בכדי לאפשר קומפלקס דו-נחושתי (µ-ƞ2:ƞ2-peroxo) בתור מין החמצן-הפעיל המשותף. מרכז דו-נחושתי כזה ממלא תפקיד חיוני בפעילות המונופנולאז והדיפנולאז של הטירוזינאז, ושינוי קל שלו עשוי להוביל לאובדן פעילות. מן הצד השני, DABT ו-DABPT הם בסיסי שיף המתאפיינים בזיקה משמעותית ליוני נחושת. באופן זה, כאשר מערבבים טירוזינאז עם הסובסטרט שלו, DABT ו-DABPT יכולים ליצור קומפלקס עם מולקולות הטירוזינאז באמצעות אטום הגופרית ואטום החנקן דרך קשירת מימן וקשירה מתואמת. קומפלקס הדוק זה יכול לגרום למולקולת החמצן החופשית להפחית את יכולת התגובה שלה ואפילו להפסיק את השתתפותה בהידרוקסילציה עם המונופנולים, ובחמצון עם ה-0-דיפנולים. בשל כך, הטירוזינאז יאבד את יכולת הזירוז שלו.

במחקר זה, הקינטיקה המעכבת של DABT ו-DABPT על פעילות הדיפנולאז והמונופנולאז של הטירוזינאז נחקרה לראשונה. התוצאות מראות כי DABT ו-DABPT יכולים לעכב גם את פעילות הדיפנולאז וגם את פעילות המונופנולאז של טירוזינאז הפטרייה. בנוגע לפעילות הדיפנולאז, העיכוב היה הפיך, וסוגי המעכבים נקבעו כעירוב של סוגים תחרותיים ובלתי-תחרותיים, וכבלתי-תחרותיים, בהתאמה. כפי שניתן לראות בטבלה 1, ערכי ה-IC50 של DABT ו-DABPT עבור פעילות הדיפנולאז היו 2.01 µM ו-0.80 µM, בהתאמה. המחקר הקינטי מראה כי הערך של Ki של DABPT הוא קטן פי 2.3 מזה של DABT, מה שמלמד כי זיקת ההתקשרות שלו לאנזימים חופשיים היא גבוהה יותר. באופן דומה, DABPT מראה זיקת התקשרות גבוהה יותר לקומפלקס אנזים-סובסטרט. בנוגע לפעילות מונופנולאז, שתי התרכובות מסוגלות לעכב באופן דרסטי את פעילות ה-steady-state, אך האריכו במקצת את תקופת ההשהיה. בהשוואה לסוכני האנטי-טירוזינאז הנפוצים ביותר, ארבוטין (IC50 = 30 mM) וחומצה קוג’ית (IC50 = 23 µM), פוטנציאל העיכוב של DABT ו-DABPT הוא חזק בהרבה, מה שמלמד כי נגזרות תיאוסמיקרבזון יכולות לשמש כבסיס מוצלח יותר לתכנון מעכבי טירוזינאז.