A Gain-of-function Polymorphism in a G-protein Coupling
Domain of the Human b1-Adrenergic Receptor*

פונקציית הרווח בצורותיה השונות בתהליך צימוד קולטנים לחלבון G טווח פעילות הקולטן האדרנרגי מסוג בטא1 ממקור אנושי*

(β1AR)  – הקולטן האדרנרגי מסוג בטא1 (β1), הינו התא-מפתח המאותת ומשפעל את החלבון הנמצא בלב ובאיברי גוף אחרים, ומתווך בין פעולות הקטכולאמינים במערכת העצבים הסימפתטית. במחקרים זיהינו פעילות פוליפורמית (“רב-צורתית”) המתרחשת בזנב הציטופלזמי הבין-תאי – קרוב למקטע השביעי הארוך והטרנסממברנלי של ה- β1AR האנושי – בעוקבה של אנשים נורמליים. כמו כן, זיהינו את קיומם של גליצין (Gly) או ארגנין(Arg)  (טווח תדרים אללים של 0.26 ו- 0.74, בהתאם) המייצגים את החומצה האמינית מס’ 389, כך שהראשון מייצג את הקולטן β1AR של זן הבר wild-type באדם. כדי ליצור חיקוי של שני הוריאנטים (“גרסאות”) האלה תוך שימוש במוטגנזה מכוונת, החדרנו קבוצה של קולטנים Gly-389 ו- Arg-389, בתור גורמים גנטיים זרים, אל תאי CHW-1102. במחקרים פונקציונליים אשר כללו צירופים זהים של זנים, קולטני ה- Arg-389 הראו קצת יותר דרגות-בסיס בסולם ה- PH בפעילויות האדנילט ציקלאז (10.7 ± 1.2 לעומת 6.1 ± 0.4 פיקומול/דקה/מ”ג pmol/min/mg). עם זאת, הרמות המקסימליות המושפעות מגירויי איזופרוטרנול, היו גבוהות משמעותית מצד ה- Arg-389 בהשוואה לקולטן Gly-389 (63.3 ± 6.1 לעומת 20.9 ± 2.0 פיקומול/דקה/מ”ג). גם קשרי [35S]גואנוזין 5’-O–(טיו-טריפוספט), עלו עם גדילת מספר קולטני Arg-389 (המצומדים בחוזקה ובעקביות לחלבוני G) ועם הגברת פעילות האדנילט ציקלאז. מחקרים תחרותיים נערכו בתחום האגוניסטים, מבלי לכלול את גואנוזין 5’-(אמידו בטא, גמא) טריפוספט; והתברר שאי אפשר לפרק את הקשר הזיקתי החזק של החומר הזה בעזרת הקולטן Gly-389 וזאת בעוד שהקולטן Arg-389 מעיד על הצטברות של תצמידי-קולטנים (RH = 26%) עם קשר זיקתי חזק לאגוניסט. אפשר להבין משני המקרים האלה כי הוריאציה הפולימורפית הזאת  – המייצגת את השפעת קולטני בטא1 ממקור אנושי על התגובות הדדיות בין קולטני G לבין התפקוד העצבי –  תהיה עקבית במיקומה ביחס לתחום/שטח קשרי חלבון G משוערים. הוריאציה הגנטית של β1AR במקום הזה יכולה לספק את הבסיס להבדלים בין-אישיים במאפיינים הפתופיזיולוגיים או לקיומה של תגובה לאגוניסטים של βAR לצורכי טיפול, וגם בתגובה לאנטגוניסטים מטפלים במחלות לב וכלי דם ומחלות אחרות.

הקולטן (β1AR)1 הוא חלק ממשפחת הקולטנים האדרנרגיים המצומדים לחלבון G, בצירוף אדרנלין (אפינפרין) ונוראדרנלין הנחשבים לאגוניסטים אנדוגניים. הקולטנים המצויינים, כמו שאר הקולטנים ממשפחת-העל של הקולטנים המצומדים לחלבון G, הקצה האמי אצלם הוא חוץ-תאי והחלבון צפוי לחצות קרום התא שבע פעמים, ואילו הקצה הקרבוקסילי הוא תוך-תאי. האגוניסטים של הקולטנים האדרנרגיים, נקשרים בכיס שנוצר על ידי האזורים הטרנס-ממברנליים (חוצי ממברנה), ואילו הקשרים והפעילויות של חלבון G מתרחשים באזורים התוך-תאיים של הלולאות והזנב ובד”כ במרחק קטן מהממברנה (1). הקולטן בטא1 נצמד לחלבון G (הגורם המגרה), וחלבוני ה- G מפעילים את האדניליל ציקלאז, שזה נכון גם לגבי נתיבי תנועה הלא קשורים למולקולת cAMP – כמו הפעלת תעלות יוניות (2). ישנם הרבה צירופים של קולטני β1AR הנקשרים למגוון סוגי תאים, לדוגמה הקרדיומיוציטים המשמשים להגברת האפקט האינטרופי והכרונוטרופי של הלב; דוגמאות אחרות הם האדיפוציטים המשמשים בתווך שומנים מומסים, ותאים ג’קסטה-גלומרולריים בכיליה המווסתים ומבקרים על הפרשת הרנין. במשך עשרות שנים היה ידוע שהריאקציות הללו, כמו גם הריאקציות ל- β2AR, משתנים מעט באוכלוסייה האנושית (3, 4). ואכן, זה מה שקרה: לאחרונה מצאנו ואפיינו צורות מרובות של קולטני β2AR שחוללו שינויים בתכונות הפנוטיפים לעומת קולטן זן הבר (5-7). הממצא הזה קידם אותנו לבחון את רצף הקידוד הגנטי של β1AR, תוך כדי בחינת צורות ודוגמאות מרובות בין אנשים. הצגנו כאן בדווח מדעי מקרה יחיד של פולימורפיזם נוקלאוטידי כגורם להמרה מ- Gly ל- Arg ולהפך, בחומצה האמינית הבין-תאית 389, באזור בטווח פעולה בסיסי עבור הקולטנים המצומדים לחלבון G. הפנוטיפ (צבע עור) המתקבל של הקולטן Arg-389 מבטא קשר-גומלין מועצם (מתוך כל מיני פעולות) מצד קולטני ה- G, המתפקד בעקביות ובהתאם לפעולות אדניליל ציקלאז.

* המחקרים נתמכו על-ידי המכונים הלאומיים למענקי שירותי בריאות (HL52318 ו- HL41496). עלויות הפרסום של מאמר זה שולמו בחלקם, והתשלום נקבע לפי מספר עמודים. מאמר זה חייב לכן להיות מסומן ב- “פרסומת” בהתאם לכותרת מספר 18, לפי חוקי ארה”ב, סעיף 1734, ורק למטרת ציון המידע הזה.

‡ הגופים שצריך לפנות אליהם לצורך התכתבויות: הפקולטה לרפואה באוניברסיטת סינסינטי, שד’ בת’סדה 231, סינסינטי, אוהיו 452670564, טל ‘ 513-558-4831, פקס: 513-558-0835, דוא”ל: Stephen.Liggett@UC.Edu.

1 הקיצורים המופיעים במאמר: βAR (קולטן בטא אדרנרגי), Arg-389 (פולימורפיזם של β1AR בצירוף Arg בחומצה אמינית 389), Gly-389 (פולימורפיזם בצירוף Gly בחומצה אמינית 389), 125I-CYP (125I-labeled cyanopindolol ציאנו-פינדולול עם תווית 125I), Gpp(NH)p (גואנוזין 5’-(אמידו בטא, גמא) טריפוספט), PCR (polymerase chain reaction תגובת שרשרת של פולימראז).

השיטות והחומר המשמשים לצרכי מחקר

מינוח אבחנתי: החוקרים הביעו התעניינות ברצף הגנטי של זן הבר ממקור אנושי, חסר האינטרון הגני β1AR, דבר שדחף את פריילי ועמיתיו לכתוב דיווח מדעי בנושא; (8) (GenBankTM – בנק הגנים, מס’ הצטרפות J03019). בדיווח צוין שהאדנין – של ATG המאתחל את קודי הבלוקים – שימש בתור נוקלאוטיד 1, בעוד שהחומצה האמינית 1 שימשה כמתיונין שעבר קידוד.

טכניקות לזיהוי פולימורפיזם: מאנשים רגילים נאסף מידע גנטי (דנ”א) מהדם או מרקמות בנקאיות, תוך שימוש בטכניקות רגילות (9). המחקר זכה לאישור ועדת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת סינסינטי. אנו שואפים להפיק מתגובות PCR, מוצרים זהים המפוזרים/מתחלקים לאורך 1131 זוגות בסיסים באזור המקודד; ובזה נתחיל להשתמש בנוקלאוטיד מס’ 300 השייך לאזור הטרנס-ממברנלי השני וחוצה את קודון העצירה באזור הלא מתורגם ‘3. סטייה עקבית מהרצף שפורסם צוינה בגרעין 951 בו היה גואנין נמצא בכל הנבדקים במקום אדנין, וככל הנראה, הסטייה מייצגת שגיאת רצף בדו”ח המקורי. שני הקודונים מתמחים בקידוד לאוצין בחומצה האמינית מס’ 317. בגרעין 1165 מצאו את גואנין (“זן הבר”) או ציטוזין (תרשים 1A), שמשנה את החומצה האמינית המקודדת מגליצין לארגנין באתר/הנקודה של החומצה האמינית 389. התחלים (primers) שומשו להארכת המקטע של זוג הבסיס 488, בעוד שהפולימורפיזם (הצירוף) בעמדה 1165 זוהה ככה: 5’-CAGGAAACAGCTATG

CCACTGGAGCCGCCTCTTCGTCTTCTTCAACTG-3’  (חושי) , ו-  5’-TGGGCTTCGAGTTCACCTGCTATC-3’(אל-חושי). תחל החוש מכיל רצף של פריימר קדומני (forward) הנקרא 5’ M13, כך שצבע-יסוד כימי המשתמש בחתל האוניברסלי יכול להיות משמש בתגובות הרצף. מקטעי ה- PCRכללו: קרוב ל- 500 ng של DNA, לכל dNTP בנפח של 62.5 ננומטר, 100 פיקומול לכל פריימר, 0.5 µl של פולימראז (ביוכימיה מולקולרית – רוש Roche Molecular Biochemicals), 10% מהמאגר המסופק ו- 5% Me2SO בנפח סופי של 50 µl. תנאי המחזור התחילו בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואח”כ 98 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך דקה, ו 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת במשך 35 מחזורים, והארכה אחרונה של 72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות בתוך המשכפל התרמי פרקין-אלמר 9600. בשלב הזה נעזרנו בצבע יסוד ליישומי מערכת ביולוגית ברצף אוטומטי. תוצאות המעבר מ- G ל- C בנוקלאוטיד 1165, העידו על ירידה באנזימי BsmF1 באתר ההגבלה של האנדונוקלאז. בזמן עיכול ופירוק החומר (או בלי התהליך הזה) של המוצר PCR המצויין לעיל, בחנו דגימות נוספות של הרצף הגנטי ובצירוף של אנזימי BsmF1 (תרשים 1B).                  

תרשים 1: הבדלים בין-אישיים בצפנים הגנטיים של β1AR בנוקלאוטיד-1165 והחומצה האמינית-389: הקטעים A ו- PCR, שהתווצרו מהדנ”א הגנומי, הסתדרו ברצפים שתוארו מתחת לכותרת “השיטות והחומר המשמשים לצרכי מחקר”. ה- G (בעמדה המצויינת/מסומנת של הקודון 389) הוא הגורמת להיווצרות ה- Gly (רצף שמאלי), בעוד ש- C הוא המקודד את Arg (רצף ימני). מוצגים כאן כרומטוגרמות ייצוגיות שנלקחו משני אנשים הומוזיגוטים עבור שני האללים. הקטעים B ו- PCR התעכלו בעזרת הגורם המגביל אנדוקלאז BsmF1 שאינו יכול לעכל את התוצר Arg-389 בגלל מעבר ה- G ל- C. בתהליך בקרת הומוזיגוטים, אין אנזימים המשתתפים בריאקציה.

טבלה 1

ניתוח פרמטרי הקשירה עבור שני הצירופים האפשריים של β1AR: מבדקי המחקר התנהלו עם תוספת של 100µm איזופרוטרנול; ועוד הוספה של איזופרוטרנול (ISO), נוראדרנלין (NE נוראפינפרין) ואדרנלין (EPI אפינפרין).

מבנים גנטיים וטרנספקציה של תאים: המחקר כלל מוטגנזה מכוונת שהתבצעה בעזרת טכניקות ושיטות שתיארנו מקודם (5) – המטרה היא לחקות את פעילות הפולימורפיזם Arg-389. כל צירופי הדנ”א המשלימים (cDNA) של β1AR ב- GLY-389 ו- Arg-389, נעשו לתת-משובטים אל תוך הויקטור המבטא יונקים pBC12BI (10). החדרנו אל תוך הפיברובלסטים CHW-1102 (תאי CHW), ובאופן קבוע, מבנים מסוג β1AR (של GLY-389 ו- Arg-389), בעזרת משקעים של סידן פוספט כמתואר מקודם (11). שיבוטים חיוביים נבחרו בהתבסס על התנגדות ל- 300 מ”ג / מ”ל G418. הקהילות נשמרו בטמפ’ 37 מעלות צלזיוס עם ריכוז 5% של פחמן-דו-חמצני אטמוספרי, במדיום התמיינות DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) ובצירוף 10% תרכיב/נסיוב של פריסות עגל עוברי, 100 יחידות / מ”ל פניצילין, 100 מ”ג / מ”ל סטרפטומיצין ו -80 מ”ג / מ”ל G418. תאי COS-7 הוחדר לתוכם באופן חולף מבנים של β1AR  ו- Gαs של חולדה, בויקטור pCDNA1 לצורך מחקרים בתחום קשרי/הצמדות [35S]GTPɣ. מדובר בהשתלות חולפות, שכדי ליישם אותן נקטנו בשיטת העברת הגנים DEAE-דקסטרן/כלורוקין כמתואר לעיל (12).

קישור רדיוליגנד: בניסוי הזה ובעזרת התמיסה פוספט בופר סליין, שטפנו את המרקם החד-שכבתי של תאי CHW שלוש פעמים; אח”כ הומסו בעזרת בופר (חיץ) היפוטוני (5 מ”מ טריס, 2 מ”מ EDTA, pH 7.4), מנותק על-ידי מחקן-מגרד (rubber policeman), וצנטריפוג ב 42,000 × גרם למשך 10 דקות. הממברנו הגסות (75 מ”ם טריס, 12.5 מ”מ MgCl2, 2 מ”מ EDTA ודרגת pH 7/4). הניסויים והמבדקים בתחום הקשים/צמדים התנהלו באמצעות 125I-CYP כמתואר (12), עם קשר (הנבחר באקראיות יחסית) אשר קבענו/הגדרנו אותו ע”י החדרת 1 µm פרופרנול. התגובות לניסויים אלה וניתוחים רדיוליגנדיים אחרים הופסקו על ידי דילול וסינון ואקום מעל מסנני סיבי זכוכית. מחקרים מחייבים לתחרות אגוניסט באתר אחד בוצעו עם 40 pM 125I-CYP ו- 100 µm GTP וריכוזים משתנים של איזופרוטרנול, אפינפרין או נוראדרנלין במשך 2 שעות ב 25 מעלות צלזיוס. כדי להעריך קשירת רצפטורים לאגוניסט בעלי זיקה גבוהה ונמוכה, הוכנו ממברנות כמתואר לעיל, למעט שני צנטריפוגים נוספים נכללו לפני הוספת חיץ התגובה כדי להבטיח הסרת ה- GTP האנדוגני. הממברנות הוחדר אליהן ריכוז של 40 pM 125I-CYP ו- 18 ריכוזים של איזופרוטרנול בנוכחות או היעדר ה- GTP אנלוגי GTP (NH) שאינו מונע הידרוליזה במהירות של 100 מ”מ למשך שעה ב- 37 מעלות צלזיוס. נתוני התחרות התאימו לדגמים של אתר אחד ושני אתרים עד טכניקה איטרטיבית פחות ריבועית כפי שתוארה קודם לכן (13). לפי התרשים A ועל סמך חישובים סטטיסטיים, הערכים של המודל בעל שני אתרים, הינם תקפים וזאת כל עוד ההתאמה לפי התפלגות F היא יותר טובה – P < 0.05 – מאשר אם משתמשים במודל עם אתר אחד.

מדידות פעילות האדניליל ציקלאז: בניסוי הזה הממברנות הודגרו תוך שימוש ב- 30 מ”מ טריס, דרגת PH 7.4, ו- 2 מ”מ MgCl2, 8 מ”מ EDTA, µm120 (120 מיקרומטר) ATP, µm60 GTP, 2.8 מ”מ פוספואנולפירובט, µg2.2 (2.2 מ”ג) מיוקינאז, µm100 cAMP ו- µCi1 של [α-32P]ATP, למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כמו שמתואר (11). ה- [32P]cAMP הופרד מ- [α-32P]ATP באמצעות כרומטוגרפיה מעל עמודות אלומינה. הסטנדרד A[3H]cAMP הכלול בבופר החוצץ נועד למלא עמוד ערכי החלמה/התאוששות אצל אדם בודד. הניסוי יושם בצירוף הפריטים הבאים: רכב המורכב מבסיסים/חומרים, האגוניסטים שערכי ריכוזיהם מסומנים, או הוספת 100 מיקרומטר של פורסקולין.

קשרי [35S]GTPɣ: החדרנו את החומרים בעלי השראה גנטית, אל תוך תאי COS ונשטפו שלוש פעמים בעזרת פוספט בופר סליין. אח”כ הומסו בעזרת בופר (חיץ) היפוטוני (5 מ”מ HEPES, 1 מ”מ EDTA, 8 pH), והופרדו על ידי מחקן-מגרד (rubber policeman), ועברו צנטריפוגה למשך 10 דקות בתאוצה של 42,000 × g. הכדוריות הוחזרו מחדש אל אותו הבופר ועברו צנטריפוגשה לשתי פעמים נוספות שני נוספים. קשרי [35S]GTPɣ בוצעו בעזרת שינויים ותיקונים לפי שיטת ביפורט ועמיתיו (14). התגובה כללה ממברנות  10 מ”מ HEPES, pH 7.40, 5 מ”מ MgCl2, 100 מ”מ NaCl, 1 מ”מ חיץ EDTA, בצירוף של 1.0 µm GDP ו- 180 pm של [35S]GTPɣ בצירוף של מים (מצב בסיס), 100 µm של פריטי GTPɣ ללא תווית (כדי להגדיר קשרים לא ספציפייפ), 10 µm איזופרוטרנול למשך 2.5 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. מקטעי [35S]GTPɣ חסרי- קישור, הופרדו בסינון ואקום על גבי מסנני סיבי זכוכית שנשטפו פעמיים בעזרת בופר טריס 10 מ”מ.

ויראציות שונות: ריכוזי החלבון נקבעו בעזרת BCA (Bicinchoninic Assay/חומצה) (15). התאמת העקומה התבצעה בעזרת תוכנת PRISM (גרף-פאד GraphPad, סן דייגו, קליפורניה). השוואות סטטיסטיות בוצעו על ידי בדיקות t (בנפרד או בזוגות), לפי הצורך, תוך התייחסות לחשיבות הערך p < 0.05. הנתונים מוצגים כממוצע (עם שגיאת תקן) ± S.E. של המספר הניסויים הנפרדים.

תוצאות המבדק

אחרי שבחנו את הדנ”א אצל 30 נבדקים, התוצאות העקביות – מתוך קבוצת אנשים מוגדרת ובריאה – הצביעו על הבדלים רק במקום אחד באיזור הספציפי של קולטני בטא1 (ראה תרשים 1). בנוקלאוטיד 1165, שם ניתן היה למצוא גואנין או ציטוזין, והתוצאה Gly או Arg בחומצה אמינית 389. כאשר השתמשנו ב- BsmF1 בתור גורם הגבלת עיכול, ביצענו את הבדיקה על גנוטיפ שנבחן ב- 50 דגימות. בעוד ש- β1AR האנושי מסוג הבר הטבעי דווח בעבר (8) כצירוף של גליצין בחומצה האמינית 389, מצאנו תדירות גבוהה יותר של ארגנין אצל אנשים נורמליים. התדרים היו 0.74 ל- Arg ו- 0.26 עבור Gly.

כדי להחליט אם ה- Rag בעמדה זו סיפק לנו פנוטיפ מובהק בהשוואה לקולטן Gly-389 – אשר קבענו (11) את מאפייניו מקודם בשתיוף פעולה עם חוקרים אחרים (16) – המוטגנזה המכוונת התבצעה בטכניקה המאפשרת לחקות את ה- Arg, ונעזרנו בוקטורים כדי להביע את שני צירופי הדנ”א הספציפיים אצל יונקים. המבנים הסופיים היו זהים למעט נוקליאוטיד אחד בודד. מבנים אלה שימשו להקמה קווים קבועים של תאי CHW שהוחדר אליהם החומר, שהם מבחינה אנדוגנית חסרים צירופים של βAR. כאמור, מחקרים בוצעו על מספר קווים משובטים מכל טרנספקציה (החדרת DNA) ברמות תואמות של צירופי קולטן. מחקרים הקשורים לרדיוליגנד (טבלה 1) חשפו ערכים קבועים המחייבים ניתוקי-קשרים (אי היצמדות) זהים ב- [125ᴦ]CYP. הצלחנו להבין ממבדקי המחקרים בתחום הקשרים המתחרים – בצירוף של איזופרוטרנול, אדרנלין, נוראדרנלין; עם הוספת GTP – שאין כל הבדל בין שני הקולטנים מבחינת הקשר הזיקתי המחייב עם האגוניסט.

תרשים 2: צימוד פונקציונלי בין הקולטנים Gly-389 ו- Arg-389 לאדניליל ציקלאז: הצגנו כאן את התוצאות ממחקרים שהתנהלו בתחום קווי שיבוט המבטאים את כל אחד מהקולטנים ברמות תואמות; והמידע הוצג כפעילויות מוחלטות (A) ונורמלות לגירויים ע”י פורסקולין (B). הוצגו גם התוצאות של מחקרים דומים עם שני קווי שיבוט אחרים המוצגים בגראפים-פאנלים (panels) ב ו- D. ה- Arg-389 הדגים באופן מעשי את התרחשותן של עליות קטנות בפעילויות מצב הבסיס ועליות ניכרות בפעילויות המגורות בעזרת אגוניסט בהשוואה לקולטן Gly-389. למידע מפורט יותר, תעיין בחומר מתחת לכותרת “תוצאות המבדק”. מה שמוצג שם מייצג את התוצאות הממוצעות של ארבעה מחקרים שונים שהתקיימו כל אחד בנפרד אבל כולם פונים לאותו יעד. היעדרותם של קווי שגיאה הוא סימן לכך שהשגיאות הסטנדרטיות היו נמוכות מהסמל התוויתי (plotting symbol).

תרשים 3: קשרי [35S]GTPɣ עבור שני הצירופים של β1AR: הוחדרו החומרים (כפי שמתואר מתחת לכותרת “השיטות והחומר המשמשים לצרכי מחקר”) בתור גורמים גנטיים זרים אל תאי 7-COS. פעולת הקשירה בצירוף של 10 µm איזופרוטרנול, התבצעה ברמה יותר גבוהה (p < 0.05) כאשר נעשה שימוש לקולטן Arg-389 בהשוואה לקולטן Gly-389. כיוון שקיימות ויראציות שונות ובאופן יומי, ברמות המוחלטות של פעולת הקשירה, המידע כאן מוצג כאחוזי רמות קשירה עבור זן הבר של קולטן Gly-389 (הערכים המוחלטים הממוצעים הצביעו על 105 ×7.7 ± 1.4  התפרקויות לדקה/מ”ג (dpm/mg) של Gly-389). לא היו הבדלים ברמות הבסיס של פעולות הקשירה בהשוואה בין שני הקולטנים ; תאים שלא עברו טרנספקציה (nt, nontransfected cells).

הצלחנו לקבוע ולזהות פעילויות של מצב בסיס ושל אדניליל ציקלאז מגורה-פורסקולין, באמצעות ממברנות מתוך קווי שיבוט של Gly-389 בתחום 159 ± 14 fmol / mg ו- Arg-389 בתחום 151 ± 13 fmol / mg (תרשים2A ). כפי שניתן לראות, פעילויות הבסיס היו קצת יותר גבוהות כאשר הצטרף הקולטן Arg-389 בתהליךף יותר מאשר עם הקולטן Gly-389 (10.7 ± 1.2 במקביל ל- 6.1 ± 0.4, pmol / min / mg, n = 4, p < 0.02). עם זאת, ההבדלים המשמעותיים ביותר נצפו בגירוי אגוניסטי. פעילויות מעוררות איזופרוטרנול מקסימאליות היו גבוהים יותר עם הקולטן Arg-389 מאשר עם ה- Gly-389 (63.3 ± 6.1 במקביל ל- 20.9 ± 2.0, pmol / min / mg, n = 4, p < 0.02). באופן דומה, כאשר אנו מייצגים את התגובות כמכפלות של דרגות-בסיס, קולטן Arg-389 ישקף יותר גירוי ים מצד האדניליל ציקלאז מאשר הקולטן Gly-389 (6.1 ± 0.3 במקביל ל- 3.3 ± 0.1). לעומת זאת, גירוי של אדניליל ציקלאז על ידי פורסקולין ובאופן עקבי לא היה שונה בהשוואה בין המסלולים/נתיבים קיימים (11 ± 104 במקביל ל- 10 ± 120, פיקומול/דקה/מ”ג).  לפיכך, אם ננקוט בנורמליזציה של הנתונים במידה של גירוי מצד האדניליל הציקלאז על ידי פורסקולין, עדיין חומרי המטרה נחשפים – יותר מאשר קודם – מצד גירויים אגוניסטיים ה- Arg-389 לעומת צירוף Gly-389 (תרשים 2A). לא נמצאו הבדלים בערכי EC50 (במטרה לגרות את האיזופרוטרנול בעזרת אדניליל ציקלאז) בהשוואה בין קולטני Gly-389 ו- Arg-389 (115 ± 5 לעומת 132 ± 5 nM). תוצאות מתוך מערך מחקרים נוסף שהתבצעו בנפרד ברמות ביטוי גבוהות יותר מוצגות בתרשים 2, C ו- D (הצירוף היה 246 ± 32 ו 255 ± 11 fmol / mg עבור Gly-389 ו- Arg-389, בהתאם). שוב, הגודל המרבי של הגרייה על ידי אגוניסט היה גדול יותר עם הצירוף Arg-389. הצלחנו לצפות בהבדלים בין שני הוריאציות של הקולטנים (מבחינת גירויי האדניליל ציקלאז), גם בתגובת האדרנלין והנוראדרנלין (הנתונים לא מוצגים).

כדי לחקור את בסיס ההבדלים הללו בין שני הקולטנים, נערכו מחקרים כדי להעריך את מידת האינטראקציה בין האגוניסט, הקולטן וקשרי [35S]GTPɣ שצורפו בניסויים, וגם מחקרים תחרותיים בתחום האגוניסטים עם או בלי מקטעים של Gpp(NH)p. בנוגע לקשרי ה- [35S]GTPɣ; מצאנו אותות נאותים שהושגו לשחזור עם רמות גבוהות של צירופי קולטנים חולים (בקירוב: 10 pmol / mg) בתאי COS-7, אשר הושתלו יחד עם פריטי Gα. תוצאות מחקרים אלה מוצגים בתרשים 3. קשרי [35S]GTPɣ המגורים בצורה מירבית ע”י איזופרוטרנול, התברר שהם יותר חזקים בקרומים הנושאים Arg-389 לעומת הקולטן Gly-389: התוצאות היו עקביות עם תוצאות מבדקי האצטניל ציקלאז, שגם הם הצביעו על שיפור בתפקוד הפונקציונלי המגורה מאגוניסט (בצירוף הקולטן Arg-389).

אחת התכונות המוכרות היטב של קישורי האגוניסטים לקולטנים (כמו בטא1) הוא העלייה בדרגת הקשר-הזיקתי, המצביעה על אינטראקציות בין קולטן/חלבון G (17-19). מעניין לציין כי בעבר דיווחנו (13) שבמחקרי תחרות שנערכו בהיעדר Gpp (NH) p, ההצטברות מקודמת אגוניסטים (עם ערך-שברי גבוה של זיקה ל- β1AR (Gly-389)) לא נפתרה בכזו קלות. תוצאה זו ככל הנראה, נגרמה בגלל קשרים זהים של הקולטנים לאתרים שלהם (קולטנים עם זיקה גבוהה או נמוכה), המצביעים על עקומת ערכים עקביים עם פחות אנרגיה חופשית יחסית בזמן העברת האותות. תהינו אם הקולטן Arg-389 אכן היה משפר את הקשר האגוניסטי המקדם זיקה גבוהה, מכיוון שקולטן זה הגדיל את הצימוד התפקודי חלבוני ה- G. מחקרים תחרותיים -שכללו איזופרוטרנול – בוצעו אפוא במקביל, עם או בלי Gpp (NH) p – הממברנות מתאי CHW (צירופים לכל קולטן) נשטפו במהלך הניסוי. התוצאות מיוצגות בתרשים 4 וטבלה מס’ 2. כמוצג, עקומות עקירה בהעדר נוקליאוטיד גואנין מהניסויים בגלי 389 היו תלולים יחסית (ממוצע מקדם פסאודו היל, 0.87 6 0.03) ונפתרו בצורה הטובה ביותר סטטיסטית למודל של אתר אחד. Gpp (NH) p לא השפיע על תחרות אגוניסטית עם הקולטן Gly-389 (איור 4). לעומת זאת, לעיקולי העקירה שהתקבלו עם הקולטן Arg-389 בהיעדר Gpp (NH) p היו מקדמי פסאודו-היל ממוצעים של 0.73 6 0.03, והנתונים נפתרו בצורה הטובה ביותר עם מודל דו-אתרים (ערך p מורכב, 0.001). האחוז של קולטנים במצב זיקה גבוהה עם הקולטן Arg-389 היה 26 6 1% (איור 4 וטבלה II). כפי שאפשר לראות בגרפים, כשמצרפים Gpp (NH) p לקולטן הזה – בתגבוה הצפויה של הגרף ימינה ; עם פאזה אחת – נבחין בעקביות הפונקציונלית עם קשר זיקתי חלש כלפי האגוניסט.

תרשים 4: תוצאות העקומות של אגוניסטים מתחרים, שנלקחו ממחקרים בתחום קולטני ה- Gly-389 ו- Arg-389: ניסויים בוצעו באמצעות CHW ממברנות בהיעדר/נוכחות Gpp(NH)p. נתוני ה- Gly-389 שהתקבלו בהיעדר נוקלאוטיד גואנין התאימו בצורה הטובה ביותר לאתר אחד מודל, והכריכה לא הושפעה על ידי Gpp(NH)p. לעומת זאת, מחקרים עם Arg-389 הביאו להתאמה של שני אתרים בעלי זיקה גבוהה ונמוכה רכיבים (ראה טקסט וטבלה II) כאשר בוצעו בהעדר Gpp (NH) p, והעקומות הועברו ימינה וייצגו כריכה של אתר אחד בנוכחותו. התוצאות המוצגות הן הנתונים הממוצעים מחמישה ניסויים עצמאיים. סרגל שגיאות נעדר מציין כי טעויות רגילות היו פחותות מ סמל העלילה. מכיוון שניסויים אלה התבצעו בטמפרטורה גבוהה יותר, ערכי ה- ki (עבור איזופרוטרנול בצירוף Gpp (NH) p) היו גבוהים פי 4 גבוה מהערכים  שהתקבלו בניסויים המוצגים בטבלה I.

טבלה 2

תוצאות המחקרים בנושא אגוניסטים מתחרים (איזופרוטרנול) – עם או בלי Gpp (NH) p בצירוף קולטני β1AR של Gly-389 ו-

Arg-389: הקולטן Gly-389 לא יכול היה להתאים לדגם בעל שני אתרים שהוא גדול יותר בהשוואה למודל עם אתר אחד (ראה פירוט בטקסט), ולכן לא הושגו פרמטרים מחייבים לזיקה נמוכה/גבוהה. RH, אחוז מקולטנים במצבי זיקה גבוהה; NA, לא ישים.

תרשים 5: יישור שיירי חומצות אמיניות של הזנב הציטופלזמתי הפרוקסימלי של ה- β1AR במינים שונים: שימו לב כיצד העמדה/המצב נשמר עבור שני הזנים האנושיים Gly ו- Arg. המספרים המציינים חומצות אמיניות מייצגים את פעילויות הקולטן.

דיון בנושא

אצל אנשים נורמליים עולה מהממצאים האלה, שכל אחד מכיל בגופו את שני הצירופים הגנטיים של β1AR, עם הבדלים חירפים באיתות הפונקציונלי. למטרות עקביות, ולאור העובדה שמספר מחקרים של פונקציה-מבנה פורסמו ונכלל בהם הקולטן Gly-389 (13, 20), נעדיף להמשיך ולייעד את הקולטן הזה ל- “זן הבר” β1AR ממקור אנושי, אם כי נראה כי וריאציית ה- Arg היא יותר שכיחה – הדבר מתנהל באופן דומה למה שתיארנו קודם: וריאציות/צירופים נפוצות של β2AR (5, 6). האתר מכיל מספר צירופים של זנים: 9 חומצות אמיניות באיזור של המקטע השביעי הארוך והטרנסממברנלי; ליתר דיוק בתחום/אזור הזנב הנמצא בנקודה לפני מרבד הציסטאין-פלמיטיט (תרשים 5). זה אזור מכונה לפעמים הלולאה התוך תאית הרביעית, אך בדוח זה ייקרא החלק הפרוקסימלי של הזנב הציטופלזמתי. באנלוגיה המשתמשת ב- β2AR (21, 22) ו- α2AR (23), ועוד קולטני של צמדי חלבוני G, האזור הזה יהיה חשוב עבור צמד הקולטנים עם הגורמים הנקשרים אליהם: חלבוני G. אכן, ההבדל בין קולטני Arg-389 ו- Gly-389 הוא בצימוד פונקציונלי. הקשרים שקודמו ועברו מוטציה בעזרת קולטנים, מ- GTPɣ אל Gα, גם הם מעידים על קיומם של אגוניסטים הנצמדים לחלבוני G, והיו נבדלים באופן דומה משני הצירופים הגנטיים של β1AR. בהתאם לממצאים אלה, ובעזרת הקולטן Arg-389, זוהתה הצטברות מקודמת אגוניסט של מצב הזיקה הגבוהה בתכשירים הממברניים (שנשטפו ללא שילוב של הנוקלאוטיד גואנין) – לא היה אפשרי לבצע אותה פעולה בעזרת הקולטן Gly-389. בהסתמך על המודל הרב-דרגתי (18, 19) אינטראקציות עם קולטן / חלבון G (כמו גם התוצאות המצוינות לעיל), פעילות בסיסית מוגברת של אדניליל ציקלאז (כלומר, החלפה ספונטנית ל- R * בהיעדר אגוניסט) צפויה גם היא להתקיים במערכת לצד הקולטן Arg-389 וזאת כל עוד יש לו את הפוטנציאל המספיק לעבור שינוי צורתי בצורה מאוזנת בשילוב של אגוניסט, שהוא למעשה המקרה המתואר. ערכי ההבדלים שצפינו בהם (בפעילויות דרגת בסיס) היו קטנים אך עקביים, וחשיבותם נובעת ככל הנראה מהרמות הנמוכות יחסית של פעילויות פסיכולוגיות הבאות כביטויים/צירופים שיכוולים לתמוך במחקרים פונקציונליים. התפקוד הפונקציונלי של הפינוטיפ (ראה תרשים 2, A ו- C) פועל בתור מאותת ומשפעל של התאים המומרים בעזרת אנדוגנים לשני הצירופים המוכרים של β1AR.

תסתכלו בתמונה הסכימטית של שיירי β1AR (אצל מינים אחרים) בתרשים 5. החומצה האמינית המקבילה לעמדה 389 אצל האדם, כמו גם את שיירי הסביבה, שמורים היטב במינים הקיימים עד היום, עם הסטייה היחידה בעמדה389 אצל האדם איפוא שדיווחנו על קיומו ופעילותיו של ה- Gly. בעוד שאנו מחזיקים באפס מידע בכל הקשור לוריאציות השונות אצל מינים אחרים, התוצאות/הפרמטרים ובגלל עקביותם הגבוהה באיזור הזה, משמעותם היא חשובה בוריאציה הזאת עבור הצמדים של חלבוני ה- G ועבור טבעם הלא-יציב (והמתחלף בין שתיהם) של החומצות Gly ו- Arg מבחינת נפחם והמטענים שלהם.

כבר הזכרנו מקודם את קיומם של צירופים שונים של קולטני β1AR בכל מיני תאים בגוף. בלב, β1AR מייצג את סוג ה- βAR הדומננטי ביותר ומתקיים כצירוף של מיוציטים בעליות-לב וחדרים; שמה הם מגבירים את תדירות ועוצמת ההתכווצות בתגובה לגירוי סימפתטי. מעניין להזכיר גם את התפקיד הפוטנציאלי של הפוליפורמים של β1AR בעמדה 389 בויסות תפקודי הלב כאשר קיים מצב פתולוגי. במקביל להתפתחותה של אי-ספיקת לב שמאלית, מתרחשת גם ירידה ברמות ה- β1AR ובתפקודי הלב אצל האדם (24, 25): מגן על הלב מגירויים סימפתטיים מתמשכים בזמן שכמות החומרים במאגרים לא מספיקה לצורך מטבוליזם. פעילות פונקציונלית תקינה של β1AR, בטווח הארוך אמורה לשפר את התפקוד החדרי של הלב בשלבים המוקדמים של המחלה. ברגע שמתקיימים התנאים הנזכרים לעיל, ובהתייחסות להבדלים המשמעותיים בין פעילותם של שני צירופי הבטא1, אפשר להגיד בסבירות גבוהה כי התפתחותה של אי-ספיקת הלב הושפעה מהגנוטיפ β1AR. בהשוואות שנעשו בין אנשים, ישנם הבדלים בלתי מוסברים בכל הקשור להתפתחותה והתקדמותה של אי ספיקת לב, הנגרמת כל עוד אנו מנצלים את תגובתיות הלב (כלפי האגוניסטים המוחדרים של בטא1) לצרכי טיפול במחלה בעקבות הפרעה חדה בתפקוד הלב (26-28). זה מן המרשים להשתמש בחוסמי בטא אנטגוניסטיים לצורך טיפול באי-ספיקת לב כרונית שבסיסה המשוער הינו לצמצם ככל האפשר את השלכות המחלה שציינו, ולטווח הארוך של גירויים סימפתטיים מתמשכים. בכל מקרה, אנו עדים על שוני גדול בהשוואה בין אנשים הסובלים מאי-ספיקת לב, בתגובת גופם לחוסמי בטא (29). התוצאות שקיבלנו עד כה עלולות לנבא כי אנשים הנושאים את הקולטן יהיו בעלי התגובתיות הכי גבוהה כלפי הטיפול בחוסמי בטא, וזאת משום שהם מכילים כבר β1AR מקודד להגיב בנמרצות לגירויי אדניליל ציקלאז; ובאופן מאוד דומה אותו דבר יכול לקרות כאשר מטפלים ביתר לחץ דם תוך שימוש בחוסמי בטא, כך שהגורמים המגיבים לטיפול יכולים לנבא אם קיימת פעילות גנוטיפית בגוף: יש צורך לבדוק את המונחים הפרמקוגנטיים האלו, בצורה מעמיקה ומקיפה, במחקרים בתחום גוף האדם. בעוד שאין אנו מודעים לסוכנים הטיפוליים בגופנו, הנמשכים מתוקף התמחותם ל- β1AR  (דיפוציט המטרה), ההבדלים בתכונות הפונקציונליות ובתפקודים, בהשוואה בין שני צירופי הקולטן β1AR, יכולים לספק את נקודת המוצא לפעילות פוליפורמית כמחלה מסגלת במצב השמנת יתר. בשלב הסופי, יהיה עלינו לבדוק סיטואציות שונות של אנשים נושאי המחלה, ולקבוע את דרגות תדרי הפעילויות הפוליפורמיות של β1AR. אם נתייחס לזה ששני צירופי הפוליפורמים שכיחים בקרב האנשים, עדיין לא מתקבל על הדעת שאחד משני הקולטנים האלה יהווה את הסיבה העיקרית למחלה. אבל יתכן שצירופי הזנים האלה יאיימו בקטנה על בריאות האנשים בלהיחשף לכל מיני מחלות כמו אי-ספיקת לב, יתר לחץ דם והשמנת יתר.

סיכום הנושא: גילינו את אחד המצבים של הקולטן β1AR ממקור אנושי, בחומצה אמינית מס’ 389, שבו ניתן להבחין בנוכחותם של ארגנין או גליצין שנחשב מקודם כזן הבר באדם. הוריאציה/המצב הזאת כמחוללת שינויים בקולטנים המצומדים לחלבון G, מתגלית בהבדלים החדים בין שני הקולטנים כאשר קיימת פעילות של אדניליל ציקלאז מגורה מאגוניסט. יכול להיות שמצב כזה מספק את הבסיס הגנטי להבדלים בדרגות ובמאפייני רגישות למחלה בין אנשים, או כדי לקבוע הבדלים בפינוטיפים או בתגובתיות לסוכנים הנמשכים לקולטן-המטרה β1AR.