Proteomic Analysis of Non-depleted Serum Proteins from Bottlenose Dolphins Uncovers a High Vanin-1 Phenotype

ניתוח חלבונים לא מדוללים מדולפינים חושף ריכוז גבוה של פנוטיפ Vanin-1

גישות ממוקדות נמצאות בשימוש נרחב על מנת לעזור להסביר הסתגלויות פיזיולוגיות, אך מעטים המחקרים שעושים שימוש בגישות לא ממוקדות בחקר אומיקס על מנת לחקור את ההבדלים בין יונקים ימיים ליבשתיים. השוואת דרגות בין חלבונים לא מדוללים מהדולפינים (Tursiops truncatus) לבין התרכיב האנושי, הובילה לגילוי של 11 חלבונים בלעדיים לתרכיב של הדולפינים. בהשוואה לפרוטאום בפלסמה האנושית, ל-5 מתוך 11 חלבונים הייתה דרגה דיפרנציאלית הגדולה מ-200. אחד מהחלבונים, Vanin-1 כומת באמצעות ניטור תגובות מקבילות בדולפינים שטופלו על ידי בני אדם ובדולפינים חופשיים. ריכוז Vanin-1 נע בין 31-109 μg/ml, אשר גבוה פי 20-1000 מהריכוז בבן-אדם בריא. ריכוז Vanin-1 היה גבוה בדולפינים שטופלו על ידי בני אדם לעומת דולפינים חופשיים (64±16 vs. 47±12μg/ml P<0.05). רמות Vanin-1 מתואמות באופן חיובי לאנזימי הכבד AST ו-ALT, ומתואמות באופן שלילי לרמות תאי הדם הלבנים וחלבון הפיברין בדולפינים חופשיים. נמצאו הבדלים משמעותיים בין פרוטאום מחזור הדם של הדולפינים לעומת יונקים יבשתיים וחקירת ההבדלים בין הדולפינים לבין יונקים ימיים אחרים, עשויה לעזור בפיתוח אסטרטגיות לטיפול בלחץ פזיולוגי.

ביונקים, הסתגלויות אבולוציוניות אפשרו אסטרטגיות שונות להישרדות ובכך, אפשרו למינים רבים לנצל מגוון רחב של סביבות מחיה. רבות מאסטרטגיות אלו נחשבות למזיקות בגבולות הפיזיולוגיה האנושית ועולות בקנה אחד עם פגיעות משמעותיות באיברי גוף האדם. ישנו דמיון ביונקים ימיים באופן זה בכך שחלקם פיתחו התאמות פיזיולוגיות ומורפולוגיות המאפשרות צלילות רבות, התקפי היפוקסיה, גישה מוגבלת למים חופשיים ותקופות צום ארוכות. מחקרים השוואתיים הוכיחו כי צלילה מובילה לנטל חמצני על המינים. ככל הנראה עקב התכווצויות כלי הדם והזרמת דם מוגברת לאיברים הזקוקים לו. בתגובה לכך, קיים הצורך להתנגד למתח החמצני וזה משתקף בהעלאת פעילות אנזימים נוגדי חמצון ברקמות ( glutathione disulfide reductase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase) ובתאי הדם האדומים (glutathione reductase, glutathione peroxidase, superoxide dismutase and catalase). התאמות ביוכימיות לתופעת ההיפוקסיה כוללות תוכן הימוגלוביני גבוה בשרירים, הגנה כימית על גלובינים עצביים, עליה בריכוז תאי הדם האדומים במחזור הדם ועליה בריכוז ההמוגלובין פר יחידה. בנוסף, לדולפין וללווייתן קטלן (Orcinus orca) ישנם גורמי קרישה VII ו-X נמוכים במחזור הדם, והיעדר מוחלט של חלבון הגמן (XII) העשוי למנוע קרישי דם בכלי הדם במהלך אירוע של היצרות כלי הדם.

ביונקים ימיים, לתאי הדם האדומים ולרקמות יש דרישה גבוה לגלוקוז העשויה לגרום ליצור מוגבר של גלוקוז או לחילוף מוגבר בתקופות ארוכות של צום במינים מסוימים. לדולפינים בצום קיים ריכוז גבוה יותר של גלוקוז בהשוואה לסוסים או פרות, ורמות פלסמה מעט יותר גבוהות מדולפינים שבעים, אשר מרמזות על מצב “דמוי-סוכרת” טבעי, שעשוי להיות מועיל בתקופות קצרות של צום. היפרגליקמיה (יתר סוכר בדם) ועמידות לאינסולין הנגרמים כתוצאה מצום לטווח ארוך, הינם סימני ההיכר של פיל הים הצפוני בצום. עניין זה מעיד על ספיגת גלוקוז שאיננה תלויה באינסולין. מכך עולה כי הויסות ההורמונלי של מטבוליזם הגלוקוז שונה משמעותית משל יונקים יבשתיים.

מחקרים רבים בעלי גילויים תובנתיים אודות הבריאות והפיזיולוגיה של יונקים ימיים התמקדו בהעברת חמצן, נוגדי חמצון, חלבונים מטבוליים וקליניים הרלוונטיים למעבדה המצויים בדם. עם זאת, מחקרים השוואתיים המתארים את תרכיב החלבונים במחזור הדם של היונקים הימיים לא נחקרו בהרחבה עבור תרכיב חדש המעיד על תכונות חדשות שעשויות לבסס מנגנוני הגנה או רגולציית מטבולזים חלופיים משמעותיים. כדי להרחיב את הגילוי של פנוטיפ בתרכיב החלבוני, העשוי לקדם את היכולת של יונקים ימיים למנוע מתחים, יצרנו רשימת מדרגות המכילה גורמי שפע ספקטרליים מנורמלים מתרכיבי חלבון של דולפינים לצד תרכיבי בני אנוש וחזירים. החלבונים דורגו ואחד החלבונים הבולטים, Vanin-1, נבחר על מנת לאמת את הפרשי הדירוג. נלקחו מדידות של רמות Vanin-1 מדולפינים תחת טיפול אנושי ודולפינים חופשיים ובוצעה קורלציה עם ערכי דם קליניים שנלקחו במעבדה.

איור 1: היסטוגרמה של ההבדלים בין דרגת חלבון ממוצע לבין חלבונים בתרכיב הדולפין וחלבונים בתרכיב אנושי. הערך המוחלט של ההבדלים נמדד בסולמות של 10. התיבה המקווקות מציינת 11 חלבונים בתרכיב שלא נמצאו במערך הנתונים בתרכיב האנושי. נתוני השוואה נוספים וזהויות נוספות מפורטים בטבלה 1.

תוצאות

השוואות דרגת תרכיב: דולפינים לעומת חזירים ובני אדם

 ניתוח תמצית חלבון tryptic זיהה 58 חלבונים בתרכיב הדולפין, 92 בבני אדם ו-77 בחזירים (טבלה 1). albumin היה החלבון הגבוה ביותר בכל קבוצה. השתמשנו במונחים כדי לתאר את ריכוז החלבונים כגבוהים, בינוניים או נמוכים בהתבסס על תיאורים קודמים של חלבונים בדם, שבו גבוה מתייחס לריכוז 50,000–1mg/L, בינוני מתייחס לריכוז ,1–0.5 mg/L ונמוך מתייחס לריכוז הקטן מ- 0.5 mg/L. חלבונים סווגו על בסיס ריכוז חלבון בפלסמה האנושית. השימוש במונח ריכוז גבוה, על מנת לתאר תרכיבי חלבונים בדולפינים, מבוסס על העובדה כי החלבונים זוהו מפפטיד טרפסין מנסיוב שלא היה מרוקן מחלבונים עיקריים. יתר על כן, פפטידים מטרפסין לא פוצלו על ידי שיטות אורתוגונליות והחלבונים זוהו מהרצה בודדת של LC/MS/MS עם רכישת תלות בנתונים.

היו 11 תרכיבי חלבון של דולפין שלא תאמו לשום חלבון ברשימת 92 החלבונים בריכוז גבוה בתרכיב חלבון של האדם (טבלה 1). 11 החלבונים שלא תאמו מוצגים בטבלה 1. עבור החלבונים הללו בוצעה השוואה נוספת עם תרכיבי חלבון של חזיר על מנת לקבוע האם הבדלים פילוגנטיים בתרכיבי החלבון יכולים להסביר בפשטות את ההבדל שנמצא בין חלבוני הדולפין והאדם. שלושה מתוך 11 החלבונים שנחשבו יחודיים לדולפינים נמצאו בתרכיב החלבוני של החזיר. החלבונים Fetuin B, Extracellular Matrix protein 1 ו- Glycosylphosphatidylinositol phospholipase D1 נמצאו בתרכיב החלבונים של החזיר. 11 החלבונים החריגים בדולפין הושוו גם לחלבוני הפלסמה האנושית על מנת לספק הפניה נוספת לשפע המוערך בפרוטאום של היונק. על אף שרשת הבטא פיברינוגן וחלבוני שרשרת הגמא לא התגלו בסקר הראשוני של תרכיב החלבונים באדם, שרשראות פיברינוגן דולפין (דרגה: 44 ± 19 ו – 47 ± 17, בהתאמה) היו מדורגות ליד החלק העליון של פרוטאום הפלסמה האנושית (דרגה 18 ו – 21). בדומה לשרשראות פיברינוגן, גם glutathione peroxidase 3 בדולפין נמצא בריכוז חריג בהשוואה לבדיקה הראשונית של תרכיב החלבון באדם ובחזיר. לעומת זאת, בהשוואה לפרוטאום בפלזמה האנושית, החלבון glutathione peroxidase 3 שונה במקצת במונחים של דרגה (27 ± 4 בדולפין לעומת 69 בבני אדם). חמשת החלבונים שנותרו מתוך 11 בתרכיב הדולפין, אשר לא נצפו בבדיקה הראשונית של פרוטאום האדם והחזיר הם: אדיפונקטין, Vanin-1, קולטן של אימונוגלובולינים פולימריים, קרום פלזמה של תא שומן וגידולים ממאירים במוח. מתוך חמשת אלה רק

קרום פלזמה של תא שומן לא זוהה בכל דולפין לפחות פעם אחת (טבלה 1).

טבלה 1: דירוגים ממוצעים של 11 חלבונים בתרכיב הדולפין אשר לא נוכחים בתוצאות התרכיב האנושי. דירוג החלבון עבור חלבונים אורתולוגיים אשר לא הוצאו מהתרכיב החלבוני של החזיר ומהפלסמה החלבונית האנושית אשר מאופיינת היטב, יחד עם ריכוזים משוערים שסופקו.

MW = משקל מולקולרי מנובא בקילודלטונים. מקף אופקי מציין כי לא זוהה שום חלבון. “לא” בעמודה הרביעית מרמז כי לא זוהו חלבונים באופן קבוע עבור כל דולפין בכל נקודת זמן במחקר של 24 שבועות.

טבלה 2: המתאם של פירסון מראה על קורולציה בין נתוני דם קליניים בדם ותרכיב Vanin-1. השערות משמעותיות התקבלו במידה וP <0.05. לא נמצאו קשרים בין ערכי Vanin-1 לבין ערכי הדם.

ניתוח העשרה

מתוך 11 החלבונים בטבלה 1, 7 חלבונים היו נפוצים באונטולוגיה של הגנים בקטגוריות של הליך ביולוגי: בתגובה ללחץ ובתגובה לגירויים כימיים (טבלה מס’ 3).

קטגוריה שלישית, ויסות של מערכת החיסון, הכילה 6 חלבונים מתוך 11. כל החלבונים סווגו כמרכיב תאי: אקסוזום תאים. עדות לביטוי ספציפי לתא של חלבונים אנושיים חשפה 9 מתוך 11 חלבונים המבוטאים באדיפוציטים (תאי שומן) (טבלה מס’ 4). חלבונים מסוג Vanin-1 ומטריקס תאים לא נכללו בניתוח העשרה שנעשה על התאים.

מדידות התרכיב Vanin-1

ניתוח Vanin-1 פותח עם גבול מחושב של זיהוי של 2.5 μg/ml ​​וגבול נמוך מחושב של כימות בגודל של  4.5 μg/ml. השכיחות הגבוהה ביותר בטווח הבינוני הייתה 2.5% RSD.

20 דגימות של דולפינים (10 שקיבלו טיפול אנושי ו10 חופשיים) אשר התאימו לחלוטין בגיל ובמין בהשוואה לקבוצת המחקר שפורסמה בעבר. נתוני המעבדה הקלינית עבור 10 דולפינים אשר קיבלו טיפול אנושי (בטווח הגילאים 4-29 שנים) ו-10 דולפינים חופשיים (בטווח גילאים 2-28 שנים) מפורטים בטבלה 2. ריכוז התרכיב Vanin-1 בדולפינים אשר קיבלו טיפול אנושי נע בין 47.2-106.4 μ g/ml, עם ריכוז ממוצע של 64.1 ± 16.3 μ g/ml. ריכוז התרכיב Vanin-1 בדולפינים החופשיים נע בין 31.0-70.5 μ g/ml, יחד עם ריכוז ממוצע של 46.9 ± 11.7 μ g/ml. ריכוז התרכיב Vanin-1 הממוצע היה נמוך משמעותית בדולפינים חופשיים לעומת דולפינים אשר קיבלו טיפול אנושי (איור 2, T-Test, P <0.05). לא נמצא הבדל מובהק בין רמות Vanin-1 בזכרים לעומת הנקבות שטופלו על ידי בני אדם בדומה לדולפינים החופשיים (P> 0.3).

ההתאמה בין ערכי המעבדה הקליניים השגרתיים לבין ריכוזו של חלבון ה- Vanin-1, נקבעו עבור אוכלוסיות שקיבלו טיפול אנושי ואוכלוסיות החופשיות בנפרד. ערכי המעבדה הקלינית (בטבלה מס’ 2) עקביים עם קבוצת המחקר שפורסמה בעבר, שבה הדולפינים אשר קיבלו טיפול אנושי היו בעלי תוצאות WBCs נמוכות יותר, ותוצאות טריגליצרידים גבוהות יותר, הכולסטרול, הGGT וחומצת השתן בהשוואה לדולפינים חופשיים. בניגוד לקבוצת המחקר שפורסמה בעבר, בתת-קבוצה זו לא היה הבדל בתוצאות ה-ALT או בתוצאת הברזל הכולל, הסבירות גבוהה לכך ונובעת מכך שגודל המדגם קטן יותר. רמות ה- Vanin-1לא היו מתואמות עם שום תוצאת מעבדה בקבוצת הדולפינים אשר קיבלו טיפול אנושי.

עם זאת, ה-Vanin-1 נמצא בהתאמה חיובית עם אנזימי הכבד AST (0.64 = ρ) ו-ALT (0.64= ρ) ובהתאמה שלילית עם WBC (0.68-= ρ) ועם פיברינוגן (ρ =- 0.70) בקבוצת הדולפינים החופשיים (טבלה 2). לא הייתה שום התאמה עם פרמטר הגיל (טבלה 2, p>0.2).

איור 2: ריכוז Vanin-1 בתרכיב של הדולפינים שטופלו על ידי בני אדם ובדולפינים החופשיים. מרמז על P <0.05 לעומת הדולפינים שקיבלו טיפול אנושי. העמודות מייצגות את הממוצע הריכוז של תרכיב Vanin-1. עמודות השגיאה מצביעות על קיומה של סטיית תקן.

דיון

מספר לא מבוטל של מחקרים על חלבונים התמקדו באפיון והשוואה של החלבונים בנוזלי הגוף של בני אדם או של חיות מעבדה, כמו כן, נעשתה קביעה של אסטרטגיות הדלול לחקר החלבונים בריכוז נמוך. מאחר שזיהוי החלבונים נעשה על ידי ספקטרומטר מסה בעל קשר הדוק לזמינות הגנום הספציפי, מחקרים מעטים חקרו את ההבדלים בחלבונים בנוזלי הגוף בין המינים השונים אשר ניתנים להשוואה לבדיקות הבדלי חלבונים בתנאי ניסוי במינים שונים. יתר על כן, ההבדלים ברמות ה-פפטיד באנשים, לעיתים קרובות, לא נתפסים בתוך הגנום והשוואות החלבונים יכולה להיות מושפעת מהמגוון הרחב של מסד נתוני החלבונים שבשימוש. במקרה של יונקים ימיים, מחקרים גנומיים, טרנסריפטומיים (transcriptomic) וחלבוניים, נבלמים על ידי הגבלה זו, וכתוצאה מכך, נוצרים ניתוחים השוואתיים עם תוצאות לא מלאות, אשר היו יכולים לחשוף מאפיינים ייחודיים המונחים ביסוד של פיזיולוגיה ייחודית. עבור דולפינים, נתוני רצף לא מלאים או לא קיימים מהווים מכשול לזיהוי החלבונים. במחקר זה, הנוגדנים (immunoglobulins) ברורים פחות או חוזו בגנום הדולפין, ולמרות שהם מהווים מרכיב מרכזי של חלבונים בתרכיב, לא היה ניתן לכלול אותם בהשוואה בין חלבוני האדם והחזיר. למרות מסדי הנתונים הביולוגיים הלא מלאים, המידע הזמין יכול להיות שימושי עבור זיהוי תכונות יוצאות דופן של החלבונים בין המינים השונים כפי שמוצג במחקר זה.

כדי לקדם את המחקר של החלבונים בתרכיב אצל יונקים ימיים, סקרנו את החלבונים בתרכיב של הדולפינים והפקנו תועלת מהדירוגים בכדי לחקור חלבונים חריגים פוטנציאליים בהשוואה לחלבונים של בני האדם שטרם התגלו.

ניתוח זה גילה 11 חלבונים שזוהו בדולפין בלבד (טבלה 1). למרות שהחלבונים בתרכיב הדולפין לא התגלו במדגם האנושי הרגיל, כל 11 החלבונים נצפו בחלבוני הפלסמה של האדם.

ניתוח העשרה של הדמיון בין האדם לדולפין ביחס ל-11 החלבונים שהתגלו, הביא לסיווג תהליך ביולוגי אונטולוגי ברמה בסיסית בלבד ללא קשר משמעותי אשר מצביע על חוסר אינטראקציה ביולוגית ידועה בין החלבונים בתרכיב. מבין המאפיינים המשותפים, כל 11 החלבונים סווגו ברמה נמוכה יותר כאקסזום תאים, וזה סביר בהתחשב בכך שרוב החלבונים בתרכיב מופרשים לתוך הדם. אטלס הסיווג של חלבון האדם לסוגי תאים, מראה כי 9 מתוך 11 החלבונים באו לידי ביטוי באדיפוציטים (תאי השומן). בהתחשב בכך שלדולפינים יש שכבת שומן. מעניין לשער שהבדלי החלבון בתרכיב ביחס לבני אדם ולחזירים עשויים להיות מושפעים ממאפיין אנטומי זה.

מאחר שחלבוני Vanin-1 ומטריקס התאים לא נכללו בסיווג תאי השומן של האדם, מוקדם מדי להסיק מסקנות כלשהן ללא ראיות לביטוי ספציפי בתאי הדולפינים.

כדי להסביר את ההבדלים הנובעים מתולדות הגזע, ההשוואות נעשו גם על תרכיב החלבונים הלא מכולה של החזיר, כיוון שהחזיר הוא מין יבשתי בעל אב קדמון משותף עם הדולפין. מתוך חלבוני הדולפין ,זוהו 11 חלבונים חריגים (איור 1), שלושה מהחלבונים האלו הם: Fetuin B, חלבון מטריקס, וGlycosylphosphatidylinositol phospholipase D1, זוהו בתרכיב לא מכולה של החזיר ויכולים היו לייצג חלבונים אשר בדרך כלל נמצאים בריכוז גבוה ושייכים למשפחת מכפילי הפרסה. הכללתם של שני חלבונים בשרשרת פיברינוגן בדירוג החלבון בתרכיב (טבלה 1) מפוקפקת וכנראה משקפת על הבדלים בהכנת המדגם של התרכיב, וזאת משום שטווחי ייחוס הפיברינוגן בדולפינים שקיבלו טיפול אנושי הם בטווחי תקינים עבור יונקים אחרים. מבין 6 חלבוני הדולפין הנותרים, שלא היו משותפים במערכי הנתונים של חלבוני בני אדם או של החזיר, 5 מחלבונים אלו היו בעלי רמות גבוהות בדירוג מוחלט (גדול יותר מ-200) בהשוואה לחלבוני הפלסמה האנושית, ונראה כי הם ייחודיים בחלבונים בתרכיב של הדולפינים, החלבונים:Adiponectin, Vanin-1, Deleted in malignant brain tumors 1, Polymeric immunoglobulin receptor, ו  Adipocyte plasma membrane protein. למרות ש Glutathione peroxidase 3 לא זוהה במערכי הנתונים של חלבוני האדם או של החזיר, הוא נכנס להשוואה לרשימה כללית יותר של הפלסמה האנושית, ההבדל בדרגת ה Glutathione peroxidase 3 לא נכלל בקבוצת ההבדלים הבולטים ביותר.

דירוג החלבון, המבוסס על גורם השפע הספקטראלי המנורמל, מספק הערכה טובה על החלבון, אך הוא עדיין רגיש להפרעות כגון השפעות מטריציאליות העלולות להשפיע על אומדני החלבון.

מבחני ניטור התגובה הממוקדים, כגון ניטור התגובה במקביל, הכוללים את תקני הפפטיד המסומנים באיזוטופ, יכולים לסייע בהפחתת השונות עקב מכשור או גילוי שווא של פפטיד, והם מספקים הערכה טובה יותר של ריכוז החלבון. ניטור התגובה המקבילה נוצל בעבר בכדי למדוד 1 מתוך 11 החלבונים, adiponectin, מטבלה 1. ריכוזי adiponectin בתרכיב הדולפין (אשר קיבל טיפול אנושי) נמדדו על ידי ניטור התגובה בטווח בין 2.3-47.9 μg/ml. ריכוז adiponectin, אשר נמדד על ידי ניטור התגובה בבני אדם, נע בין 0.02 μg/ml ל-3 μg/ml. ההבדלים המוחלטים האלה בריכוזי adiponectin בין הדולפין לבני האדם, תואמים את הקשר בין הדולפינים לבני האדם (טבלה 1).

כדי לאמת את ההבדלים בכרומוזום ההומולוגי בריכוז נמוך בבני אדם ובריכוז גבוה בדולפינים, תרכיב Vanin-1 נמדד באמצעות ניטור תגובה במקביל, בדולפינים משתי אוכלוסיות שונות.

התרכיב מדולפינים חופשיים ומדולפינים אשר קיבלו טיפול אנושי, התקבל ממחקר שפורסם קודם לכן, אשר נערך בכדי לאפיין הבדלים בין פנוטיפ מטבולי בין שתי האוכלוסיות. ריכוז התרכיב Vanin-1 בכל הדולפינים היה גבוה באופן עקבי, ללא קשר לאוכלוסייה שאליה השתייך הבעל חיים (איור 2), מעיד על כך שהריכוז הגבוה של Vanin-1 הינו תכונה נפוצה בקרב הדולפינים ואינו נגרם כתוצאה משגיאה בניהול המחקר. בדומה ל adiponectin, ריכוז Vanin-1 בדולפינים היה עקבי ביחס לדירוג שבין בני אדם לדולפינים (טבלה 1). ריכוז התרכיב בקבוצה של חולים הזקוקים להשתלת כליה מציע כי ריכוז Vanin-1 הוא מאוד נמוך לפני הניתוח (1.9ng/ml) ולאחר הניתוח  (3.7ng/ml)נמדדו על ידי ELISA. ריכוזים גבוהים באופן משמעותי (~20–200ng/mg protein or ~1.7–17.7μg/ml) נמדדו על ידי ELISA מאותו היצרן במחקר הכלל מתנדבים רגילים וחולים בתרומבוציטופניה חיסונית ראשית. למרות הערכת המשתנים האלו בבני אדם רגילים, רמות Vanin-1 בדולפינים גבוהות פי- 20-1000 מאשר בבני אדם. מכיוון שמדידות התרכיב מיצרן ה-ELISA לא התאימו לאנליזת החלבון שבוצעה, ביצענו סריקת יון ממוקדת בפפטיד Vanin-1 באדם ההומולוגי אשר עזרה למדוד Vanin-1 בדולפין במחקר זה. לא נמצא אות עבור פפטיד Vanin-1 במגוון האנושי הנורמלי שנבדק (לא מציגים מידע בנושא) מה שמעיד על ריכוז אנושי נמוך מאוד של Vanin-1 וכנראה נמצאים בטווח של ng/ml.

Vanin-1 הינו GPI הקשור לקרום מסוג pantetheinase הבא לידי ביטוי באופן נרחב, אבל בעיקר בכבד, במעי הדק ובכליות בבני אדם. בדומה לחלבוני GPI קשורים אחרים, אנו חוזים ש-Vanin-1 יכול להימתח על ידי glycosylphosphoinositol phospholipases ולהשתחרר למחזור הדם. באופן מעניין glycosylphosphoinositol phospholipases הינו אחד מתוך 11 החלבונים בטבלה 1 שנמצאו בריכוז גבוה ביחס לבני אדם. מכיוון שחלבון זה זוהה גם בדגימת תרכיב החזירים, ייתכן שהריכוז הגבוה של Vanin-1 שנמצא בדולפין, נגרם כתוצאה מריכוז גבוה של glycosylphosphoinositol phospholipases או שילוב של הימצאות החלבון ופעילותו. תוצר הגן של Vanin-1 מזרז את ההמרה של pantetheine ל- סיסטמין ו- pantothenate (ויטמין B5). כאשר B5 ממוחזר למרכיביו (acetyl-coenzyme A), התיול (Thiol) שמופק מתהליך זה, סיסטמין משך תשומת לב רבה עקב מאפייני החמצון ואנטי-חמצון הפוטנציאליות שלו. היסטורית המחקר של Vanin-1 וסיסטמין מציג תמונה ביולוגית מורכבת מאוד עם מסקנות מנוגדות רבות. הוספת סיסטמין בריכוז נמוך לתאי הדם הלבנים מקדם פגיעת H2O2 ב-DNA. כאשר הוא בריכוז גבוה, הסיסטמין מונע פגיעה מסוג זה. מחקרים מוקדמים של סיסטמין התמקדו בעיקר בתוצר זה כתיול (Thiol) במנגנון לתיווך יצירת H2O2 אשר קידם את רעילות התא. מה שעוד קידם את הרעיון  שסיסטמין הינו תיול מזיק, הוא ש- Vanin-1 הימם עכברים בעלי מחסור מדיד ברקמות, סיסטמין הציג עצמו כפנוטיפ מגן כאשר הפעילו נגדו קרינת גמא או paraquat. יתר על כן, מודלי מכרסמים פופלריים פיתחו כיבים דרך הסיסטמין. מצד שני, Vanin-1 מקנה פנוטיפ מגן לתאי בטא בלבלב, לכבד בעל פגיעה כימית ולתאי דם אדומים בעוד שנראה שמתן סיסטמין מפחיתה את הפיברוזה בכליה, ציסטינוזיס בכליה ומחלות ניווניות.

על אף שזה ספקולטיבי, עליה בריכוז Vanin-1 בדולפין עלולה להוביל לשיפור בפעילות גלוטתיון פרוקסידאז עצמאית בסלניום (Selenium-independent glutathione peroxidase activity). בעכברים המעולפים, כתוצאה מריכוז Vanin-1, פעילות גלוטתיון פרוקסידאז עצמאית בסלניום בכבד ירדה לחצי מהפעילות הידועה בעכברים חופשיים, ומתן הסיסטמין, שחזר את הפעילות לרמתם של העכברים החופשיים. פעילות גלוטתיון פרוקסידאז עצמאית בסלניום עולה ברקמות ובפלזמה של היונקים ימיים והם מיוחסים למנגנון הגנה מפני נזקים שעלולים להתרחש כתוצאה מצלילות. בצורה מעניינת, גלוטתיון peroxidase 3 הינו אחד מהחלבונים השונים באופן ניכר בטבלה 1, אך מכיוון שהוא selenium-dependent glutathione peroxidase הקשר בינו לבין Vanin-1 וסיסטמין לא נתמך. מכיוון שחסר מחקר אודות selenium-dependent glutathione peroxidase ביונקים ימיים לא ניתן לקבוע קשר בין זה לבין Vanin-1 ולכן, שאלה זו נותרה לא פתורה, שייתכן ותוכל להסביר את הריכוז הגבוה בנוגדי חמצון בפלסמת היונקים הימיים. לחלופין, מכיוון שסיסטמין בריכוז גבוה מגן רק על תאים תחת לחץ חמצני גבוה, מעניין לשער שרמות גבוהות של Vanin-1 התפתחו כתגובת נגד ללחץ חמצני עקב איסכמיה (אנמיה חלקית) או זרימת דם לאיברים ספציפיים (reperfusion) עקב צלילות.

בנוסף לגילויים במחקרים שלדולפינים ישנן רמות גבוהות של Vanin-1, לא ציפינו שלדולפינים אשר טופלו על ידי בני אדם יהיו רמות גבוהות יותר של Vanin-1 (איור 1). מכיוון שריכוז Vanin-1 נוטה לעלות כתוצאה מצום, הריכוז הגבוה בדולפינים שטופלו על ידי בני אדם, נראה לא צפוי, וזאת מכיוון שהדגימות נלקחו לאחר האכלה ובנוסף, באמצעות אולטראסאונד היה ניתן לוודא שכל הדולפינים אכן אכלו. לדולפינים החופשיים לא בוצעה בדיקת תכולת בטן, אך ידוע שדולפינים אלה אוכלים בעצמם במהלך היום. ייתכן שלדולפינים שטופלו על ידי בני האדם, היו רמות גבוהות של Vanin-1 עקב צום שנעשה במהלך הלילה שקדם להאכלה שנעשתה בבוקר. לחלופין, הרמות הגבוהות של Vanin-1 בדולפינים המטופלים עשויות להסביר מדוע לאוכלוסיה זו רמות גבוהות יותר של גלוקוז, אינסולין, טריגליצרידים והיארעות של סטאטוזיס בכבד בהשוואה לאוכלוסיה החופשית. ביטוי יתר של Vanin-1 מוביל לגלוקונאוגנזה בכבד, עליה ברמת הגלוקוז בדם ועמידות לאינסולין בעכברי C57BL/6 בנוסף, ירידה ברמת Vanin-1 בעכברי db / db אשר להם רמת Vanin-1 גבוהה ונטו לסטיאטוזיית כבד הובילה להנחתה של סטאטוזיס הכבד. עיכוב או הורדת Vanin-1 הובילה לעלייה ברמת הטריגליצרידים בכבד של חולדות או עכברים אשר צמו ומשפרת את העמידות לגלוקוז ורגישות לאינסולין בעכברים בעלי דיאטה עשירה בשומן. מחקרים אחרונים, לעומת זאת, מצביעים על כך כי עיכוב חריף של פעילות Vanin-1 בחולדות שמנות מסוג Zucker החולים בסכרת לא שינה את דרגת הסטאטוזיס ולא השפיע על הרגישות לאינסולין או על יצירת הגלוקוז. למרות ש-Vanin-1 ממלא תפקיד בחמצון חומצות השומן, וסטייה לשני צידי הרמה הנורמלית עלולה להבוא לסטאטוזיס, התרומה של Vanin-1 לקידומו של סטאטוזיס ורגישות לאינסולין במודלים שאינם מעבדה אינה ברורה.

כדי לקבוע האם Vanin-1 מקושר לערכי המעבדה הקלינית של תפקוד הכבד, ביצענו מתאם פירסון (Pearson product) עבור שתי האוכלוסיות (טבלה 2). בשל גודל המדגם הקטן, לניתוח המתאם הייתה השפעה מעטה ויש לבחון באמצעות אוכלוסייה גדולה יותר, את כל האסוציאציות שאינן נחשבות משמעותיות. כדי לזהות מתאם מובהק (α = 0.05) צריך לכלול כ-46 דולפינים בניתוח. לכן, ניתן לזהות רק קורלציות חזקות, ויש לפרש בזהירות חוסר מתאם עם משתנים קליניים במחקר זה. באוכלוסיה החופשית, רמות ה- Vanin-1 נמצאות בקורלציה חיובית עם אנזימי הכבד ALT ו- AST, וקורלציה שלילית עם פיברינוגן אשר מסונתז בעיקר בכבד. הקשר המתון בין רמות אנזימי הכבד בסירקולציה בא להראות שרמות Vanin-1 עשויות להיות גבוהות בדולפינים חופשיים עם בעיות בתפקוד בכבד. ממצא פתולוגי שכיח בדולפינים חופשיים. עם זאת, לא נמצא קשר בין Vanin-1 לבין כל ערך כימי של דם קליני עבור אוכלוסייה אנושית שידועה בשכיחות סטיאטוז הכבד. הכללות לגבי רמות Vanin-1 וקשר קליני לבריאות דורשות מחקר מבוקר ארוך בהרבה על מנת לקבוע אם ההבדלים ברמת Vanin-1 יכולים להיות בעלי ערך בניבוי מצב בריאות הכבד בדולפינים.

לסיכום, ניתוח פרוטאומי פשוט של הדולפין חשף מספר חלבונים בריכוז גבוה יותר ביחס לבני אדם ולאב הקדמון הקרוב יותר של הדולפין – החזיר. מדידות החלבונים נתמכו בנתוני הדירוג והובילו לגילוי שרמות Vanin-1 גבוהות נמצאות באופן עקבי בדולפינים. השוואה פרוטומית בסיסית בין יונקים ימיים אחרים לבין יונקים יבשתיים יכולה לסייע בחשיפת עיבודים ביוכימיים משמעותיים להגנה על מתח ומטבוליזם ביונקים ימיים, אשר יש לשלבם במחקרים עתידיים.

שיטות

לקיחת דגימות. איסוף הדם מהדולפינים שטופלו על ידי האדם בוצע בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי הוועדה של יחידת ההגנה על היונקים הימיים בחיל הים (IACUC) וצי הלשכה הרפואית (פרוטוקול # 101-2012). איסוף הדם מדולפינים חופשיים נעשה בהתאם להנחיות ולתקנות שנקבעו על ידי Mote Marine Laboratory IACUC תחת אישור מספר 522-1785 מטעם יחידת המחקר של שירות הדיג הלאומי. איסוף דם החזיר בוצע בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המחלקה לרפואה של אוניברסיטת דרום קרוליינה IACUC תחת מספר פרוטוקול 3234.

עבור השוואות חלבונים, בתרכיב של שישה דולפינים שטופלו על ידי האדם, נאספו קודם לכן ותואר המידע בנוגע לדגימות. הדגימות נאספו ב-6 נקודות זמן (0, 3, 6, 12, 24 שבועות) במהלך מחקר האכלה. דגימות הבסיס הוצגו ביום אפס ודגימות לאחר מכן הוצגו לאחר הדיאטה שונה כדי לכלול דגים שונים. הדולפינים כללו שלוש נקבות בגילאי 12, 32 ו -52 שנים, ושלושה גברים בני 8, 35 ו -42 שנים. הדם נמשך שעתיים לאחר האכלה מה- peduncle באמצעות מחט 19 או 21 ונאסף במיכל ווקום. דם מלא הורשה להיקרש במשך 30-60 דקות ואז הופרד באמצעות צנטריפוגה במשך 10 דקות – 1,100× g לפני שעבר לאחסון בטמפ’ של −80 °C.

תרכיב חזיר יורקשייר נאסף מדם מוקרש במהלך ניתוח שגרתי. הדם הוצא מתוך וריד באוזן והוחדר צינור חלבונים 1.5ml Eppendorf . נתנו לדם להיקרש במשך 30 דקות בטמפ’ חדר ולאחר מכן עבר הפרדה באמצעות צנטריפוגה במשך 10 דקות ב- 1,500× g , 4 °C. הדגימה הוסרה מקריש הדם ואוחסנה ב- −80 °C.

הדגימה האנושית נרכשה מ- Innovative Research. לפי פרוטוקול המפיץ, 500–600 mLs של דם נאסף בשקיות יבשות ללא נוגדי קרישה ממתנדבים אנושיים. הדם המלא עבר הפרדה בצנטריפוגה בטמפ’ בין 1°C לבין 4 °C. פלזמה הופקה מתאי דם אדומים והותר לה להיקרש במשך 48 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן עבר הפרדה בצנטריפוגה במשך 20 דקות ב- 5000× g. הדגימה הסורה מהקריש ואוחסנה בטמפ’ של −80 °C.

עבור מדידות של Vanin-1 על ידי מעקב אחר תגובה מקבילה. תת קבוצה של דגימות קפואות נבדקה מדולפינים “מנוהלים” תחת טיפול אנושי (N=10). דגימות אלה נבחרו מתוך מאגר של דגימות שנקחו במחקר שפורסם בעבר. הדולפינים הותאמו לגיל ומין, ודגימות הדם הוצאו בהפרש של שנה אחת מהשנייה. הדגימות מדולפינים תחת טיפול אנושי נאספו בדיוק כפי שתואר בדגימות מדולפינים ששימשו למחקרים פרוטאומיים. דם מלא מדולפינים חופשיים נלקח מוריד גלוי תוך שימוש במבחנות ווקום ומחט באורך 3/4 אינצ’. הדם הופרד בצנטריפוגה במשך 10 דקות ב- 1,800× g בטמפ’ חדר. הדגימה הוסרה מהקריש ואוחסנה בטמפ’ של −80 °C.