A Universal Approach to Correct Various HBB Gene Mutations in Human Stem Cells for Gene Therapy of Beta-Thalassemia and Sickle Cell Disease

גישה אוניברסאלית לתיקון מוטציות HBB שונות בתאי גזע אנושיים לצורך ריפוי גנטי של בטא-תלסמיה ואנמיה חרמשית

תקציר

בטא-תלסמיה היא אחת המחלות הגנטיות הרצסיביות הנפוצות ביותר, הנגרמת ממוטציות בגן HBB. מעל 200 סוגים שונים של מוטציות בגן ה- HBB הכוללות 3 אקסונים זוהו אצל חולים עם בטא-תלסמיה (β-thal), בעוד שמוטציה הומוזיגוטית באקסון 1 גורמת לאנמיה חרמשית. אסטרטגיות ריפוי חדשניות לתיקון קבוע של מוטציית ה- HBB בתאי גזע המסוגלים להתרחב ולהתפצל לאריתרוציטים המפיקים חלבוני HBB מתוקנים הינן מבוקשות ביותר. עריכה גנטית באמצעות CRISPR/Cas9 וגרעינים מהונדסים אחרים ספציפיים-לאתר היא גישה מבטיחה לתיקון מדויק של מוטציה גנטית בגנום היליד ללא שינויים בחלקים אחרים של הגנום האנושי. למרות שלגרום לגרעין ספציפי-לרצף להגביר תיקונים של מוטציית HBB ספציפית באמצעות תיקון הומולוגיה מכוונת (HDR) הינו תהליך ישיר למדי, התמקדות במוטציות HBB שונות של בטא-תלסמיה היא עדיין מאתגרת מכיוון שיש לבחור ולאמת RNA מדריך אינדיבידואלי וטמפלט DNA תורם עבור ה- HDR של כל סוג מוטציית HBB ספציפית. תוך שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) שנוצרו בגוף של שני חולי בטא-תלסמיה עם מוטציות HBB שונות, תכננו ובחנו אסטרטגיה אוניברסאלית להשגת החדרה ממוקדת של HBB cDNA באקסון 1 של גן ה- HBB באמצעות Cas9 ושני RNA מדריכים תקפים. מצאנו כי הפקת חלבון ה- HBB שוחזרה באריתרוציטים שנוצרו מה- iPSCs של שני החולים. אסטרטגיה זו של שחזור הביטוי הגנטי הפונקציונאלי של HBB תאפשר לתקן את רוב הסוגים של מוטציות ה- HBB בבטא-תלסמיה והאנמיה החרמשית.

חשיבות

אנו מציגים אסטרטגיה אוניברסאלית להכוונת החדרה ממוקדת של HBB cDNA באקסון 1 של גן ה- HBB האנדוגני באמצעות Cas9 ושני RNA מדריכים תקפים. אנו צופים כי אסטרטגיה זו תאפשר תיקון של רוב סוגי המוטציות של HBB ותשחזר את הביטוי הגנטי הפונקציונאלי של גן ה- HBB לצורך טיפול בבטא-תלסמיה ואנמיה חרמשית. קרוב לוודאי כי ניתן בנוסף ליישם אסטרטגיה זו בפיתוח אסטרטגיות ריפוי גנטיות לטיפול בסוגים אחרים של מחלות מונוגניות רצסיביות.

מבוא

בטא-תלסמיה ואנמיה חרמשית (SCD), שתיים מהמחלות הגנטיות הנפוצות ביותר, נגרמות בשל מוטציות בגן ה- HBB המקדד את הצורה הפוסט-נטאלית של תת-יחידת הבטא של ההמוגלובין. לאחר הלידה, הטטראמרים ההמוגלוביניים מכילים שתי תת-יחידות אלפא ושני בטא-גלובינים המקודדים על ידי ה- HBB המתבטא נאו-נטאלית ולאחר מכן. לפני כן, הבטא-גלובינים מקודדים על ידי אחד משני גני ה- HBG המתבטאים במהלך השלב העוברי ולרוב מושתקים לאחר הלידה. בעוד שמוטציה נקודתית בקודון 6 (GAG > GTG המובילה להחלפה של חומצה גלוטמית בחומצת אמינו ולין) בגן ה- HBB יוצרת תכונת SCD, קיימות מוטציות שונות ב- HBB המובילות לירידה או העלמות של חלבון HBB וגורמות לבטא-תלסמיה המתחילה בילדות. מעל 200 סוגים שונים של מוטציות בגן ה- HBB זוהו אצל אנשים החולים בבטא-תלסמיה, היכולות להימצא בכל אחד מ- 1600~ ממקטעי ה- DNA הדו-בסיסיים (bp) המכילים את שלושת אקסוני הקידוד, אתרי השחבור, ואלמנטים אחרים של ויסות. חולים עם מוטציות בשני האללים של HBB המפחיתות באופן משמעותי את ייצור חלבון ה- HBB (הנקראות בטא-תלסמיה מז’ורית או אנמיית קולי (Cooley)) סובלים מאנמיה חמורה ואב-נורמאליה שלדית, תמותה גבוהה או תוחלת חיים קצרה במידה והם אינם זוכים לטיפול. באופן דומה, חולים הנושאים את שני העותקים של מוטציית ה- HBB SCD, או מוטציית SCD הטרוזיגוטית יחד עם עותק של מוטציית בטא-תלסמיה חמורה, ייצרו חלבון HBB בלתי-תפקודי הפוגע בתפקודי ההמוגלובין.

למרות שעירוי כרוני של תאי דם אדומים ומולקולות קטנות מסוימות משפר את הסימפטומים של חולי SCD ובטא-תלסמיה, רצוי מאוד לפתח תרופה המטפלת במחלות מונוגניות אלו הנובעות ממוטציות בגן ה- HBB. השתלת מח עצם (BMT) תוך שימוש בתאי גזע המטופוייטיים (HSCs) מתורם אלוגני עם גן-בר HBB נחקרה במהלך העשורים האחרונים לצורך טיפול בבטא-תלסמיה ו- SCD. למרות הצלחה מסוימת, טכנולוגיית ה- BMT היא מוגבלת בשל מחלת שתל-מול-מאכסן ומחסור בתורמים בעלי התאמה אימונולוגית שאינם קרובים של החולה. הגישה החלופית היא החדרת עותק פונקציונאלי של גן HBB ל- HSCs של החולה ולאחר מכן ביצוע BMT. בעשורים האחרונים, החוקרים בתחום הצליחו להתגבר על מכשולים רבים בהחדרה יעילה של עותק פונקציונאלי של גן ה- HBB ex vivo לתוך HSCs אנושיים, המתביית לתוך מח העצם של החולה, מתמיין לאריתרוציטים ומבטא רמה גבוהה של גן ה- HBB המוסף. כיום, הגישה המפותחת ביותר של ריפוי גנטי עבור טיפול בבטא-תלסמיה ו- SCD נשענת על שימוש בוקטורי לנטי-וירוס בהחדרה גנומית הנושאים את ה- HBB או רצף קידוד HBG קשור (CDS) יחד עם אלמנטים מווסתים קצרים, תוך החדרה קבועה שלהם לגנום של ה- HSCs האוטולוגיים. בעוד שמבחנים קליניים מתמשכים ייקבעו בסופו של דבר את האיזון של היעילות והסיכונים של הטיפול בבטא-תלסמיה ו- SCD, האופי הבלתי-נשלט של החדרת וקטורי לנטי-וירוס המעדיפה אזורי קידוד מהווה תמיד גורם סיכון פוטנציאלי, במיוחד בטווח הארוך. בשנים האחרונות, מדענים בתחום מתמקדים בעריכה גנטית מדויקת באמצעות HDR של מוטציות ה- HBB, תהליך הנמצא בבדיקה מאז 1985 אך עם יעילות נמוכה ביותר (10-6).

ההתפתחויות האחרונות בתחום הגרעינים המהונדסים המבצעים שבר DNA דו-גדילי (DSB) משפרות באופן ניכר את יכולתנו להשיג HDR וצורות אחרות של תיקון ורה-קומבינציה של DNA בתאים אנושיים שלא עברו טרנספורמציה. בנוסף, הזמינות של תאי גזע נצחיים (immortal) הנושאים מוטציות HBB עם יכולת להתמיין לאריתרוציטים מאיצה באופן משמעותי את הפיתוח של תיקון פונקציונאלי של מוטציות HBB. מ- 2008, ניתן להפיק iPSCs תוצרת-אדם מחולי בטא-תלסמיה ו- SCD בעלי מוטציות HBB ייחודיות. מאז, גרעינים מהונדסים כמו גרעיני אצבעות-אבץ (zinc finger nuclease, ZFN), גרעיני אפקטור דמויי מעודדי-שעתוק (transcription activator like effector nuclease, TALEN), ומערכות CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) פותחו גם הם לצורך הגברת ה- HDR ועריכה גנומית מדויקת על מנת לתקן מוטציות HBB ב- iPSCs. למרות שיעילות ה- HDR היא עדיין נמוכה יחסית (< 1%) בתאים ללא-טרנספורמציה, ניתן לבחור, לאפיין ולהרחיב שיבוטים נדירים של iPSCs לאחר תיקון גנטי בתיווך HDR. בעזרת גרעינים תקפים המתמקדים במיקומים ספציפיים של מוטציות HBB שונות, הושגו תיקונים גנטיים מדויקים של מוטציית ה- SCD הנקודתית באקסון 1, מחיקת ה- TCTT באקסון 2, או מוטציית ה- IVS2-654 באינטרון 2 לאחר שסופקה תרומת טמפלט DNA ספציפית עבור כל אחד מהסוגים של מוטציית ה- HBB. הנוחות והאיתנות של מערכת ה- CRIPSR/Cas9 הפכה לבחירה המועדפת בשנים האחרונות לביצוע DSB ספציפי בלוקוס ה- HBB והשגת HDR לתיקון מוטציית HBB גנטית ספציפית.

עבור יישומים עתידיים של תיקון מוטציות HBB שונות, רצוי לפתח אסטרטגיה אוניברסאלית לתיקון למעלה מ- 200 הסוגים השונים של מוטציות HBB באמצעות שימוש ב- RNAs CRISPR מדריכים תקפים וטמפלט DNA תורם אחד לשם ביצוע ה- HDR. לשם הוכחת ההיתכנות, פיתחנו אסטרטגיה של שימוש בשני RNAs מדריכים תקפים (המתמקדים באקסון 1 של ה- HBB ובאזור ה- 3′ הלא-מתורגם (UTR)) וטמפלט DNA המספקים את כל ה- CDS של ה- HBB. באופן זה, אירוע HDR ליד ה- RNA המדריך יספק תיקון פונקציונאלי של מוטציות ה- HBB לא רק באקסון 1, אלא גם באקסון 2 ו- 3 או באתרים אחרים במורד הזרם. השתמשנו בקווי iPSC משני חולי בטא-תלסמיה תלויי-עירוי עם מוטציות HBB באקסון 2 ואינטרון 2 וכמו גם מוטציה באקסון 1 בכדי לבחון אסטרטגיה אוניברסאלית חדשה זו. על מנת לאפשר מצג פשוט, קישרנו גן מדווח GFP במורד הזרם ל- cDNA המקדד של HBB דרך פפטיד ביקוע-עצמי 2A כך שביטוי GFP הדיווח יצביע על ביטוי ה- HBB מאותו תעתוק ופרו-פפטיד. הנתונים שלנו מראים כי גישה אוניברסאלית זו מאפשרת לתקן מגוון של מוטציות HBB ולשחזר את ייצור חלבון ה- HBB. בנוסף, גישה זו מספקת מערכת ניסיונית לסינון מולקולות ביו-אקטיביות ולשפר את ביטוי חלבון ה- HBB באריתוריציטים שהופקו מ- iPSCs המבוסס על ביטוי משותף של ה- GFP המדווח.

חומרים ושיטות

קווי ה- iPSC של הבטא-תלסמיה, BH1 ו- BH2, נוצרו באמצעות מתודולוגיה של תנאי תרבית נטולת הזנה ונטולת xeno כפי שתואר במחקרים קודמים. לזמן קצר, תאי דם לוויניים חד-גרעיניים (MNCs) נלקחו משני חולי הבטא-תלסמיה המז’ורית תלויי-העירוי בבית החולים Third Affiliated של אוניברסיטת San Yat-Sen בסין, באישורה של ועדת ביקורת האתיקה וההסכמה הפנימית. ה- MNCs תורבתו להרחיב ולהעשיר אריתרובלסטים, ולאחר מכן תוכנתו מחדש באמצעות ביטוי חולף משלושה וקטורים אפיזומיים משופרים המבטאים את ארבעת גורמי יאמאנקה ובנוסף את גן BCL2L1 (BCL-xL). ביום 14 של התכנות מחדש, בוצעה הכתמת פלורסנט חיה של מארקר הפלוריפוטנציה TRA-1-60 על קולוניות ה- iPSC החדשות, והקולניות שנמצאו חיוביות ל- TRA-1-60+ נבחרו ונאגרו לצורך אפיון iPSC נוסף. קווי ה- iPSC המבוססים של הבטא-תלסמיה תורבתו בתווך Essential 8 (E8) על פלטות תרבית-רקמות שצופו עם ויטרונקטין. קו ה- iPSC הנורמאלי BC1 (בתור בקרה נורמאלית) וקו ה- iPSC TNC1 של חולה SCD תורבתו ומוינו באופן דומה. ההתמיינות של ה- iPSCs נוצרה באמצעות גופיפים דמוי-עובריים (EBs) על פלטות 96-well בתווך נטול-הסרום. 14 יום לאחר היווצרות ה- EB וההתמיינות ההמטופוייטית, תאי הגזע/פרוגניטור ההמטופוייטיים CD34+CD45+ (HSPCs) ששוחררו לתווך בתרחיף נאספו ונבחנו. על מנת לייצר iPSC-אריתרוציטים, ה- HSPCs עברו בנוסף התמיינות אריתרואידית (ED) במשך 10 יום והבשלה סופית (T M) במשך 8 ימים נוספים באופן עוקב, כפי שתואר במחקרים קודמים.

ריצוף גנום מלא של קווי ה- iPSC של בטא-תלסמיה

ה- DNA הגנומי משני קווי ה- iPSC שנלקחו מהחולים וה- MNCs המקוריים שלהם בודדו בעזרת ערכת דם ורקמות של DNeasy. הכנת הספריה, בעזרת ערכת TruSeq DNA PCR-free וריצוף גנום מלא על HiSeq X באמצעות אורך קריאה של 2 X 150 bp, עם כיסוי גנום ממוצע של X30, בוצעו במרכז הגנטי של ניו-יורק (NYGC). עימוד הקריאות הראשוני לגנום ההשוואה GRCh37 (hg19) וכמו גם זיהוי משתנים באמצעות GATK בוצעו גם הם ב- NYGC. משתנים לא-שקטים בגן HBB שלקחו חלק בתלסמיה אושרו באמצעות ריצוף סנגר. התוצאות מוצגות בטבלה 1.

טבלה 1: קווי iPSC אנושיים שנוצרו משני חולים הסובלים מבטא-תלסמיה מז’ורית.

התמקדות בגן HBB באמצעות גישת CRISPR/Cas9

בכדי לבצע את עריכת גן ה- HBB האנדוגני, השתמשנו במערכת ה- CRISPR/Cas9 כפי שתואר בעבר. פלסמיד המבטא חלבון SpCas9 אנושי ופלסמיד ביטוי RNA מדריך (gR) נוצרו כפי שתואר בעבר. לאחר מכן, השתמשנו ב- pCas9-GFP המבטא במשותף SpCas9 ו- GFP תחת בקרה של פרומוטר CAG. ה- gR-HBB-a המתמקד ספציפית באקסון 1 של HBB תואר בעבר ומוצג מטה. ה- gR-HBB-UTR השני (5′-AAACTGGGGGATATTATGA-3′) מתמקד ב- 3′ UTR של גן ה- HBB. וקטור תורם המספק טמפלט DNA  דרוש לצורך HDR מבוסס על פלסמיד שתואר במחקרים קודמים, עם מקטעי DNA נוספים שהוחדרו בהרכבת גיבסון. לזמן קצר, היא מכילה זרוע הומולוגית שמאלית (560 bp), זרוע הומולוגית ימנית (880 bp), רצף cDNA מקדד HBB ולאחריו מקשר P2A, מקטע DNA מקדד (e)GFP, וקסטת בחירה פורומיצין-PGK מאגף-IoxP. חילוף שקט בקודון 14 של HBB (לאוצין) מ- CTG ל- TTA מוצג ל- HBB cDNA בוקטור התורם, בכדי למנוע חיתוך מחדש על ידי Cas9 המורכב עם gR-HBB-a המזהה את רצף DNA המטרה הכולל CTG (5′-GTCTGCCGTTACTGCCCTGT-3′). רצפי ה- DNA הרלוונטיים של וקטור התורם (HBB-GFP-PGK-puro-V2) מוצגים כמידע תומך באיור S1.

התמקדות גנטית במספר קווי iPSC אנושיים בוצעה כפי שתואר בעבר. לזמן קצר, שני מיליון iPSCs עברו הרחפה מחדש בתוך תמיסת תאים ראשונית 100 μl P3 ועורבבו עם 10 μg DNA המכיל כמויות זהות של 4 פלסמידים (2.5 μg עבור כל אחד משני ה- RNAs המדריכים, pCas9-GFP, ווקטור התורם), ולאחר מכן עברו אלקטרופורציה באמצעות 4D nucleofector. המיקומים של הרה-קומבינציה ההומולוגית אומתו על ידי PCR בעזרת פריימר L1-F ו- L1-R בטרמינל 5′ ו- L2-F ו- L2-R בטרמינל 3′. תרביות ה- iPSC החיוביות עם אירוע HDR זוהו על ידי PCR גנומי בעזרת פריימר gDNA-75-F ו- gDNA363-R. בכדי לעקוף את קסטת בחירת הפורומיצין-PGK מאגף-IoxP, ה- iPSCs האנושיים עברו טרנספקציה עם הפלסמיד pCAG-Cre-IRES2-GFP, כפי שתואר בעבר. לאחר 3 ימים של טרנספקציה, תאי ה- GFP החיוביים נבחרו באמצעות מיון תאים מופעל-פלורסנט על FASCAria II. התאים הונחו בפלטות בצפיפות נמוכה לצורך בחירת שיבוטים. שיבוטים אינדיבידואליים נבחרו ועברו סריקה לצורך אקסיזיה על ידי PCR גנומי באמצעות פריימר L2-F ו- V4193-R. הקולוניות החיוביות עם אקסיזיה אושרו בנוסף על ידי ריצוף סנגר. רצפי הפריימר הרלוונטיים מוצגים בטבלה S1.

ריצוף עומק מבוסס-MiSeq של 0ff-targets משוערות על ידי ה- HBB RNA המדריך השני ב- iPSCs

הספציפיות של ה- RNA המדריך השני gR-HBB-UTR המתמקד ב- HBB 3′ UTR וייתכן שגם במועמדי off-target אחרים (OTC) בגנום האנושי עברה תיקוף בדומה למדריך RNA הראשון gR-HBB-a, עם שינויים קלים. רשימת הרצפים של HBB המטרה ו- 19 מיקומי ה- OTC הראשונים בחיזוי-אלגוריתם מוצגים בטבלה S2. נתוני ה- MiSeq של יעילות החיתוך והספציפיות ב- iPSCs אנושיים מסוכמים באיור S2A. מידע נוסף לגבי ה- MiSeq מוצג גם הוא במידע התומך (supporting information).

אימונוציטוכימיה

ביום 14 של התכנות מחדש, תרביות ה- iPSC עברו אינקובציה ישירה עם נוגדן פלורסנטי צמוד (R-PE) TRA-1-60 אנושי (דילול 1:10) בתווך E8 במשך שעה אחת. לאחר שטיפה יסודית עם תמיסת מלח עם חוצץ-זרחן (PBS), ההכתמה החיה נבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי.

יצירת טרטומה בתור מתווה פלוריפוטנציה in vivo

עכברי NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) נלקחו ממעבדות Jackson. ניסויי בעלי החיים אושרו על ידי IACUC בבית הספר לרפואה Johns Hopkins. הטיפול בבעלי החיים בוצע בהתאם להנחיות המוסד. ה- iPSCs טופלו עם TrypLE על מנת ליצור תרחיפים חד-תאיים לפני הבדיקה in vivo על ידי יצירת טרטומה. התאים (5 X 106) עורבבו עם Matrigel (5 mg/ml) בנפח סופי של 50 μl, והוזרקו תוך-שרירית לגפיים האחוריות של עכברי NSG בני 8 שבועות. העכברים הוקרבו 8 שבועות לאחר זריקת ה- iPSC. הטרטומות נאספו, קובעו למשך 24 שעות בפורמלין עם חוצץ 10% ולאחר מכן נבחנו על ידי תהליך היסטולוגיה הטמעת-שעווה שגרתי. חתכי פראפין בעובי 5 μm הוצבו על שקופיות והוכתמו עם H&G. המורפולוגיות האופייניות של האנדורם, מזודרם ואקטודרם נצפו בעזרת מיקרוסקופ (הגדלה X40).

ניתוח PCR כמותי בזמן-אמת

ה- RNA המלא בודד בעזרת ערכת Quick-RNA MiniPrep, כולל טיפול DNase I (נטול RNase) הנועד למנוע זיהום DNA. התעתוקים ההפוכים בוצעו בעזרת מערכת סינתזת גדיל-ראשון SuperScript III בהתאם להוראות היצרן. ה- PCR הכמותי בזמן-אמת בוצע על מערכת PCR זמן-אמת StepOnePlus עם רה-אגנט SYBR Green PCR Master Mix. רמות הביטוי של הגנים הרלוונטיים (OCT4, NANOG, HBB, HBG) כומתו, ודהידרוגנאז גליצראלדהיד-3-פוספאט (GAPDH) שימש בתור הסטנדרט הפנימי עבור נורמליזציה. פריימרי ה- PCR הספציפיים-לגן רשומים בטבלה S1.

ניתוח ציטומטריית זרימה של iPSCs ותאים המטופוייטיים ממוינים

ה- iPSCs האנושיים או EBs-נגזרים עברו דיסוציאציה לתרחיף חד-תאי באמצעות TrypLE ונשטפו עם חוצץ עבור FACS (PBS עם 1% FBS ו- 1 mM EDTA). התאים עברו הרחפה מחדש בחוצץ ה- FACS, ותויגו עם נוגדנים אנטי-אנושיים צמודי-פלורוכרום CD34-APC, CD45-PE, CD45-Brilliant Violet 605, CD235a-Pacific Blue. נוגדני בקרה תואמי-איזוטיפ שימשו לקבוע את הכתמת הרקע. אנוקליאציית האריתרוציטים נאמדה באמצעות הכתמת DRAQ5 (דילול 1:2,000(. על מנת לאפיין iPSCs אנושיים, השתמשנו בנוגדנים האנטי-אנושיים הראשוניים TRA-1-60 ו- SSEA-4. הזיהוי בוצע באמצעות נוגדנים אנטי-עכבריים משניים IgM-Alexa Flour 555 ואנטי-עכבר IgG-Alexa Flour 555. ניתוח ציטומטריית הזרימה בוצע על FACSCalibur או אנלייזר LSR II. ניתוח הנתונים בוצע באמצעות תוכנת FlowJo או FCS Express.

תספיג חלבון (western blotting)

ה- iPSCs והאריתרוציטים ב- TM יום 8 עברו ליזיס עם חוצץ RIPA בנוכחות של קוקטייל מעכב פרוטאז/פוספוטאז. דגימות החלבון טופלו והורצו עם מערכת NuPAGE Bis-Tris Mini Gel בהתאם להוראות היצרן. תספיג החלבון בוצע עם מערכת תספיג יבש Invitrogen iBlot עם זמן הרצה של 7 דקות בתוכנית P3. כדי לזהות ייצור וביטוי חלבון HBB, השתמשנו ב- IgG1 מונוקלונאלי עכברי בתור הנוגדן הראשוני, המזהה HBB באופן ספציפי אך אינו מזהה חלבוני HBG, כפי דווח במחקרים קודמים. בתור בקרת עומס, ביצענו גישוש בתספיג לאחר שימוש בנוגדני GAPDH אנטי-אנושיים. עבור הנוגדנים המשניים ששימשו לזיהוי תספיג החלבון, השתמשנו ב- IgG(H+L) אנטי-עכבר מתויג-פרקוסידאז, או IgG(H+L) אנטי-ארנב, בהתאמה. האותות החיוביים פותחו על ידי רה-אגנט גילוי תספיג חלבון ECL פריימר. רמות ביטוי החלבון כומתו באמצעות תוכנות פוטושופ בהתבסס על אזור הבנד וגווני אפור.

ניתוח סטטיסטי

הניסויים חזרו שלוש פעמים. הנתונים עברו ניתוח סטטיסטי על ידי מבחן t סטודנטי דו-זנבי לא-מזווג. התוצאות מוצגות בתור ממוצעים ± SD. בכל ההשוואות, p < .05 היה הקריטריון למובהקות סטטיסטית.

תוצאות

גזירה ואפיון של קווי iPSC משני חולי בטא-תלסמיה

על מנת לפתח מודלים חדשים וטיפול עבור אנשים החולים בבטא-תלסמיה מז’ורית, גזרנו iPSCs משני חולים הזקוקים לעירוי דם כרוני (טבלה 1). ה- MNCs הלוויניים נלקחו לאחר הסכמה מודעת והורחבו בכדי לחולל אוכלוסיות אריתרוציטים. הם שימשו בכדי לייצר קווי iPSCs אנושיים על ידי ביטוי חולף של שלושה וקטורים אפיזומליים כפי שתואר קודם. קווי ה- iPSC שנגזרו משני חולים אלו, BH1 ו- BH2, הציגו מורפולוגיה אופיינית ומארקרים של תאי גזע אנושיים פלוריפוטנטיים (איור 1). קווי ה- iPSC BH1 ו- BH2 הם גם בעלי קריוטיפ נורמאלי (וגנוטיפים XY ו- XX מאושרים), והם פלוריפוטנטיים על ידי מתווי in vivo  ו- in vitro. ריצוף הגנום המלא מראה כי BH1 iPSCs מכילים את מוטציית קודון 17 (β17) באקסון 1 (AAG > TAG  מוביל לקודון עצירה; rs33986703) ומוטציית השחבור IVS2-654 הממוקמת באינטרון 2 (rs4451549). בנוגע ל- BH2, מצאנו את מוטציית β17 ומוטציית β41-42 באקסון 2 (מחיקת TCTT). אותן מוטציות נמצאו בנוסף אצל ה- MNCs של החולים, בהתאמה. לא מצאנו מוטציות נוספות ב- BH1 ו- BH2 הפוגעות בגדילת התאים או בהתמיינות ההמטופוייטית. שלושת סוגי מוטציות ה- HBB שהתגלו הן בין המוטציות הנפוצות של בטא-תלסמיה בדרום סין, המובילות לסיום מוקדם של חלבון ה- HBB. נתוני הריצוף הם עקביים לפנוטיפים הקליניים של הבטא-תלסמיה של החולים, שהם בדרך כלל תלויי-עירוי. ריצוף סנגר שימש לאמת ולנטר את תרכובות מוטציות ה- HBB ההטרוזיגוטיות הנוכחות בקווי ה- iPSC BH1 ו- BH2 (איור 1D).

תוך שימוש בפרוטוקול הסטנדרטי ליצירת HSPCs ולאחר מכן יצירת ריצוף אריתרובלסטים ואריתרוציטים, בחנו את היכולת של ה- iPSCs BH1 ו- BH2 של בטא-תלסמיה לייצר אריתרוציטים (איור 2A). שניהם הציגו יכולת זהה ליצור CD34 + CD45 + HSPCs לאחר התמיינות של 14 יום, בהשוואה ל- BC1 iPSCs ששימשו לבקרה (איור 2B). לאחר ED (10 יום) והתמיינות סופית (8 ימים נוספים), גם BH1 וגם BH2 יוצרים בנוסף אריתרוציטים חיוביים ל- CD235a (גליקופורין A) ושליליים ל- CD45 (אנטיגן לויקוציט מצוי) (איור 2C). עם זאת, האריתרוציטים שנגזרו מ- BH1 ו- BH2 היו חסרים ביטוי של חלבון HBB (איור 2D). נתונים אלו הם עקביים עם הפנוטיפים תלויי-העירוי של חולי ה- BH1 וה- BH2.

פיתוח גישה אוניברסאלית של הכוונה גנטית ב- HBB

בעוד ששני חולי ה- BH1 וה- BH2 נושאים את מוטציית β17, וניתן לשחזר את ביטוי הגן HBB על ידי תיקון מוטציה נקודתית זו, קיימים חולים רבים עם מוטציית IVS2-654 הומוזיגוטית (באינטרון 2) או β41-42 (באקסון 2), או צורות אחרות של מוטציות HBB המפחיתות באופן חמור את ייצור חלבון ה- HBB. על מנת לפתח אסטרטגיה אוניברסאלית לתיקון מרבית מוטציות ה- HBB הנמצאות בבטא-תלסמיה ו- SCD, בחנו את התרשים המוצג באיור 3A. בקצרה, פיתחנו אסטרטגיה להשגת HDR באקסון 1 של לוקוס ה- HBB עם החדרה מכוונת של cDNA המקדד HBB, תוך שימוש ב- RNA מדריך תקף שבו השתמשנו לפני כן כדי להתמקד במוטציית הנקודה של SCD (קודון 6) עם רמה גבוהה של ספציפיות ושל יעילות. באופן זה, חולים עם מוטציות HBB באקסון 1, אינטרון 2, או אקסון 3 בשני האללים ייהנו מההחדרה המכוונת של ה- HBB CDS בדומה לחולים עם מוטציות אקסון 1 בשני האללים. על מנת לאפשר בדיקות של טמפלט DNA תורם אוניברסאלי, הוספנו גן מדווח GFP במורד הזרם ל- HBB CDS (עם קישור באמצעות אלמנט P2A). תכונה נוספת של טמפלט תורם אוניברסאלי זה, הדומה לשימושים קודמים שלנו ושל אחרים, היא קסטת ביטוי נוגדת-פורומיצין המאפשרת בחירה של אירועי HDR נדירים בלוקוס של HBB.

בניסויים הראשוניים, מצאנו שלל אירועי HDR ב- iPSCs באמצעות טרנספקציה חולפת של פלסמידים המבטאים SpCas9 ו- RNA מדריך (gR-HBB-a) כפי שעשינו קודם בהתמקדות ב- iPSCs של SCD. עם זאת, עם וקטור תורם חדש זה המכיל HBB CDSs בדומה לאקסון 2 ואקסון 3 של לוקוס ה- HBB האנדוגני, מצאנו לעתים קרובות אירועי רה-קומבינציה בלתי רצויים בין התורם לבין ה- HBB האנדוגני באזורים הומולוגניים אלו. על מנת להפטר מאירועים אלו השתמשנו ב- RNA מדריך נוסף המתמקד ב- 3′ UTR מיידית במורד הזרם לקודון העצירה באקסון 3 של HBB (איור 3A). ראשית, בדקנו באופן קפדני את היעילות והספציפיות של gR-HBB-UTR חדש זה ב- iPSCs אנושיים (איור S2A במידע התומך) בדומה למה שעשינו לפני כן עם ה- RNA המדריך gR-HBB-a באמצעות מתווה טרנספקציה חולף ב- iPSCs אנושיים ואחריו ריצוף עמוק. באמצעות אסטרטגיית התמקדות ב- HBB משופרת זו, השגנו שיבוטים משני קווי ה- iPSCs של החולים וקו iPSC בקרה BC1: או באמצעות החדרה (והחלפה של ה- DNA הגנומי) רק באלל אחד של לוקוס ה- HBB (כמו  BC1-HBB-GFP #6, BH1-HBB-GFP #2, BH2-HBB-GFP #11), או בשני האללים (BC1-HBB-GFP#8), כפי שניתן לראות באיור 3B. שיבוטי iPSC נבחרים אלו הורחבו ואופיינו על מנת לאשר את ההחדרה המכוונת באמצעות טכניקות מולקולה סטנדרטיות. האפיונים כוללים את האימות של אירוע HDR רצוי באותם שיבוטים באמצעות הגברת PCR ספציפית וריצוף בשני הצמתים של ההחדרה המכוונת (איור S3, מידע תומך). הסרנו את קסטת בחירת הפורומיצין המאוגפת על ידי שני אתרי ה- IoxP באמצעות פלסמיד המבטא באופן חולף Cre בקווי iPSC נבחרים (איור 3A). השיבוטים של קווי iPSC נבחרים עם מחיקת קסטת בחירת הפורומיצין זוהו בנוסף (איור 3C). באמצעות אפיון נוסף של מועמדים, זיהינו שיבוטי iPSC כמו BH1-HBB-GFP-#2 או BH2-HBB-GFP-#11, שהם בעלי החדרה מכוונת באלל בודד לשם תיקון מוטציית ה- β17 (איור 3D). בדומה, השגנו שיבוטי BC1 iPSC עם החדרה של רצף HBB-GFP באלל אחד או בשני האללים של לוקוס ה- HBB. בנוסף, אישרנו כי לא התקיימו שינויי רצף ב- 19 אתרי ה- OTC האפשריים העשויים לגרום ל- DSB בתיווך gR-HBB-UTR (איור S2B, מידע תומך).

איור 1: אפיון תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) שנגרמו מ- BH1 ו- BH2 שנוצרו מחולי בטא-תלסמיה מז’ורית. A) הכתמת תאים חיה של iPSCs ביום 14 של התכנות מחדש תחת תנאי תרבות נטולי הזנה ונטולי xeno. תרביות ה- iPSC עברו אינקובציה עם TRA-1-60-PE אנטי-אנושי באינקובאטור תרבית תאים במשך שעה אחת. ההדמיות המייצגות של ההכתמה החיה הושגו באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי. מורפולוגיות התרביות נצפו באמצעות פאזת אור (גודל בר = (100 μm. B) קולוניות תא חיוביות iPS של הכתמת TRA-1-60 חיה נאספו ונאגרו על מנת לבסס את קווי תא iPS האנושיים BH1 ו- BH2. ה- iPSCs הורחבו על פלטה מצופה ויטרונקטין בתווך E8. המארקרים של תאי הגזע הפלורפוטנטיים, TRA-1-60 ו- SSEA-4, נמדדו באמצעות ציטומטריית זרימה ומוצגים בהיסטוגרמות. הקווים השחורים מייצגים בקרה של נוגדנים תואמי-איזוטיפ. C) ניתוחי PCR כמותיים בזמן-אמת של ביטוי הגנים OCT4 ו- NANOG ב- iPSCs BH1 ו- BH2. רמות הביטוי הגנטי היחסיות עברו נורמליזציה באמצעות גן התחזוקה GAPDH. ה- iPSCs BC1 שימשו לבקרה. D) מוטציות הגן HBB ב- iPSCs BH1 ו- BH2 אושרו באמצעות ריצוף סנגר של ה- DNA. מוטציות β17 ו- β-thal654 זוהו ב- iPSCs BH1 בעוד שמוטציות β17 ו- β41-42 זוהו ב- iPSCs BH2. GAPDH: דהידרוגנאז גליצראלדהיד-3-פוספאט.

אפיון שיבוטי iPSC ערוכים עבור ביטוי גנים מדווחים HBB ו- GFP

ראשית, מיינו את קווי ה- iPSC BC1 המותאמים עם אלל ה- HBB-GFP לאריתרוציטים כפי שעשינו קודם עם זן הבר של BC1 iPSC (איור 4(. לאחר התמיינות 3-שלבים סטנדרטית שנמשכה 32 יום, חוללנו רמה דומה של אריתרוציטים שביטאו CD235a (> 84%). באמצעות ניתוח FACS, קו ה- iPSC BC1-HBB-GFP #6C2 בעל עותק בודד של אלל ה- HBB-GFP הציג תאי GFP+ ב- 24%, בעוד ששיבוט ה- BC1-HBB-GFP-#8C8 בעל שני עותקים של אלל ה- HBB-GFP הציג תאי GFP+ ב- 35% (איור 4A). ניתוח אוכלוסיות תא ממוינות המבוסס על ביטוי של GFP, המיועד לשמש כמדווח עבור ביטוי HBB, הראה כי אוכלוסיית ה- GFP+ מועשרת עבור ביטוי גנטי של HBB (איור 4B). באופן מנוגד, תאי GFP- מועשרים לביטוי גנטי של HBG. כמעט כל תאי ה- GFP+ ביטאו CD235a אך היו חסרים אנטיגן לויקוציט CD45. בנוסף, רוב תאי ה- GFP+ הם בעלי הכתמת DNA פחותה בהרבה המשקפת תהליך אנוקלאציה אקטיבי. נתונים אלו מראים כי iPSCs עם אלל HBB מהונדס (cDNA) המזווג לגן GFP אכן גרמו לביטוי GFP באריתרוציטים ממוינים סופית כפי שתוכנן.

בנוסף, ניתחנו את השיבוטים הנבחרים של ה- iPSCs BH1 ו- BH2 הנושאים עותק בודד של רצף ה- HBB-GFP המחליף את אלל הבטא-תלסמיה המוטנטי. לאחר ההתמיינות הסופית (TM) המחוללת אריתרוציטים, מצאנו אוכלוסיות תאים המבטאות CD235a ברמה גבוהה (איור 5A). ניתחנו את חלבון ה- HBB באופן ישיר באמצעות תספיג חלבון, תוך שימוש ברמות של חלבון התחזוקה GAPDH בדגימות שונות בתור בקרת עומס (איור 5B). האריתרוציטים הממוינים מה- iPSCs ההוריים BH1 ו- BH2 שנגזרו משני חולי בטא-תלסמיה מז’ורית לא הציגו ייצור חלבון HBB גם לאחר יישום אותו תהליך TM (איור 5B, 5C). עם זאת, ייצור חלבון ה- HBB משחוזר בתאי ה- BH1 ו- BH2 המתוקנים (עם אלל ה- HBB-GFP).

איור 2: התמיינות אריתרוציטים של iPSCs BH1 ו- BH2. A) שרטוט דיאגראמי של תהליך ההתמיינות. על מנת לחולל תאי דם אדומים, ה- iPSCs עברו 3 שלבים של התמיינות ,spin-EB התמיינות אריתרואידים, והבשלת אריתרוציטים סופית בתנאי תרבית נטולי הזנה ונטולי xeno. B) ניתוחי ציטומטריית זרימה של תאי גזע/פרוגניטור המטופוייטיים (CD34+CD45+) ביום 14 של EB. C) ניתוח ציטומטריית זרימה של אריתרוציטים (CD235a+CD45-) ביום 8 של TM. נגזרות ההתמיינות מ- iPSCs BC1 שימשו לבקרה. D) תספיג חלבון לזיהוי חלבוני HBB של אריתרוציטים מ- iPSCs שונים לאחר התמיינות סופית. ה- GAPDH שימש לבקרת עומס. מסלול 1: BC1, מסלול 2: BH1, מסלול 3: BH2, מסלולים 4,5: שני קווי iPSC אחרים המשמשים לבקרה. EB: גופיפים דמויי-עובר. GAPDH: דהידרוגנאז גליצראלדהיד-3-פוספאט. iPSCs: תאי גזע פלוריפוטנטיים.

דיון

במאמר זה, אנו מתארים אסטרטגיה אוניברסאלית לתיקון מוטציות HBB בקווי iPSCs אנושיים הנגזרים מחולי בטא-תלסמיה תלויי-עירוי, על ידי השגת החדרה מכוונת בקצה ה- 5′ של האקסון הראשון וביטוי אורך מלא של HBB cDNA. אסטרטגיה אוניברסאלית זו מאפשרת לא רק תיקון של מוטציות HBB באקסון הראשון (כמו מוטציות SCD ו- β17) אלא גם מוטציות במורד הזרם באקסון 2, אינטרון 2, ואקסון 3 הנמצאות בחולי בטא-תלסמיה. במחקר זה, השתמשנו ב- RNA המדריך התקף שבו השתמשנו לפני כן לתיקון מוטציית ה- SCD הנקודתית בקודון 6, כך שאסטרטגיה אוניברסאלית זו אמורה להיות מועילה גם עבור חולים עם מוטציות SCD בודדות או כפולות. עם RNA מדריך המכוון לרצף HBB DNA במעלה הזרם באקסון 1 (כולל 5′ UTR) או אפילו ברצף האינטרה-גני 5′ לאקסון 1, ניתן יהיה ליישם אסטרטגיה זו עבור רוב המוטציות הנמצאות אצל חולי בטא-תלסמיה ו- SCD, אם לא כולן. למרות שהתמקדנו ב- iPSCs של בטא-תלסמיה משני חולים במחקר זה, השגנו בנוסף תוצאות דומות תוך שימוש באותו DNA תורם ו- RNAs מדריכים ב- TNC1 iPSCs שנגזרו מחולה SCD.

ניתן לשער כי iPSCs אנושיים והנגזרות ההמטופוייטיות יספקו מקור תאים בלתי נדלה לריפוי תאים אוטולוגי עבור חולי בטא-תלסמיה ו- SCD באמצעות שתי אסטרטגיות מובחנות. באסטרטגיה הראשונה, נדרש לחולל HSPCs ברי-השתלה מ- iPSCs מתוקני גנים, המסוגלים לחולל אריתרוציטים במח העצם עבור חלבוני HBB פונקציונאליים תהליכית וארוכי טווח באריתרוציטים במחזור הדם. למרות שנערכו מחקרים נרחבים במהלך העשורים האחרונים, טרם נמצאה שיטה איתנה וברת-שחזור לייצור HSPCs ארוכי טווח וברי-השתלה מ- iPSCs אנושיים בנוסף לתאי גזע עובריים. מצב זה נובע בחלקו ממחסור בתנאי תרבית לשם הרחבת HSPCs ברי-השתלה, בין אם הם מגיעים מדם טבורי פוסט-נטאלי ומח עצם בוגר או iPSCs אנושיים. האסטרטגיה השנייה היא לייצר אריתרוציטים ex vivo מ- iPSCs אנושיים אוטולוגיים, ולאחר מכן להחדירם באמצעות עירוי לחולים תלויי-אינפוזיה. למרות ההתקדמות האחרונה בהגברת היעילות של אנוקלאציה וייצור HBB מאריתרוציטים הנובעים מ- iPSCs, עדיין נדרשים שיפורים נוספים על מנת להפוך גישה זו לרלוונטית מבחינה קלינית. כיום, הרמה של ביטוי ה- HBB באריתרוציטים הנגזרים מ- iPSCs היא כ- 10% מביטוי ה- HGB האנדוגני, או של זה באריתרוציטים מ- HSPCs פוסט-נטאליים לאחר התמיינות סופית. מערכת הכוונת הגנים שפותחה במחקר זה עשויה לסייע בנוסף לסרוק מולקולות ביו-אקטיביות או תנאי תרבית המגבירים את ייצור ה- HBB, על ידי ניטור רמת ה- GFP בביטוי משותף. אסטרטגיה זו של שימוש בביטוי גן מדווח תחת בקרה של לוקוס HBB או HBG שימשה בעבר בקו תאים K562 (המבטא HBG אך לא חלבוני HBB). לפי גישה זו, זוהו מספר מולקולות קטנות, המעודדות ביטוי גנטי של HBB ו- HBG. עם זאת, המחקר הנוכחי שלנו מציג את המקרה הראשון שבו אריתרוציטים אנושיים פונקציונאליים המבטאים גם HBB וגם GFP מדווח מקושר גנטית (אמנם ברמה נמוכה יחסית) ניתנים לייצור באופן עקבי ובכמויות גדולות. אנו מתכוונים להשתמש באריתרוציטים המסומנים ב- HBB-GFP על מנת לקבוע האם המולקולות הקטנות שזוהו בעבר יכולות לשפר את ייצור ה- HBB והאנוקלאציה באמצעות אריתרוציטים הנגזרים מ- iPSCs.

איור 3: עריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 של גן ה- HBB האנושי על ידי ה- cDNA שלו. A) דיאגראמה של אסטרטגיה להחלפת ה- DNA הגנומי של HBB ב- CDS שלו עם קישור על ידי פפטיד ביקוע-עצמי P2A עם הגן GFP המדווח. שני ה- RNAs המדריכים, gR-HBB-a ו- gR-HBB-UTR, מיועדים להתמקד באקסון 1 ו- 3′ UTR של גן ה- HBB, בהתאמה. הווקטור התורם המכיל HBB CDS, L-HA ו- R-HA עבר טרנספקציה לתוך תאי גזע פלורפוטנטיים שנוצרו על ידי BH1, BH2 או BC1 (iPSCs) יחד עם ווקטורים של RNA מדריכים ווקטור Cas9. הקולוניות החיוביות עם תיקון הומולוגיה מכוונת (HDR) זוהו באמצעות PCR גנומי תוך שימוש בפריימרים מזוהים באיור S3 במידע התומך. בשלב הבא, ה- iPSCs הערוכים עברו טרנספקציה עם פלסמיד pCAG-Cre-IRES2-GFP על מנת לבצע אקסיזיה בקסטת הביטוי של PGK-פורומיצין באיגוף-IoXP. הקולוניות החיוביות עם האקסיזיה הצפויה זוהו באמצעות PCR גנומי תוך שימוש בפריימר L2-F ו- V4193-R. B) סריקת PCR גנומית עבור קולוניות חיוביות ל- HDR (הומוזיגוטיות או הטרוזיגוטיות) באמצעות פריימר gDNA-75-F ו- gDNA363-R. לוקוס זן הבר של HBB הוביל ליצירת לתוצר PCR 438 bp (WT) בעוד שהלוקוס הערוך והמתוקן יהיה תוצר 306 bp PCR בשל היעדר האינטרון (132 bp) ב- cDNA התורם. C) סריקת PCR גנומית עבור אקסיזיה של קסטת ה- PGK-פורומיצין באמצעות פריימר L2-F ו- V4193-R. קולוניות המטרה ללא אקסיזיה (כמו BC1, #6) הובילו ליצירת תוצר 952 bp PCR בעוד שהקולוניות החיוביות עם אקסיזיה לא הובילו ליצירת תוצר PCR ספציפי. D) ריצוף סנגר לצורך אישור תיקוני ה- HBB ב- iPSCs BH1 ו- BH2. השינוי השקט של β14 (לאוצין) מ- CTG ל- TTA, בנוסף ל- β17 המתוקן (AAG), נצפה בשיבוטי iPSCs נבחרים של BH1 ו- BH2. Bp: זוג בסיסים. CDS: רצף קידוד. L-HA: זרוע הומולוגית שמאלית. R-HA: זרוע הומולוגית ימנית. WT: זן בר.

איור 4: ביטוי ה- GFP תחת בקרה של לוקוס ה- HBB מאריתרוציטים הנגזרים מ- iPSCs לאחר ערכיה גנומית. A) היסטוגרמה של ניתוחי ציטומטריית זרימה באריתרוציטים ממוינים סופית מ- iPSCs ערוכים גנומית של BC1. תאי BC1 עם אינטגרציה הטרוזיגוטית של האלל HBB-GFP (#6C2) או אינטגרציה הומוזיגוטית (#8C8) יושמו, יחד עם BC1 iPSCs הוריים. B) ניתוחי PCR כמותיים בזמן-אמת של הביטוי הגנטי של HBB ו- HBG. תאים חיוביים ושליליים ל- GFP בודדו באמצעות מיון תאים מופעל-פלורסנט ביום 8 לאחר ההתמיינות הסופית. רמות הביטוי הגנטי היחסיות עברו נורמליזציה באמצעות גן התחזוקה GAPDH. C) ניתוחי ציטומטריית זרימה של ביטויי מארקר אחרים בתאי ה- GFP החיוביים מול השליליים ביום 8 של ההתמיינות הסופית של #6C2 iPSCs. גם CD235a וגם CD45 שימשו לאפיון האריתרוציטים. דיו פלורסנטי DRAQ5 מכתים-DNA שימש לאמוד אנוקלאציה של אריתרוציטים החסרים DNA גרעיני.

איור 5: ביטוי חלבון HBB באריתרוציטים מה- iPSCs עם תיקון HBB BH1 ו- BH2. A) היסטוגרמה של ניתוחי ציטומטריית זרימה של אריתרוציטים מה- iPSCs BH1, BH2 ו- BC1 מכווני גן HBB ביום 8 של TM. ייצור יעיל של אריתרוציטים הודגם על ידי אחוז גבוה של תאים המבטאים CD235a ואחוז נמוך של תאים המבטאים CD45. B) תספיג חלבון של ביטוי HBB באריתרוציטים ביום 8 של TM. ביטוי הבטא-המוגלובין הפגום באריתרוציטים המגיעים מ- iPSCs של חולי בטא-תלסמיה חולץ באמצעות הכוונת גן HBB מונו-אללית (הטרוזיגוטית). ה- iPSCs הלא-ממוינים של כל קו שימשו בתור בקרה שלילית. C) כימות (ממוצע ± SEM) של ביטוי חלבון HBB המבוסס על נתוני תספיג חלבון ממספר רב של ניסויים (n = 3).