Transcriptome analysis of a wild bird reveals physiological responses to the urban environment

ניתוח מבנה המולקולות בתאי ציפור הבר, המגלה תגובות פיזיולוגיות לסביבה העירונית

זיהוי הבסיס המולקולרי של השונות הפנוטיפית (תכונות האורגניזם הניכרות לעין) המושרה על ידי הסביבה, מציג הזדמנויות מלהיבות לקידום ההבנה שלנו, כיצד תהליכים אקולוגיים והסביבה, יכולים לעצב את הפנוטיפ (תכונות האורגניזם). סביבות עירוניות וכפריות המציגות אורגניזמים חיים וחופשיים, בעלי אתגרים והזדמנויות שונים, המשפיעים בצורה ניכרת על הפנוטיפ, אך קיים מידע מועט על תגובות אלה ברמה המולקולרית. אנו מאפיינים את מבנה המולקולות בתא, מאוכלוסייה העירונית והכפרית של הציפור Parus major (ירגזי מצוי), המפגינה הבדלים בולטים בפרופיל הביטוי הגנטי הן ברקמות הדם והכבד. גנים שהובעו באופן שונה, היו קשורים לתגובות החיסונית והדלקתית, לניקוי רעלים, להגנה מפני לחץ חמצוני, לחילוף חומרים בדם ולרגולציה של ביטוי הגנים. גנים רבים הקשורים לתגובות מתח, באו לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר בציפורים העירוניות, בהתאם לתחזית שלנו, שחיות עירוניות חשופות ללחץ סביבתי גדול יותר. זהו אחד המחקרים הראשונים שחשפו הבדלי תעתוק בין בעלי חיים עירוניים והאוכלוסיות הכפריות, המציע תפקיד חשוב לאפיגנטיקה (חקר השינויים בתפקוד הגנים שאינם כרוכים בשינויים בDNA) בתיווך השונות הפיזיולוגית המושרה על ידי הסביבה. המחקר מספק משאבים רבי ערך לפיתוח מחקרים מעמיקים נוספים על המנגנונים המניעים שונות פנוטיפית בהקשר העירוני בקנה מידה מרחבי וזמני גדול יותר.

לחשיפת הבסיס המכניסטי, של האופן שבו התכונות הפנוטיפיות מגיבות, באופן מסתגל או לא מסתגל לסביבות חדשות או משתנות, יש השלכות משמעותיות על הבנת וניהול השינוי הסביבתי האנתרופוגני (שמקורו בפעילות האנושית). העולם כיום עד לשיעורים חסרי תקדים של הפיתוח העירוני, והאזורים העירוניים, המייצגים את הצורה המהירה ביותר לכיסוי שטח פני האדמה. בעוד שהסביבה העירונית יכולה להסיר רבות מן המגבלות האקולוגיות הקיימות במקומות אחרים, למשל על ידי מתן זמינות גבוהה של מזון לאורך כל השנה והקטנת מתח אקלימי בחורפים, ערים ועיירות, מציגות אורגניזמים חיים חופשיים עם מגוון רחב יותר של לחצים סביבתיים, הנובעים מהאוויר, מאור לילה מלאכותי, מהמים, ומזיהום הנוצר מרעשים, כמו גם שינויים בדינמיקת הפתוגן המארח, לעומת הסביבות הטבעיות. למרות האתגרים שמציבה הסביבה העירונית, ישנם בעלי חיים רבים הממשיכים להתקיים בצורת מושבות ואף משגשגים בערים ובעיירות, בעוד שבעלי חיים אחרים, נמנעים לחלוטין מהאזורים העירוניים. שינויים בהתנהגות, בפיזיולוגיה ובמורפולוגיה נראו באורגניזמים החיים באזורים עירוניים, ומחקרים מגוונים תרמו להבנתנו כיצד תהליכים אקולוגיים מעצבים את הפנוטיפ בסביבה העירונית. עם זאת, למרות פרץ העניין בקשר להשלכות האקולוגיות של העיור, ההבנה שלנו, על הבסיס המולקולרי של השונות הנצפת בפנוטיפ, הינה מוגבלת.

כימות הגנום השלם של ביטוי הגנים, באמצעות טכנולוגיות רצף, בעלות תפוקה גבוהה, ניתן לשימוש בכדי לזהות גנים התורמים לשינוי השונות הפנוטיפית בין הפרטים והאוכלוסיות. מחקרים אלה גילו גנים ומסלולים אשר ממלאים תפקידים חשובים בתגובות מכניסטיות לאתגרים סביבתיים באורגניזמים חיים חופשיים, למשל, השפעות החמצת האוקיינוס ​​באלמוגים, סובלנות הזיהום בדגי killifish, והתגובה המולקולרית לדלקת המלריה וההבדלים בביטוי הגנטי לאורך שיפוע הגובה אצל הציפורים. חשיפה לחומר חלקיקי מהסביבות העירוניות והכפריות, גרמה לשינויים בביטוי הגנטי אצל עוברי דגי הzebrafish במעבדה, בעוד שמחקר השוואתי על בני אדם, תושבי פלנדריה (בלגיה), חשף קורלציות בין רמות הביטוי של הגנים לבין חומרים מסרטנים סביבתיים.

Harris et al סיפקו ראיות לבחירה כיוונית בתעתוק של עכברי בר הנמצאים בסביבה עירונית, אם כי המחברים הכירו במגבלות של נתוני הפולימורפיזם (הרב צורתיות) שנוצרו מצירופי התעתוקים האלה.

במחקר אחר, הושוו תעתוקי העכברים העירוניים והכפריים, אך המחקר נועד לפתח מקורות גנומיים והיה חוסר של בקרות מספקות על מנת להפיק השוואות עירוניות/כפריות. הבנת התרומה של הביטוי הגנים לשונות הפנוטיפית, המושרה על ידי הסביבה ברמה הפרטית בסביבה העירונית, תספק תובנה מכרעת לתוך הרגולציה של הפנוטיפ, ברמה המולקולרית, בתגובה ללחצים עירוניים בטבע.

Parus major היא ציפור דרור הנפוצה ביותר ברחבי אירופה הן באיזור העירוני והן בכפרי. לפיכך, היא הפכה להיות מודל המערכת האקולוגית העירונית לעופות. כדי לקבל תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים העיקריים שעמדו בבסיס התגובות הפיזיולוגיות לסביבות העירוניות, ביצענו רצף של בדיקות במבנה המולקולות התאי (RNA-seq) בכדי לאפיין תעתוקים משוכפלים מהכבד ומרקמות דם שלמות בכמה אוכלוסיות גדולות עירוניות וכפריות בשוודיה. הן כבד העופות והדם, רגישים לשינויים בחשיפה לתזונה שונה ולזיהום, ולכן, הם צפויים לתרום להבדלים בביטוי הגנטי ביחס לעיור. מערכת הדם מספקת גם הגנה מפני האנטיגנים, כגון חומר החלקיקים והפתוגנים, אשר עשויים להיות חשובים בהבדלי הפנוטיפים הבסיסים בין החיות העירוניות לכפריות. ראשית, כימתנו את הבדלים בביטוי הגנים בין הציפורים העירוניות לכפריות. שנית, ביצענו ניתוחים להעשרת הגנים, תוך שימוש בהערות אונטולוגיות גנטיות (GO), בכדי לקבוע את התהליכים הביולוגיים ואת הפונקציות המולקולריות, שהיו מוגזמות יתר על המידה בין הגנים שהובעו באופן דיפרנציאלי. התוצאות שלנו הראו כי ההבדלים הפונקציונליים העיקריים בין הציפורים העירוניות לכפריות, קשורים לתגובות החיסוניות והדלקתיות, להגנה מפני לחץ חמצוני, לחילוף החומרים בדם ולרגולציה של הביטוי הגנטי. יתרה מזאת, גנים רבים הקשורים לתגובות דחק, התבטאו ברמות הגבוהות יותר בסוג העירוני, לעומת הציפורים הכפריות. הדבר מצביע על כך שההבדלים בתזונה ובחשיפה ללחץ, למשל זיהום ופטוגנים, בין שתי הסביבות, עשוי לבסס את השונות שנצפתה בביטוי הגנטי. בין אם התוצאות שלנו, הנגזרות משתי האוכלוסיות, משקפות הבדל כללי בין האוכלוסיות העירוניות לכפריות, על פני קנה מידה מרחבי גדול יותר אשר צריך להיבדק, ומחקר זה מספק משאבים רבי ערך בכדי ליידע את התכנון של מחקרים עתידיים בנושא.

תוצאות ודיון

ציפורים עירוניות וכפריות מפגינות פרופילים שונים של ביטוי הגנים

ניתוחי ביטוי הגנים השונים, יחד עם ניתוח המרכיבים העיקריים (PCA, איור S1), הראו כי הן הציפורנים העירוניות והן הכפריות, מציגות פרופיל ביטוי שונים באופן משמעותי (איור 1: S2 ו- S3).

דפוס זה ניכר גם ברקמות הכבד והדם: הגנים 304 ו-372 הובעו באופן מובהק (q <0.1) בין שתי הסביבות בכבד ובדם, בהתאמה (איור 1: S3).

הטבלאות המשלימות S1 ו- S2 מראות את 20 הגנים המובהקים החשובים ביותר שהובעו באופן דיפרנציאלי בכבד ובדם. מבין הגנים שהובעו באופן דיפרנציאלי, הרוב בא לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר של הציפורים העירוניות (כבד: 238 [78%], דם: 321 [86%], יחסית לציפורים הכפריות. (איור 1) לא מפות החום ולא ה-PCA (איור S1) חשפו דמיון רב בין שתי הקבוצות הגילאים השונות (ראה שיטות), ולכן, אין לנו סיבה להאמין כי הבדלי הגיל, הם המניעים את השונות שנצפתה בביטוי הגנטי בין הפרטים העירוניים לבין הכפריים. ניתוח העשרה גנטי הראה ייצוג יתר מובהק של הגנים 318 ו- 281 במונחי GO, המוקצים לגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי בתעתוקי הכבד והדם, בהתאמה (איור S4). בעוד ש9% (n = 53) מהגנים שהובעו באופן דיפרנציאלי, היו שכיחים בכבד ובדם (איור S2A),28% n = 130)) ממונחי הGO שאופיינו באופן משמעותי, היו משותפים לשתי הרקמות (איור S2B ). תוצאות אלו מצביעות על כך, שלמרות שחלק מהתגובות הפונקציונליות המושרשות על ידי הסביבה, פועלות הן ברקמת הכבד והן בדם, הן כרוכות בעיקר בגנים השונים. ההבדלים בפרופיל הביטוי צפויים, בהתחשב בפונקציות השונות של שתי הרקמות, ומדגישים את הערך של חקירת התגובות התעתוק ברקמות אחרות מלבד בדם. רבים מן הגנים שהתבטאו יותר באוכלוסייה העירונית, בהשוואה לציפורים הכפריות, מעורבים בתגובות הפיזיולוגיות והביוכימיות לדחפים ביוטיים ואביוטיים המאפיינים סביבות עירוניות. בקטעי ההליך, אנו מעריכים ומדברים על המשמעויות הפונקציונאלית של השונות שנצפתה בביטוי הגנים. יש לציין כי ביטוי גנטי ברמת ה-RNA לא תמיד תואם את רמות החלבון בפועל, אם כי, כמה מחקרים הראו מתאם טוב בין ריכוז mRNA והחלבון.

הגברת כמות התאים הגנטיים בביטוי העירוני של התגובה החיסונית האדפטיבית

גנים המעורבים בפיתוח, הפעלה והסדרה של התגובות החיסוניות והאדפטיביות, היו מיוצגים באופן משמעותי בין הגנים שהובעו באופן דיפרנציאלי מהכבד ומהדם (איור  2A,B, S4). ואכן, רבים מן הגנים המובהקים המשמעותיים ביותר, מעורבים בפונקציות הקשורות לחסינות מסתגלת או מולדת (S1 ו- S2). פונקציות מייצגות, מתייחסות בעיקר להפעלה ולהבחנה של תאי T (קולטני האנטיגן) ותאי B (המעורבים בייצור נוגדנים, איור 2A), תצוגת האנטיגן ועיבודו (למשל באמצעות תאים דנדריטים ובאמצעות MHC, איור 2A), ומסלולי האיתות הרלוונטיים (איור 2A, B). תאי T ותאי B הם מתווכי המפתח של החסינות המסתגלת, וכאשר הם מוצגים עם אנטיגן או עם אות מחיידקים, ההתפשטות וההבחנה של הלימפוציטים ממשיכה. למרבה הפלא, כמעט כל הגנים הקשורים ל”תהליך מערכת החיסון “GO (הכבד: n=53/53, דם, n=57/59) ו”תגובת המערכת החיסונית” (כבד: n=29/29, דם: n=29/30) התבטאו ברמות הגבוהות יותר בעיר, יחסית לציפורים הכפריות (S3). ציפורים עירוניות גם הפגינו ביטוי גבוה יותר של גנים רבים שמוצריהם מעורבים באיתור ובתגובה לחיידקים ולתרכובות שמקורם בחיידקים (איור 2B). הבדלים אלה היו בולטים יותר בדם (14 גנים הקשורים ל13 משוואות GO משמעותיות), בהשוואה לכבד (6 גנים הקשורים ל3 מונחי GO משמעותיים), תעתוקים (S3 ו- S4). מאחר שמערכת הדם מספקת תפקיד בסיסי בהגנה על הגוף מפני פלישה חיידקית, השינויים הצפויים לסביבה בהגנות חיידקיות יהיו צפויים להיות בולטים יותר בדם, בהשוואה לרקמות אחרות.

איור 1

איור 1: ביטוי גנטי בין ציפורי ה Parus major בסביבה עירונית ובסביבה הכפרית. מוצגות מפות חום בשביל להמחיש את רמות הביטוי של הגנים הבאים לידי ביטוי בצורה דיפרנציאלית (שורות) עבור כל פרט (עמודות) ב(A) כבד (n = 304 גנים) ו(B) דם שלם (n = 372 גנים). פרטים מסומנים U1-U6 ו R1-R6 עבור הפרטים העירוניים והכפריים, בהתאמה. ביטוי גנים מנורמל כבר התייצב בשונות, וממוקם סביב האפס. צבע כהה יותר מציין ביטוי גבוה יותר וצבע בהיר יותר מציין ביטוי נמוך יותר. הפיזור בא להראות ממוצע מנורמל של הרמות של ביטוי הגנים (log10-transformed) ב(C) כבד (n = 12 פרטים) ו(D) דם (n = 11 פרטים). הנקודות האדומות מצביעות על הגנים המובהקים (q <0.1), ואילו הנקודות השחורות מציינות את הגנים שאינם מתבטאים באופן דיפרנציאלי. תעתוק הדם מפרט R2 הוסר מן הניתוח שכן הוא זוהה כנקודה המרוחקת מהמדגם (S4).

ביטוי גבוה יותר של גנים המקושרים לתפקודים החיסוניים בציפורים העירוניות, יכול להיות מוסבר על ידי גיוון ו/או שכיחות גבוהה יותר של הפתוגן, ובכך, מגדיל את תדירות החשיפה לחיידקים ואנטיגנים  בסביבה העירונית, בהשוואה לסביבה הכפרית. הוכח כי הסביבות העירוניות יכולות להשפיע על יחסי הגומלין בין הפתוגנים, באמצעות שינויים בשכיחות, בנתיבי השידור וברגישות של חיות הבר למחלות. עם זאת, בעוד שמספר מחקרים מדווחים על שיעור גבוה יותר של מחלות בעיר, בהשוואה לאוכלוסיות הציפורים הכפריות, מחקרים אחרים מדווחים על ירידה בשכיחות הפתוגן ובעוצמתו בציפורים העירוניות. אם הגיוון הפתוגני ו/או השכיחות, הם אכן גבוהים יותר בסביבות עירוניות, הגברת הפעילות של תגובות החיסון, עלולה להגדיל את יכולתן הציפורים העירוניעות להתמודד עם שינויים עירוניים הקשורים בדינמיקה של פתוגן מארח.

ואכן, ניתוח השוואתי קודם של 39 אירועים עצמאיים מבחינה פילוגנטית של עיור, הציע כי מינים שהראו תגובות חיסוניות חזקות יותר, (על פי גודל bursa of Fabricius) היו מוצלחים יותר באזורים העירוניים מאשר במינים עם תגובות חיסוניות חלשות יותר. עם זאת, פעילות חיסונית משופרת לא בהכרח מראה כי הציפורים יכולות להימנע מהשפעות השליליות הצפויות על ההישרדות או הרבייה, הקשורים במגוון גבוה של הפתוגן, שכן ייתכן שיש גם השלכות הקשורות להגברת כמויות התאים הגנטיים של ההגנה החיסונית. ללא קשר למנגנונים המעורבים, נתוני התעתוק של אוכלוסיות המחקר העירוניות, מראות כי המאפיינים של מערכת החיסון המסתגלת, יכולים להיות מרכזיים בהבדלים הבסיסיים בין הציפורים העירוניות לכפריות.

הציפורים העירוניות שיפרו את פעילות מערכת החיסון המולדת שלהן

בין הגנים שהובעו באופן דיפרנציאלי בין הציפורים העירוניות לכפריות, תנאי ה-GO הקשורים לתהליכי תגובה דלקתית, היו מוגזמים באופן משמעותי הן בתאי כבד והן בדם (איור 2B-D). באופן ספציפי יותר, תהליכי הייצוג יתר מתייחסים בעיקר לייצור, הפרשת וקליטה של ציטוקינים (חלבונים השייכים לקבוצת חלבונים שמפרישים תאי המערכת החיסונית ופועלים כמתווכים בתגובה החיסונית), וכימוטקס תנועת מיקרואורגניזמים או תאים כתגובה לגירוי כימי) (כבד: 41 גנים הקשורים ל -29 מונחי GO משמעותיים, דם: 24 גנים הקשורים ל-6 משוואות GO משמעותיות. S3). ציטוקינים (למשל גורמי הנמק בגידולים, כימוקינים ואינטרליוקינים) ממלאים תפקיד חשוב בתגובה המארחת לזיהום ולטראומה, על ידי תיווך תגובות דלקתיות המאופיינות באדמומיות, נפיחות, חום וכאב. בדומה לממצאים שלנו בנוגע למערכת החיסונית המסתגלת, כל הגנים הקשורים לתהליכים דלקתיים מוגזמים, מייצגים רמות גבוהות יותר בציפורים העירוניות, יחסית לציפורים הכפריות (S2 ו- S3). ביטוי מוגבר של ציטוקינים הוכח באופן נרחב בתגובה חיידקית, ויראלית וטפילית בתאי המקרופאגים של העופות.

הגן CP, המקודד עבור צרולופלסמין (חלבון נשא הנחושת), הוא רק דוגמה אחת של גן המקושר דלקתית אשר בא לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר של הציפורים העירוניות. כמו גם חשוב עבור סילוק רעלים של ברזל, צרולופלסמין הוא חלבון אקוטי כי הוא מסונתז בכבד במהלך השלב החריף של התגובה דלקתית, וככזה, הוא אינדיקטור לדלקת חריפה בציפורים. סימנים של דלקת נמצאים בשימוש נרחב במחקרים טוקסיקולוגיים וביו-רפואיים, ותגובות דלקתיות משופרות בבני אדם, בנוסף לקשר עם הזיהום והטראומה, קשורות בחשיפה למזהמים, כגון מתכות כבדות, חומר חלקיקי ותחמוצות חנקן. את ההבדלים שנצפו בביטוי הגנטי הקשור לפעילות החיסונית המולדת בין הציפורים העירוניות לכפריות, ניתן להסביר על-ידי הבדלים בחשיפה לפטוגנים, חומר שנוצר על ידי תנועה, חלקיקים ו/או לאור לילה מלאכותי. חשיפה מוגברת לכל מקורות המתח הסביבת,י עשויים לגרום לגידול של תגובות דלקתיות.

תגובות דלקתיות הן חלק מהתגובה החיסונית המולדת הרגילה, דלקת מופרזת או בלתי מבוקרת, תורמת נזק לרקמות ולמחלות. דלקת מפעילה ייצור מוגבר של מיני חמצן תגובתי (ROS), במידה ולא מוסר ביעילות על ידי הגנה נוגדת חמצון, מוביל ללחץ חמצוני ולפגיעה במיקרומולקולות התא כמו חומצות גרעין, שומנים וחלבונים. לפיכך, דלקת מתח חמצוני קשורה קשר הדוק. מתח מוגבר של חמצון מעורב באופן נרחב לירידה מתמשכת בתפקוד האורגניזם ובפתולוגיה של סוגי סרטן רבים ומחלות לב וכלי דם. למרות שיש לנו הבנה מסוימת של איך מתח חמצוני מושפע מזיהום עירוני, אנו יודעים מעט, אם בכלל, על התגובות הדלקתיות בבעלי חיים עירוניים. בעוד שדלקת משופרת יכולה להיות מועילה, במתן הגנה על זיהום, פגיעה וזיהום הקשורים בסביבות עירוניות, פעילות גבוהה מתמשכת של תגובות לחיסון המולד יכולה גם להיות מנוונת עבור הציפורים העירוניות.

איור 2: הבדלים תפקודיים מרכזיים בין ציפורי ה Parus majorהעירוניות והכפריות ברקמות הכבד והדם כפי שנחשף על ידי ניתוח העשרת גנים. מפות החום מציינות את רמת החשיבות של ייצוג יתר של מונחי הגנטיקה (GO) של גנים המקננים בתוך המונחים האביים: (A) ‘תהליך המערכת החיסונית’ (B) ‘תגובה לגירוי’ (C) “תהליך מטבולי” ו “רגולציה של תהליך מטבולי” (D) “פונקציה מולקולרית”. סולם הצבעים מייצג רמות מובהקות (log10-qed alues). צבע כהה יותר מציין משמעות סטטיסטית גדולה יותר (כלומר, ערך q נמוך יותר). כמה תנאים משמעותיים של GO מקוננים תחת פונקציות דומות כדי למנוע יתירות. מוצגים מספר תתי-מונחים המוסתרים בסוגריים מרובעים. עיין בשיטות לקבלת פרטים מלאים. מונחים מקוצרים: (a) הפעלה תאית מיאלואידית המעורבת בתגובה החיסונית (b) הפעלת מקרופאגים המעורבים בתגובה החיסונית (c) עיבוד אנטיגן והצגה של אנטיגן פפטיד או פוליסכריד באמצעות מחלקה MHC II (d) עיבוד אנטיגן והצגה של אנטיגן פפטיד דרך MHC מחלקה II (e) תגובה חיסונית אדפטיבית המבוססת על רקומבינציה סומטית של קולטנים שנבנו מתחומי superfamily immunoglobulin (f) התגובה החיסונית-ויסות של קולטן פני השטח של תא הקולטן. (g) זיהוי של גירוי מכני המעורב בתפיסה חושית (h) פעילות oxidouructactase, הפועלת על תורמים זוגיים, עם חמצון של תורמים וכתוצאה מכך הפחתת חמצן מולקולרי לשני מולקולות של מים (i) פעילות oxidouructuctase, הפועלת על תורמים זוגיים, עם שילוב או הפחתה של חמצן מולקולרי, flavin מופחת או פלבופרוטין כתורם אחד, וכן שילוב של אטום אחד של חמצן (j) ויסות חיובי של רצף DNA ספציפי מחייב גורם תעתוק פעילות (k) ויסות של רצף DNA ספציפי מחייב גורם תעתוק פעילות חיובי −ve = negative; +ve = positive.

בציפורים עירוניות יש יותר פעילות של סילוק רעלים ומערכות תיקון

למרות שהמונח GO ‘יון מתכת’ לא היה מיוצג באופן משמעותי, הגנים הקשורים למונח זה, היו רבים בין הגנים שבאו לידי ביטוי דיפרנציאלי הן בכבד (n = 38) ובדם (n = 63 ,S3). יתר על כן, רוב הגנים התבטאו ברמות גבוהות יותר בציפורנים העירוניות, בהשוואה לכפריות, ציפורים (כבד: n =23/38 דם: n=54/63). שני הגנים המקודדים עבור חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך (B5G2T6_TAEGU ו- MT4) לא רק שזוהו ברמות הגבוהות המשמעותיות בכבד בעיר, ביחס לכפר, אך הם היו בין הגנים הבולטים באופן דיפרנציאלי בתעתוק הכבד (S1 ). Parus major הציגו גם ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי, ברקמת הדם, של הגן (CP) מטאלופרוטאין, וב3 גנים מקודדים עבור מטאלופפטידס (MME, MMP28, ADAM19, S3). הפונקציות הביולוגיות העיקריות של כל החלבונים המקודדים, נוגעות לחיבור יון המתכת ולטיפול במתכות.

למרות שמתכות הם מיקרו-נוירונים חיונים עבור אורגניזמים, הם חשובים בתהליכים מטבוליים במסלולים האיתות, אך הם יכולים להיות רעילים בריכוזים גבוהים יותר, כתוצאה ממתח חמצוני. הספרות הטוקסיקולוגית הסביבתית שופעת מחקרים המעידים על לחץ חמצוני המושרה על ידי חשיפה למזהמים בסביבות יבשתיים ואקוטיות. בעוד שיש ראיות ללחץ חמצוני המושרה על ידי מזהמים בציפורים עירוניות, הידע שלנו לגבי ההשפעות, והיכולת לבצע סילוק רעלים בציפורים, הינם מוגבלים. התוצאות שלנו מראות שהביטוי של הגנים המעורבים בסילוק רעלים של מתכות, יכולים להיות חשובים בבסיס הפער התפקודי בין הציפורים עירוניות לכפריות. Metallothioneins (MT) הינו חשוב עבור סילוק רעלי מתכות כבדות שהוכחו להיות בעל יעילות של רדיקלים הידרוקסילים במבחנה. ריכוזים של MT בכבד ובכליות, הראו קשר הדוק לרמות הקדמיום בציפורים, בעוד שהחשיפה למספר יוני מתכות שונים הוכח כגרום לפעילות מוגברת של אנזימים וחלבוני נוגדי חמצון שונים, כולל MT, בדגים .

באופן דומה, בעכברים, הביטוי הגנטי MT מוגבר בתגובה למתח חמצון, כולל יוני מתכת,אקסנוביאוטיק, דלקת, וגם מתח חמצוני. הביטוי הגבוה של הגנים המעורבים בסילוק רעלי המתכות בציפורים עירוניות, במחקר הנוכחי, עשוי לייצג תגובה להגבלת ההשפעות המזיקות של רמות גבוהות של פרו-אוקסידנטים ולהפחית את ההשפעות הרעילות הנובעות מחשיפה למתכות כבדות בסביבה עירונית .

בין הגנים שהתבטאו באופן דיפרנציאלי בהשוואה בין הציפורים העירוניות לכפריות, היה ייצוג יתר של הגנים המעורבים בפעילות הפחתת חמצון (כלומר, הקשורים ל”פעילות חמצון” של הGO וכל המונחים המופחתים) בדם (n=30) , איור 2C) ורקבות הכבד (n=3, איור 2C). לדוגמה, הציפורים העירוניות הציגו ביטוי גבוה יותר של הגן TXNRD1, המקודד עבור טירדוקסין רדוקטאז 1, האחראי על זירוז ההפחתה של טירדוקסין, שהוא נוגד חמצון תאי חשוב.

זה מצביע על כך שלציפורים העירוניות יכולות להיות רמות גבוהות יותר של טירדוקסין, אשר יכול להיות כתגובה מסתגלת או בלתי-מסתגלת לחשיפה לרמות גבוהות של לחץ חמצוני. בנוסף, תעתוק הדם של הציפורים העירוניות חשף ביטוי גבוה יותר, באופן מובהק, של שני הגנים המקודדים נוקלאזות (EXO1 ו- FEN1) הממלאים תפקידים מרכזיים בתיקון הDNA. תוצאה זו מספקת אינדיקציה נוספת כי הציפורים העירוניות יכולות להיות חשופות לרמות גבוהות יותר של חמצון הנגרם מנזק הDNA. מחקר שנערך לאחרונה באותן האוכלוסיות, מאשר את הממצא הזה, על ידי הוכחת הניסוי, כי גידול בסביבה העירונית גורם לטלומר (רצף DNA שמצוי בשני קצותיו של הכרומוזום) קצר יותר. הטלומרים הקצרים נקשרו במידה רבה עם תוחלת החיים והכושר, והלחץ החמצוני הוא ככל הנראה מתווך מרכזי של שחיקה מואצת של הטלומרים. יחד, התוצאות שלנו מראות כי ההבדלים ברמות הביטוי של הגנים, הקשורים למנגנונים המעורבים בסילוק רעלים ובתיקון של הנזק חמצוני, תואמים את ההבדלים האפשריים לחשיפה כימיקלית של חמצון ממריץ, בין הפרטים העירוניים והכפריים.

ויסות דיפרנציאלי של פיזיולוגיה של חומצת השומן

מספר גנים שהובעו באופן דיפרנציאלי בין הציפורים העירוניות לכפריות המעורבים בחילוף החומרים בדם, מחייב אחסון הן בכבד והן בדם (S3). בפרט, תעתוקי הכבד חשפו ייצוג יתר של תנאי הGO הקשורים לסינתזה ולהתארכות של חומצות השומן (n=2 גנים הקשורים ל- 6 משוואות GO משמעותיות, איור 2C, S4). הרכב חומצות השומן של הרקמות נקבע בחלקו על ידי דיאטה (אשר עשוי להיות שונה בין בתי גידול עירוניים וכפריים), ויש לו השלכות חשובות על הפונקציות והתהליכים הפיזיולוגיים הרבים, כולל ויסות חום, דלקת או מתח חמצוני. תהליכים אלה עצמם רגישים לגורמי לחץ חיצוניים, כגון מזהמים, הקשורים לסביבה העירונית.

הציפורים הכפריות הציגו בכבד ביטוי גבוה יותר של האנזימים (ELOVL2, ELOVL5) והאנזים  (FADS6) המעורבים בביוסינתזה של חומצת שומן רב בלתי רווי- PUFAs (S3). שרשרת ארוכה של PUFA נוטים לחמצון על ידי השומנים, ולכן רמות גבוהות יותר, מגבירות רגישות של האורגניזם לנזק חמצוני. כפי שהוזכר, נתוני התעתוק שלנו דומים למה שהראו מחקרים אחרים ומצביעים על כך שהציפורים העירוניות עומדות בפני איום חמצוני גדול יותר. שמירה על ביטוי נמוך של הארכות אלו בסביבה העירונית, יכולה לצמצם את מידת הנזק החמצוני בקרום השומנים.

PUFAs מומרים באמצעות נתיבי הארכה והחמצון אל האיקוסנואיד, אשר מווסת את העוצמה והמשך של התגובות הדלקתיות. בדרך כלל, איקוסנואיד נגזר המסלול האומגה (ɷ)  ל6 PUFA ישנן השפעות פרו דלקתיות (למשל חום, התרחבות של כלי הדם, בצקת), ואילו לנגזרות ɷ PUFA 3, ישנן השפעות אנטי דלקתיות. למרות שהתגובות הדלקתיות פועלות בכדי להילחם בגירויים מזיקים, דלקת מוגזמת ובלתי מבוקרת עלולה לגרום להשלכות שליליות כתוצאה מחומרים נוגדי חמצון ופגיעה ממקרומולקולות. מעניין לציין, כי לאחרונה הוכח באוכלוסיית המחקר שלנו כי בציפורנים עירוניות היו רמות גבוהות יותר של חומצה הארכידונית, בעוד שבציפורים כפריות היו רמות גבוהות של חומצה איקוסאפנטאנואית, דבר המצביע על כך שלציפורים עירוניות יש רמות גבוהות יותר של דלקת איקוסנואידים.

למרות שההעדפות היחסיות של שני האינזימים (ELOVL2 ו- ELOVL5) עבור המסלולים ɷ -6 ו- ɷ -3 לא נקבעו בציפורים (ראה מחקרים ליונקים), הפחתת הביטוי של הגנים בסביבה העירונית, עשויה להיות תגובה להגבלת סינתזה אנדוגנית של PUFAs פרו דלקתיים וכן, עלייה נוספת בדלקת ונזק חמצוני נוסף.

מנגנונים אפיגנטיים כמגשר אפשרי לתגובות ללחצים עירוניים

פרופילי הביטוי של רקמות הכבד והדם הראו ייצוג יתר מובהק של מספר מונחי GO הקשורים לרגולציה של הביטוי הגנטי, באמצעות שינויים אפיגנטיים כגון מיתול של הDNA ומיתול של היסטילון, ובאמצעות ויסות של גורמי תעתוק (איור 2D, S4). יתר על כן, הגנים הספציפיים הנוגעים בדבר (כבד: n=15 גנים, דם: n=11 גנים, S3) הקשורים לתיקון נזק לDNA, דיכוי בגידולים, וחיבור יון מתכתי, אשר קשורים כולם לתעתוק בהבדלים בין הציפורים העירוניות והכפריות. מנגנונים אפיגנטיים פועלים באופן דינמי להסדרת הארגון והתפקוד של הגנום, על ידי ויסות התעתוק והביטוי הגנים. אחד הגנים המובהקים המשמעותיים ביותר של התעתוק בכבד מקודד MTR (S1), אשר מעודד את הוספת קבוצות המיתול לDNA. מיתול של DNA הוא הסימן האפיגנטי המובן ביותר והממלא התפקיד המכריע בוויסות הביטוי הגנטי. יתר על כן, MTR בא לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר בציפורים הכפריות, בהשוואה לציפורים העירוניות, דבר המצביע על כך שרמת מיתול הDNA של ציפורים כפריות, יכולה להיות גבוהה מזו של ציפורים עירוניות באוכלוסיות המחקר. מאז שמיתול קשור בדרך כלל עם ביטוי גנים מופחת, ביטוי גבוה יותר של הגן MTR, בציפורים כפריות, יכול לתרום לרמות נמוכות יותר של הביטוי הגנטי שבא לידי ביטוי דיפרנציאלי משמעותי אצל פרטים אלה (איור 1).

התוצאות מצביעות על תפקיד מפתח פוטנציאלי עבור מנגנונים אפיגנטיים בתיווך השונות הפנוטיפית שנצפתה בביטוי הגנטי, סבירה בין הציפורים העירוניות והכפריות. ואכן, רצף המיתול בציפורים בעל תפקיד עיקרי בתהליכים אבולוציוניים בתוך המין, בעוד שהמיתול הוכח עיקרי גם בעיצוב האישיות של הציפורים. האפיגנומה מגיבה מאוד לרמזים סביבתיים ולדפוסים חריגים של מיתול הDNA אשר נקשרו לחשיפה למגוון הרחב של מזהמים סביבתיים בבני אדם ובבעלי חיים אחרים, כמו גם מחלות לב וכלי דם, סרטן והזדקנות אצל בני אדם. מחקרים על בני אדם ומכרסמים במעבדה, הראו שדפוסי המיתול רגישים במיוחד לשינויים בתזונה, ועשויים לחזק את הרגישות למחלות בשלב מאוחר יותר של החיים. לאחרונה, דיאטה הוצגה גם כמשפיעה על מיתול הגנום שלם בבבונים פראיים (Papio cynocephalus). ההבדלים המוסברים ברמות מיתול הDNA בין ציפורים עירוניות לכפריות, יכולים להיות תוצאה של הבדלים בחשיפת המזהמים ו/או שינוי בתזונה בין שתי הסביבות השונות.

חשוב לציין, ששינויים אפיגנטיים יכולים להיות תורשתיים במהלך חלוקת התא המיטוטי, שינויים המושרים על סביבת הביטוי הגנטי יכול להתמיד לאורך החיים, וכתוצאה מכך ליצור שינויים בחיים על תכונות הפנוטיפ. מעט מאוד ידוע על מנגנונים אפיגנטיים בציפורים, כיצד דפוסי המיתול בציפורים מושפעים מהסביבה, והאם שינויים אפיגנטיים הם בעיקר תוצאה של “תכנות התפתחותי”.

מסקנות

זהו אחד המחקרים הראשונים המכמת את השונות בביטוי הגנטי בגנום הרחב של בעל חיים פראיים בהקשר העירוני. קיומם של הבדלים עקביים ומסומנים בפרופילי הביטוי הגנטי של ציפורים עירוניות וכפריות מסוג Parus major, במחקר הנוכחי, מציעים את הסדרת התגובות ברמה המולקולרית לתנאים סביבתיים מקומיים. בעוד שמחקר זה מוגבל על ידי התחשבות רק בשתי אוכלוסיות, רבים מהגנים המופרדים וההבדלים התפקודיים, היו בכיוון הצפוי ובהתאם למחקרים פיזיולוגיים קודמים. לדוגמה, גנים רבים הקשורים לתגובות מתח, באו לידי ביטוי ברמות גבוהות יותר בציפורנים העירוניות, בהשוואה לכפריות, דבר המצביע על כך שההבדלים שנצפו בביטוי הגנטי, הם תוצאה של חשיפת מתח דיפרנציאלית בשתי הסביבות המנוגדות. התוצאות מצביעות על כך שהבדלים בתזונה ובחשיפה למזהמים ולפתוגנים, יכולים לתרום לגיוון שנצפה בתעתוק בין הציפורים העירוניות לכפריות. מחקרים ניסויים עתידיים צריכים לשאוף לקבוע את התפקיד הספציפי של הלחצים השונים.

על ידי מתן תובנה חדשה לתפקודים הביוכימיים והפיזיולוגיים המעורבים בתגובות הסביבתיות העירוניות, הממצאים שלנו יאפשרו זיהוי של גנים רגולטוריים מרכזיים הן ברקמת הכבד והן ברקמת הדם. מכיוון שעלות הרצף הנוכחי מגבילה את הכדאיות של ביצוע ניתוח התעתוק המשוכפל, על פני זוגות מרובים של אוכלוסיות עירוניות/כפריות (תוך שמירה על שכפול מספיק של הפרט ושל רמת הרקמות), בתוצאות שלנו יש להשתמש בכדי ליידע על יישום של גישות הגן וכדי לאמת את העקביות של התגובות שנצפו על פני קנה מידה מרחבי וזמני רחב יותר. עדיין יש להבין עד כמה ההבדלים בתעתוק בין הציפורים העירוניות לכפריות הוא תוצאה של הסתגלות גנטית, שינויים אפיגנטיים ו/או תגובות ישירות, לתגובות הסביבה. עם זאת, ממצאינו מצביעים על כך שהמנגנונים האפיגנטיים יכולים למלא תפקיד מרכזי בתיווך השונות בגורמים הסביבתיים בביטוי הגנטי בהקשר העירוני. חשוב לציין, מנגנונים אפיגנטיים יכולים ליצור שינויים ארוכי טווח בביטוי הגנטי ובעקבות כך בתכונות הפנוטיפיות.

שיטות

אמירה אתית

מחקר זה בוצע על פי החקיקה השוודית ואושר על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים (Dnr M454 12:1).

המינים שנחקרו והאתרים במחקר

נבחרו 12 Parus major זכרים- 6 מתוך סביבה עירונית ו6 מתוך הסביבה הכפרית היו מורדמים בסוף חורף 2014 בדרום שוודיה. ציפורים עירוניות (מסומנות כ- U1-U6) נלכדו בMalmö (55°35′ N 12°5′ E; Supplementary Fig. S3A ,S3A) – העיר השלישית בגודלה בשוודיה עם כ300,000 תושבים. אתר המחקר במלמו הוא פארק עירוני המאופיין בתערובת של עצים מחטניים ונשירים, שטחי מרעה מנוהלים, בריכות ותשתיות עירוניות נלוות, כולל שבילים מרוצפים ובניינים.

הציפורים כפריות (מסומנות כ R1-R6) נתפסו ב Vomb (55°39′ N 13°33′ E; Supplementary ,S3B), אתר כפרי הממוקם 35 ק”מ צפונית מזרחית מMalmö. Vomb מורכב מ12 קמ”ר, של בעיקר מחטניים, יער משולב עם עצים רחבים. האזור שמסביב מיושב בדלילות על ידי בני אדם (<5 תושבים km-2). לפרטים נוספים על האתרים, ראה סעיף 21. ציפורים כפריות נתפסו 7 ימים אחרי הציפורים עירוניות. מאחר והרבייה מתרחשת עד 7 ימים קודם לכן בMalmö, לעומת Vomb, אנחנו לא מצפים שיהיו הבדלים בין הציפורים העירוניות לכפריות מבחינת שינויים פיזיולוגיים לקראת עונת הרבייה. הציפורים נלכדו בזמן שהיו קופסאות קרטון בלילה והועברו למעבדה בלונד, שם נרשמו ביומטרית, ונאספו מהן דגימת דם והועברו מיד לאחסון ב80- מעלות צלזיוס. נתיחה שלאחר המוות התבצעה מיד לאחר המוות של הציפור. רקמת הכבד נאספה והועברה לאחסון ב80- מעלות צלזיוס בתוך 5 דקות אחרי המוות. ציפורים כפריות (ממוצע ± SE: 19.5 ± 0.25 גרם) היו משמעותיות יותר מאשר ציפורים עירוניות (ממוצע ± SE: 17.8 ± 0.22 g, T- מבחן: t = 3.46, df = 6.8, P = 0.011), למרות שלא היו הבדלים בגודל הגוף, לפי המדידות (ממוצע ± SE: כפרי: 22.9 ± 0.20, עירוני: 22.6 ± 0.79, T- מבחן: t = 0.35, df = 4.5, P = 0.739).

כל הציפורים היו בוגרות: הציפורים כפריות היו כולן בנות 3 ומעלה והציפורים העירוניות U1-3 היו בנות  2 ומטה בעוד U4-6 היו 3 K +.

בידוד RNA, הכנות בספריה ורעיונות רצף

סך RNA היה מבודד מ25 רקמת הכבד ו15 μl של דם עבור כל אחד מ12 הציפורנים. הדוגמאות היו הומוגניות הראשון ב60 μl (כבד) / 20 μl (דם) שימוש במי מילפור לבחינת הרקמות (BioSpec, Bartlesville, ארה”ב). בוצע שלב יחיד של טריזול/כלורופורם, ואחריו טיהור באמצעות ערכת RNeasy של Qiagen (Hilden, גרמניה), על פי הנחיות היצרן. התשואה והטוהר של הRNA נבדקו באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop (Thermo Scientific, ארה”ב) ובאמצעות Agilent 2100 Bioanalyser (סנטה קלרה, ארה”ב). כל הדגימות אושרו באיכות מקובלת כפי שצוין על ידי יחס הננומטר 260/280 nm היחס (חציון ± סטיית התקן:  2.02 ± 0.05) ו RIN (מספר היושר של RNA, חציון ± 7.1 ± 1. סטיית התקן). הטיפול DNase בוצע לפני הרצף. נעשתה בניית ספריה Truseq ו-100 bp זווגו ל RNA-seq על ידי לקיחת הדגימות שהתבצעה באמצעות Illumina HiSeq 2000 by BGI Tech Solutions (הונג קונג). כל הדגימות היו רצופות פעמיים, בנתיבים שונים, וכן התערובת של הדגימות העירוניות והכפריות הועברו בכל נתיב. מסיבות שאינן בשליטתנו, RNA מדם של R2 היה בנפרד מכל דגימות RNA האחרות, מאחר שהתעתוק שהתקבל היה שונה מאוד מכל שאר התעתוקים (איור 4), פרט זה הוסר מניתוח תמלילי הדם.

ניתוח התעתוק

קורא הRaw RNA-seq היה מרובה, ונתן סריקה מתאימה ואיכותית. השגנו 763 מיליון ו772 מיליון סריקות באיכות גבוהה, מרקמות הכבד והדם, בהתאמה. הקריאות (1.5 מיליארד, 767 מיליון זוגות) ממופות באמצעות TopHat2 2.0.1274 לגנום של הציפור zebra finch הגנום Taeniopygia guttata (v.3.2.4) שנרשם מ- Ensembl (www.ensembl.org). למרות שפורסם הגן של הציפור Parus major, לגנום הzebra finch היה ללא ספק את הרכב הגנום באיכות הגבוהה ביותר, עם 18,618 גנים מסומנים לעומת 13,036 גנים בגנום של הציפור Parus major. יתר על כן, מידע הקיים עבור 14,601 גנים בגנום הzebra finch, העשיר בעוד נתוני GO שטרם היו קיימים עבור הגנום של הציפור Parus major. הגנום של העופות נשמר מאוד בין המינים, מה שהופך את השימוש של הגנום ממין אחר, לאפשרי. שיעור אי-התאמה מקסימלי של 25% הורשה לסטייה בין המינים. סך של 582 מיליון (76.3%) ו632 מיליון (81.9%) קריאות, מרקמות הכבד ומרקמות הדם בהתאמה, מיושרות בהצלחה עם הגנום. קריאות ייחודיות שמופו בצורה חד-משמעית לגנים נספרו באמצעות HTSeq 0.5.3p976 ו- Samtools 0.1.1977. כל הקריאות הופקדו ברצף של NCBI ארכיון (PRJNA314210).

ניתוח דיפרנציאלי של הביטוי הגנטי

בדיקות הביטוי הגנטי בוצעו באמצעות Deseq2 1.6.378. לפי Love et al, ספירות בודדות מנורמלות באמצעות ממוצע גיאומטרי ועם הפצה בינומית שלילית. הצטמקות של הפיזור והאומדנים מיושמת ב- DESeq2 בכדי לשפר את היציבות ואת יכולת הפרשנות, כלומר, לשינויים לוגריתמיים קלים תהיה יותר הצטמקות כאשר יש מעט מידע זמין לגן (כלומר, ספירת קריאה נמוכה, פיזור גבוה או כמה מעלות של חופש).

ערכי P-values תוקנו עבור תוצאות חיוביות שגויות באמצעות גילוי תגלית שגויה של Benjamini and Hochberg, (FDR) correction79 עבור בדיקות מרובות, בתוך Deseq2. גנים עם FDR (or q-value) < 0.1 נחשבו שונים באופן סטטיסטית. שימוש בניתוח רכיבים ראשיים (PCA), בוצעו על נתונים מהכבד והדם (איור S1A-C). ערכי ההבעה השתנו באמצעות ההשתנות המומלצת של שינוי תהליך ההמרה לשימוש ב-PCA וליצירת מפות חום (איור 1A, B). פרט בודד (R2) הוסר מהניתוח של תמלילי הדם, מאחר שPCA ומפות החום המרוחקות, חשפו אותו כערך קיצוני (S4), אולי בשל היותו רצף נפרד.

ניתוח העשרה גנטי

הערות פונקציונליות וייצוג יתר של תנאי GO נותחו באמצעות Cytoscape plug-in BiNGO 3.0.2. קובץ אונטולוגיה מלא של ציפור ה zebra finch הורד מ www.geneontology.org (08-18-2015). ניתוח העשרה גנטיים בוצעו באמצעות בדיקה hypergeometric עבור ייצוג יתר של תנאי GO המגדירים ביטוי דיפרנציאלי בגן, באמצעות zebra finch. שוב, P-values תוקנו באמצעות Penamini ו Hochberg FDR, בתוך BiNGO, ו- GO במונחים עם ערך של q <0.1 נחשבו שונים באופן משמעותי מבחינה סטטיסטית. אנו הערכנו תנאי הGO מהתהליך הביולוגי ומתחומי הפונקציה המולקולריים. עבור ייצור מפות החום באיור 2, טווח קבוצות GO היה מרוכז באמצעות REVIGO.

נגישות לנתונים: קריאות RNA-seq המופקדות ברצף של NCBI ארכיון (PRJNA314210).