Does eIF3 promote reinitiation after translation of short upstream ORFs also in mammalian cells

האם גורם הפעלה יוקאריוטי  3  (eIF3) מעודד הפעלה מחדש אחרי תרגום של מסגרת קריאה פתוחה (ORF)  בכיוון הפחמן החמישי (upstream) גם בתאים של יונקים?

מילות מפתח: גורם תפעול העתקה 4 (ATF4); GCN4; RNA-שליח (mRNA); ריבוזום; הפעלה מחדש (reinitiation); בקרת תרגום (translational control); גורם הפעלה יוקאריוטי (eIF);   

תקציר

הפעלה מחדש אחרי תרגום של מסגרת קריאה פתוחה עליונה (uORF) היא אמצעי לוויסות ביטויי גנים בmRNA – מסוים בתגובה לשינוי בתנאי הסביבה. בעבר התגלה (בעיקר בהנצת שמרים) שיעילותו תלויה במספר גורמים: מאפיינים של פעולה במצב סיס ברצפים באגפיהן של מסגרות קריאה פתוחה המתירות הפעלה מחדש; טיבם של רצפי הקידוד; גורמים חלבוניים הפעילים במצב טראנס. כבר הוכחנו כי ברצפי 5′ של שתי ה- uORFהראשונות ב mRNA המוביל של שמרים שבהם ההפעלה מחדש מווסתת יש מרכיבים ייחודיים המגיבים ל- eIF3ובכך מונעים מחזור מלא של הריבוזומים אחרי שהרצפים תורגמו. התברר שפעולת הגומלין בין המרכיבים האלה ל- eIF3 חיונית לייצוב המכלול  mRNA וכרומוזומי  40Sלאחר סיום התרגום, ומאפשרת לו לחדש את הסריקה וההפעלה ולהפעיל מחדש את קודון ההתחלה הבא לכיוון פחמן השלישי (downstream). לאחרונה גילינו גם הוכחות משכנעות מתאים חיים לכך שכדי לעורר הפעלה מחדש, – eIF3צריך להישאר קשור לריבוזומים המאריכים את ה- uORF הנ”ל עד שנוצר מגע עם קודון ההפסקה. מאמר זה עוסק בתרומתו של ה- eIF3ושל הרצפים שבצידי uORF1 ליצירת הפעלה-מחדש יעילה במקבילים התפקודיים של GCN4 ו- ATF4בשמרים, ומבהיר שהיסוד המולקולרי של מנגנון ההפעלה מחדש אינו שונה בין שמרים לבני אדם.

מבוא

תרגום ה- mRNAמתרחש ב-4 שלבים: הפעלה, הארכה, סיום, ומחזור הריבוזומים. בתחילת שלב המיחזור, הריבוזום מסוג S80 מתחלק לתת-יחידה קטנה, S40, ולתת יחידה גדולה, S60 באמצעות האנזים ACBE1 , אולם ה-mRNA והtRNA- אחרי דיאצילציה נשארים קשורים לתת היחידה הקטנה ויש לסלקם בשלב השני, באמצעות פעולה משולבת של גורמי הפעלה שגרתיים כגון eIF1,  eIF1A, eIF3, או eIF2D, או באמצעות ההטרו-דימר  MCT1-DENR. לכן, ניתן לומר שמחזור ריבוזומים הוא שלב המעבר בין סיום התרגום להפעלה, כי מספר גורמים, כגון eIF3, פועלים בסיום, במחזור ובהפעלה גם יחד. אמנם בדרך כלל מיחזור הריבוזומים משלים את מחזור התרגום, אולם במקרים חריגים השלמת המחזור מזיקה, ואחרי תגובת התרגום מתרחשת הפעלה מחדש (REI) באותה מולקולת mRNA  באתר שקרוב יותר לפחמן השלישי (downstream) בקודון ההפסקה. הפעלה מחדש של התרגום היא מנגנון וויסות לגנים מסוימים, שבו, בשעת תרגום של   uORF קצרות, ממוחזרים רק תת היחידה 60S ו- tRNA אחרי דיאצילציה, אך ה-mRNA נשאר בתת-היחידה S40 אחרי סיום התרגום, כדי לאפשר הפעלה מחדש לכיוון החלבון השלישי. כבר הובהר כי רוב ה- uORF הנפוצים בכל הגנומים היוקריוטיים מעכבים את ביטויי ה-ORF הראשי באמצעות מניעת הגעתו של הריבוזום בשלב המחזור המלא אל אתר תחילת התרגום שלו. לכן uORF המאפשרות הפעלה מחדש (REI-permissive), שלעתים קרובות הם חלק ממעגלי הוויסות, לצד אלו שמונעות הפעלה מחדש (REI-non-permissive uORFs) חיוניים ביותר, כי בתגובה לגירויים שונים הם מאפשרים ביטוי מוצלח של ה-ORF הראשי. חשוב לציין שעם רצפי ה  mRNA נמנים אונקוגנים שונים, וכן חלבונים המשתתפים בהתמיינות ובהתפתחות, במחזורי חיים של תאים, בתגובות דחק, בלמידה ובזיכרון.

הדוגמה המובהקת ל- mRNA המווסת באמצעות הפעלה מחדש הייתה כמעט תמיד החלבון GCN4 בשמרים, שמקודד מפעיל העתקה חזק ביותר. ה- mRNA של הגן הזה כולל 4 uORF בקצה של הפחמן החמישי. שתי הראשונות, uORF1 ו- uORF2, מאפשרות הפעלה מחדש במידה רבה, ושתי האחרונות, uORF3 ו- uORF4, רק במידה זניחה. בשילוב שינויים בהשפעת דחק  (stress-induced changes) על רמתו של אחד ממכלולי ההפעלה החשובים, המורכב מ- Met-tRNAומ- GTP ∙ eIF2 (המכלול הטרנארי, TC), הם יוצרים מנגנון אל-כשל המאפשר לתרגם את ה- GCN4רק במצבי דחק מסוימים. סוד ההצלחה הוא מרחק מספיק גדול בין uORF שמאפשרות הפעלה מחדש לאלו שמונעות אותה, כך שבמצבים ללא דחק, בהם רמת ה-TC גבוהה, רוב הריבוזומים מסוג S40 לאחר סיום התרגום, הסורקים לכיוון הפחמן השלישי מכיוון קודוני ההפסקה של  uORF1 ו- uORF2ירכשו מחדש את ה-TC  לפני שיגיעו ל קודון ההתחלה של  uORF3 ו- uORF4 . כתוצאה מכך, לא ניתן ליצור את החלבון GCN4. מצד שני, המרחק צריך להיות די קצר בכדי שבתנאי דחק מסוימים שבהם רמת ה-TC נמוכה, ונדרש זמן רב יותר לרכישה מחדש של-TC , רוב הריבוזומים האלה יתקשרו מחדש ל-TC אחריש יעקפו את ה- uORFשמונעות הפעלה מחדש, ובשל כך תתאפשר תרגום ה- GCN4. התברר שארבעה גורמים קובעים את יכולת ההפעלה מחדש של uORF1 ו- :uORF2 

1. קיומו של מרכיב עתיר AU ברצף של הפחמן השלישי;
2. אורכן של  uORF1 ו-  uORF2 וכן תרכובת הקודונים
3. מרכיבים מסוימים מעודדי הפעלה מחדש (RPE) המצויים ברצפי הפחמן החמישי של ה- uORF;
4. פעולת הגומלין בין RPE מסוימים (PREi  ו-RPEiv של uORF1 וכן RPEv של uORF2) לבין הקצה האמיני (NTD) של תת יחידה TIF32 בגורם eIF3a, במכלול תת היחידה 40S ב-mRNA אחרי סיום התרגום.

מכיוון שהמיקום המועדף לקצה האמיני של a/TIF32, בתת היחידה 40S, ליד תעלת היציאה של ה-mRNA, שיערנו שאמנם ריבוזום 40S הקשור ל- eIF3 סורק לכיוון הפחמן החמישי של  uORF1 או   uORF2 ומתרגם אותו כריבוזום 80S  שלם שקשור ל – eIF3, מעודדי ההפעלה-מחדש הולכים ומתכווצים ל-תת מבנה מסוים. עם סיום התרגום, eIF3 פועל עם מעודדי ההפעלה מחדש ומייצב רק את הריבוזום הקטן של קודון ההפסקה ב  uORF1 או   uORF2. בשל המחזור החלקי של הריבוזומים, לאחר שיחידת המשנה 40S אחרי סיום התרגום, משרכשה את שאר גורמי הפעלת התרגום החיוניים, ממשיכה לחפש  הפעלה מחדש  לכיוון הפחמן השלישי. למען האמת, כבר מזמן עלתה השערה שנוכחות ממושכת של כמה גורמי הפעלה מחדש על ריבוזומים המקדימים היא תנאי להפעלה מחדש מוצלחת. מחקרנו האחרון על השמרים מצא לא הוכחות חותכות.  באחד ממאמרינו האחרונים הוכחנו בבירור שהיכולת הזאת של גורמי ההפעלה מחדש חיונית לגירוי הפעלה-מחדש מוצלחת של uORF מעודדי הפעלה מחדש לכיוון הפחמן השלישי. שיערנו שלא רק eIF3 נשאר קשור לריבוזומים המקדימים להתארך ומעודד הפעלה מחדש מוצלחת, אלא גם מכלול העברת ה-mRNA eIF4, ובעיקר השליש המרכזי eIF4G הפועל עם  eIF3  ו- eIF4A , לפחות בתאי יונקים ששוחזרו בתנאי מבחנה. עדיין אל גילינו הוכחות נסיוניות מוצקות לכך.

במחקר זה בדקנו האם המנגנון המולקולארי המתבסס על מאפיינים הפועלים במצב סיס של uORF מאפשרות הפעלה מחדש ושל  eIF3 זהה בשמרים ובבני אדם. השתמשנו בתור גן מדווח ב-ATF4, מפעיל העתקת הצפנה של mRNA שהוא המקביל בתאי יונקים ל-GCN4 בשמרים. הוא מכיל שתי uORF. כמו כן בודדנו כמה תת יחידות של  eIF3 – eIF3a, המשתתף בהפעלה-מחדש בשמרים, וכן eIF3h, המעורר הפעלה מחדש בצמחים, כדי לבחון את השפעתן על הצלחת ההפעלה מחדש בתאי אדם. התברר לנו ש- uORF1 שב- ATF4הדומה לזה שב-GCN4, מוקף גם במאפיינים הפעילים במצב סיס, כמו אלה שנמצאים במוביל הפחמן החמישי שלו. המבנה המיוחד שלהם מבטיח שהיא תאפשר את ההפעלה מחדש. זאת ועוד:  הגרסה האנושית של eIF3h  , כמו הגרסה הצמחית שלו, מגביר את יעילותה של ההפעלה מחדש.

רצפים משני צדדיה של uORF1 ב-  ATF4מגדילים מאוד את יכולתה להפעלה מחדש.

כאמור,המוביל של ה-mRNA  ב- ATF4של היונקים כולל רק שתי uORF, ואלו GCN4 של השמרים כולל ארבע  (איור 1-א). אבל רק אחת מהם, uORF1 מסוגלת להפעלה מחדש, כי יש בה רק שלושה קודוני חישה, וברוב המינים המרחק בין קודון ההפסקה לקודון ההתחלה של  uORF2 הוא 87 נוקלאוטידים בערך ( ע”פ Kozak 1987, המרחק המיטבי להבטחת הפעלה מחדש ביונקים הוא לפחות 80 נוקלאוטידים). לכן היא מאפשרת וויסות דומה בתנאי דחק ותנאים ללא דחק, כמו  GCN4, למרות ש- uORF2של ATF4 שונה מאוד מה- uORF3 ו- uORF4של GCN4. היא ארוכה מכדי שתהיה לה יכולת כלשהי להפעלה מחדש (59 שאריות של חומצות אמינו), ובעיקר, הרצף שלו חופף בחלקו ל ORF של ATF4 במסגרת קריאה שונה. לכן, בדגם הנוכחי, בתנאים רגילים, כל הריבוזומים המופעלים מחדש על uORF2 יסתיימו אחרי קודון ההפעלה של ATF4 וימנעו את תרגומו. למרות זאת, לאור הדמיון הרב בין המערך והתפקוד המשוער של  uORF1 ב- ATF4 וב- GCN4, רצינו למצוא קווי דמיון נוספים ביניהם. כלומר, לברר האם מולקולות ה-uORF1 של ATF4 מתנהגות בצורה דומה לזאת של GCN4.

 לשם כך, תחילה הפחתנו את כל ביטויי ה-RNA בתאי HEK293T  של אדם, ובעזרת מערכת RLM-RACE של חברת אמביון, יצרנו cDNA שמכיל RNA-מוביל של  ATF4 אנושי באורך מלא, ומיפינו בדיוק את אתר תחילת השעתוק שלו (איור 1-ג). אחר כך החלפנו את רצפי הפחמן החמישי ורצפי הפחמן השלישי של ה-uORF1 של ה-ATF4 האנושי (בנפרד או בצירופים), שאמורים להיות תואמים ל- RPE המצויים ברצפי הפחמן החמישי ולמרכיב עתיר AU ברצף של הפחמן השלישי של ה -uORF1 של ה- GCN4, ברצועות של קודוני CAA קוויים לכאורה (איור 1-א). ליתר דיוק, החלפנו בין קטע של 69 נוקלאוטידות לכיוון הפחמן החמישי ב  uORF1 (CAAup) לקטע של 25 נוקלאוטידות לכיוון הפחמן השלישי בה (CAADown). יצרנו גם צירוף של שתי המוטציות  שנקרא CAAup+down. את המוטציות שהתקבלו הכנסנו למבנה של ATF4 הכולל uORF1 יחיד. את פעילות הלוציפראז, המסמנת את יעילות ההפעלה מחדש, מדדנו בתאי HEK293T  והתאמנו לרמות ה-mRNA של מבנים שונים. שימו לב שביטלנו את ההשפעה המעכבת של uORF2 בכל הפכנו את קודון ההתחלה AUG בקודון AGG, כלומר ניתן לנתח את המבנים האלה ללא מחולל דחק. כמתואר באיור 1-ב, שני הרצפים שמצדי  ORF1  נדרשים להפעלה מחדש יעילה, ממש כמו ב- ORF1של GCN4. החלפת הרצף בעל הפחמן החמישי (CAAup (  הפחיתה את יעילות ההפעלה מחדש עד ל-47 אחוזים, ואלו החלפת הרצף בעל הפחמן השלישי (CAAdown) הפחיתה אותה עד ל 71 אחוזים בלבד. מכאן נובע שהשפעתו של הראשון חשובה בהרבה. במקרה של ה- ORF1של GCN4, ההיפך הוא הנכון.  צירוף שתי המוטציות (CAAup+down), הפחית אותן ב-35 אחוזים בערך (איור 1-ב. שני הממצאים האלה מעידים בבירור שכל אחד משני הרצפים משני צדדיה של ה uORF1 תורם יותר מ-60 אווזים ליכולת ההפעלה-מחדש שלה, ומכאן נובע שמנגנון בקרת התרגום החשוב הזה הוא יתרון אבולוציוני.   

א: מבנה ה-mRNA האנושי עם ATF4 השתמשנו בו בניסוי. בגרסת CAAup, חלק גדול מהרצף ב-uORF1 בכיוון הפחמן החמישי (5′) הוחלף ב-23 קודוני CAA (לא שינינו את מקום תחילת השעתוק ו-9 נוקלואטידות לפני הקודון  AUG ב-uORF1 שמוסתר בתעלת הקשירה של ה-mRNA אל הריבוזומים, בסיומה של uORF1, כמו בuRF1 עם GCN4); בגרסת CAAdown, החלפנו את הרצף המקורי, שכלל 25 נוקלאוטידות מיד אחרי קודון ההפסקה של uORF1 בשבעה קודוני CAA ואחריהם ברביעיית נוקלאוטידות אחת מסוג CAA. גרסת CAAup+Down היא שלוב בין שתי הגרסאות.

ב: כל המבנים בציור א’ הושתלו בתאי HEK293T ועברו טיפול כפול בלוציפראזה, כדי להאחיד את רמת הmRNA. ביצענו ניתוח סטטיסטי על פי מבחן t יחיד. כוכב אחד פירושו P≤0.05; שלושה כוכבים פירושם

 P ≤ 0.001

ג:  יצרנו cDNA עם ATF4 אנושי RNA שלם של תאי HEK293T, הפרדנו דגימת DNA בעזרת אלקטרופורוזה של ג’ל בריכוז 2 אחוזים, הופרדה ורוצפה כך שתאמה ל RNA מוביל אנושי. הגדלים של זוגות הבסיסים מסומנים משמאל.

ד: תבניות-משניות משוערות של כל רצפי הפחמן החמישי של uORF1 עם ATF4 ביונקים הנ”ל. השרטוטים מציגים את מוטציית CAAup ושני תחליפים שתוכננו לשבש מבנים  מסוימים או את כל ה-RNA המוביל.   

רצף הפחמן החמישי של הuORF1 עם GCN4, וגם רצף הפחמן החמישי של uORF1 אחת של YAP1, מפעיל שעתוק אחר בשמרים, מכילים מאפייני פעולה במצב סיס מעודדי הפעלה מחדש במבנים וברצפים מסוימים (PRE). לכן בשלב הבא בדקנו האם גם רצפי הפחמן החמישי של uORF1 עם ATF4 מקבלים מבנה מסוים, ואם גם אותו מבנה חוני להפעלה-מחדש יעילה. לכן ערכנו ניסוי ממוחשב על כל האזור שלפני ה- uORF1עם ATF4. גם כאן, כמו בנוגע ל-GCN4, הבאנו בחשבון שהמולקולה של רצף הפחמן החמישי משתנית ללא הרף כשהרצף יוצא מפתח היציאה של ה-mRNA. לכן, חילקנו את ה-RNA  המוביל של ה-uORF1 לשני מקטעים, ותחילה קיפלנו את הקטע הקיצוני של הפחמן החמישי, ונוצר חוד בעל שלושה עיגולים (5′ TCH   באיור 1-ד). אחר כך הוספנו את הקטע האחר ויצרנו דגם של כל הרצף בשעת יציאתו מפתח היציאה, וזיהינו תחילה  את ה-TCH  במצב לפני הקיפול. כך נוצרה לולאה בקצה צינור ליד הקצה של הפחמן החמישי (3′ SL”” באיור 1-ד), בנוסף ל- 5′ TCH  . המבנים האלה ומיקומם במרחב דומים למבנים של RPEii   ו-RPEiv, ונראה שהם גם די דומים במינים אחדים של יונקים, במתואר באיור 1-ד.

כדי לגלות את חשיבותם הפיסיולוגית האפשרית המשכנו בניסוי הממוחשב שבו תכננו ובחנו מוטציות מזעריות ששיבשו את אחד משני המבנים, באמצעות אותו גן מדווח המתואר לעיל. המוטציה הראשונה “ללא SL”, (המקום שבו שינינו לבסיסי U את הבסיסים C64 ו-G73) נועדה לשבש את קטע 3′ SL, אולם הפחיתה את פעילות הלוציפראזה רק ב-13 אחוזים בערך. כלומר, חשיבותו של הקטע הזה להפעלה מחדש זניחה, כמתואר באיור 1-ב. לא מצאנו שום תחזית ממוחשבת של שיבוש ב- 5′ TCH. לכן, במוטציה השנייה, “מסולק לגמרי”, החלטנו להחליף את הבסיסים  17C ו-21C לבסיסי A, כדי לשבש את שני המבנים. נדהמנו לגלות את אותה ירידה חדה בפעילות הלוציפראזה כמו במבנה  CAAup, עד 49% בערך. מכאן נובע שדווקא רצף 5′ TCH הוא הגורם לעידוד ההפעלה מחדש של רצפי הפחמן החמישי של uORF1 עם ATF4 , כמתואר  איור 1-ב. לפי שעה איננו יודעים האם המרכיב החיוני לעידוד הפעלה-מחדש הוא מבנה שלם או רק רצף מסוים בו.

eIF3h מעודדת הפעלה מחדש של תרגום בתאי אדם.

כאמור, רק RPE i. ו-  RPE iv ב-uORF1 עם GCN1 פועלים עם הקצה האמיני של תת-יחידה a/TIF32 במכלול של תת-חידה S40 של הmRNA לאחר סיום התרגום. לכן  ניסינו להבין האם גם eIF3 של אדם תורם להצלחת ההפעלה-מחדש ב-mRNA  עם ATF4, שאלה שטרם נבדקה בניסוי, אולם יש דיווחים על כך שתת-יחידה eIF3h משתתפת בהפעלה- מחדש בצמחים. לשם כך הפחתנו את הביטויים של eIF3a ושל eIF3h באמצעות משתיק RNA (siRNA) מסוג דארמאקון , ומדדנו את פעילות הלוציפראזה בתאי HeLa שהושתלו בהם מבני ATF4 אנושי עם uORF1 בלבד או בלי שום uORF  (“d-all”), כמתואר באיור 2-א. האחרונים שימשו לצורך האחדת הרמה. קבוצת הביקורת הייתה תאים שטופלו במשתיק RNA לא-ייעודי וכן בתאים שהפחתנו בהם את ביטויי ה- eIF3k ב-70 עד 80 אחוזים בערך,  כמתואר באיור 2-ב. השתמשנו בתאי heLa ולא בתאי HEK293T מכיוון שיכולת הריסון של תת-יחידות eIF3 גדולה בהרבה בתאים אלה. בעקבות ההפחתה, מאבדים התאים רק יחידות לא-חיוניות מכל 12 תת-היחידות :   eIF3kו-eIF3l, המשתתף איתו בתהליך; ההפחתה של eIF3h מבטלת את עצמה וגם את אלו של eIF3k וכן  eIF3l, וההפחתה של IF3a משמידה כמעט לגמרי את כל יחידות eIF3  מלבד הליבה “דמוית השמרים” של תת-יחידות  eIF3b, eIF3i, ו- eIF3g, כמתואר באיור 2-ב. ההפחתה של eIF3k כמעט ולא השפיעה על יעילות הפעלה מחדש, וההפחתה של eIF3a הורידה את הצלחת ההפעלה מחדש רק במעט, ב-11 אחוזים בערך. לעומת זאת, ההפחתה של eIF3h הפחיתה את ההפעלה מחדש במידה ניכרת: ב-34 אחוזים בערך. חשוב לציין שלפי המדידות של מבני d-all , הפחתת  eIF3a היא ההפחתה היחידה שהצליחה לרסן את ההפעלה-מחדש של כל התרגום, כצפוי לאור השפעתה השלילי של הפחתת ביטויי  eIF3a על כל המכלול של eIF3 ותפקידם בהפעלה מחדש הכללית. כלומר לא ניתן לקבוע מה תפקידן המדויק בהפעלה מחדש בתאי יונקים. אבל ההפחתה של ביטויי  eIF3h מפחיתה גם את הדימר eIL3k ו-eIF3l, והיא השפיעה בהחלט על יעילות ההפעלה מחדש. לעומת זאת, הפחתת הביטוי של  eIF3k מפחיתה , מלבדו, רק  את הדימר eIL3k ו-eIF3l , ולא הייתה לה כל השפעה. מכאן נובע שתת-היחידה  eIF3h מגבירה את יעילות ההפעלה-מחדש גם אצל בני אדם.

מסקנות

גילינו שיש דמיון באופן הפעולה בין שתי uORF מאפשרי- הפעלה- מחדש במובילי mRNA  של שתי מקבילות משתי מערכות תאים יוקאריוטיים שונים מאוד כגון GCN4, בשמרים, ו- ATF4, בבני אדם, וכן ש eIF3a  ו-  eIF3h מעודדים הפעלה מחדש בתאי יונקים.

כל אחד משני הרצפים מצדדיהן של uORF1 בעלות ATF4 מגדיל בהרבה את רמת ההפעלה מחדש שמאפשרת אותה צורה. כמו כן, רצף הפחמן החמישי שלה כולל שני מרכיבים משתמרים, 5′ TCH  ו-  3′ SL, הדומים למרכיבים של uORF1 בעלות GCN4. נראה ש 5′ TCH הוא הגורם העיקרי להשפעה. לא הצלחנו לקבוע בוודאות האם eIF3a מעודד הפעלה מחדש כמו בשמרים אבל נראה שכמו בצמחים,  גם ביונקים  eIF3h משתתף בהפעלה מחדש. למען האמת, גילינו שהגרסה האנושית של eIF3h תופס בריבוזום אותו מקום כמו הקצה האמיני המעודד הפעלה מחדש בתת יחידה TIF32 של eIF3a בשמרים: ממש ליד תעלת היציאה של ה-mRNA , כמתואר באיור 2-ד. שם הוא יכול לפעול עם הרכיב  5′ TCH  אחרי תרגום ה-uORF1. זאת הוכחה נוספת לכך שלרכיב eIF3h יש תרומה ישירה לעידוד הפעלה מחדש במכלול 12 תת-היחידות eIF3.

מדיווחים עדכניים עולה ש צורות  uORF נפוצות ב-45 אחוזים בערך  ב- mRNA של יונקים, אבל רק ב-13 אחוזים בערך בזה של שמרים. ניסויים ב-GCN4   וב-YAP1 ביונקים, וגם מחקר על יעילות ההפעלה מחדש של צורות uORF אקראיות הוכיחו בבירור שרוב צורות ה-uORF בשמרים בולמים בחוזקה הפעלה מחדש. צורות  uORF הם מדכאי תרגום נפוצים גם בתאי יונקים, אולם הדעה הרווחת היא שהצורות שב-mRNA של יונקים, גם צורות ה- uORFשנוצרו באקראי במעבדה, בדרך כלל מדכאים הפעלה מחדש פחות מאלה שביונקים (ב-30 אחוזים עד 80אחוזים), ומאפשרים לפחות מידה כלשהי של סריקה והפעלה מחדש של ביטויי חלבון. מכאן נובע שייתכן ורצפים מסוימים דרושים פחות להפעלה מחדש. תוצאות הניסוי הן בשמרים והן בתאי יונקים תומכים בהשערה הזאת. בשמרים, GCN4 מחסל את כל הרצפים הפועלים במצב סיס משני צדדיה של uORF1 ואת כל יכולת ההפעלה מחדש שלהם. החלפת רצפים דומים משני צדדיה של uORF1 עם ATF4 ברצועות לא-סדירות וחוזרות של CAA הפחיתה את יעילות ההפעלה מחדש רק ב-65 אחוזים בערך, כמתואר באיור 1-ב. לכן לא סביר שרוב צורות ה-uORF בתאי יונקים מדכאים הפעלה מחדש יותר מאלה שבשמרים. רק אם הם חלק בלתי נפרד  ממערכת וויסות תלוית-דחק כלשהי, שיש בהם מרכיבים מסוימים הפועלים במצב סיס שמאפשרים הפעלה-מחדש ברמה גבוהה.

הגן המתחזק (house-keeping)  GAPDH על פי הערכת תספיג-חלבון (Western Blotting).

ג: עוצמה יחסית של סימני הפעילות של לוציפראזת גחלילית (Fluc) שהופקו מתאי HeLa, באחוזים מאותות הפעילות שהתקבלו בתאים לא מטופלים.  בתת היחידות eIF3 של תאי הניסוי הושתלו מבנים בעלי uORF1 בלבד או ללא כל uORF (d-all). אותות ה-Fluc הואחדו בנפרד עם רמתו של כל חומר-מדווח ואלה הותאמו קודם לכן לרמת ה-  RNA  המכייל (spike RNA) שהוסף לפני הפקת ה-RNA. ביצענו ניתוח סטטיסטי ע”פ מדגם t  יחיד (כוכב אחד פירושו   P≤0.05).

ד: המערך המשוער, לאחר השלמת התרגום, של מכלול ה-uOrf1 בעלות ה-ATF4, ומבני המשנה הפועלים עם תת היחידות  eIF3h לעידוד חידוש הסריקה לצורך הפעלה מחדש של mRNA  בעל ATF4.

ייתכן שהסיבה להבדל בין התוצאות בשמרים לתאי יונקים היא בהבדל בין גורמי ההפעלה מחדש הפועלים בכל אחד משני סוגי התאים :  eIF3ומידה מועטה יותר,  eIF4G . ההבדלים עיקריים בין גרסאותיהם בבני אדם לאלו שבשמרים הם:

1.  ב- eIF3 אנושי יש בערך פי 2 יותר תת-יחידות מזה שבשמרים;
2. eIF4G אנושי ארוך בהרבה ויש לו יותר שותפים לפעולת גומלין ישירה;
3. ההבדל העיקרי הוא שביונקים, ה- eIF3פועל ישירות עם eIF4G, ובשמרים, המתווכים ביניהם הם eIF5 ו-eIF1.

בהנחה ש- eIF4Gו- eIF3מסוגלים לשרוד אחרי תרגום של uORF בריבוזום של יונק המורכב מתת יחידה של S80, ולייצב מכלול של תת יחידה S40 ב-mRNA, ייתכן שתהליך הייצוב מתחזק בהרבה בשל המגע הישיר ביניהם. לכן רמת האפשור ההתחלתית של הפעלה מחדש בתאי יונקים תהיה גבוהה מזאת שבשמרים. במקרה השני, אין מגע ישיר בין שני גורמי ההפעלה מחדש, וכך עלולה להיחלש פעולת הגומלין בין  eIF4G לריבוזומים המתארכים. גורם המחזור ABCE1 פועל עם פני השטח של תת יחידה S40 גם אחרי מחזור הריבוזומים, וככל הנראה גם פועל בשיתוף eIF3 לקידום הפעלת התרגום. הממצאים האחרונים מוכיחים שבאמצעות מגע ישיר עם eIF3, גם eIF4G מסוגל לשנות ריבוזומים כדי לעודד הפרדה של תת יחידה S60 ו-tRNA אחרי דיאצילציה, ובכך לגרות הפעלה-מחדש. גם לרפואה יש עניין בתהליך המולקולארי של הפעלה-מחדש (בעיקר בתרומת התפקוד הפגום של uORF למחלות שונות בבני אדם), יידרש מחקר נוסף בנושא ההפעלה מחדש.

החומרים והשיטות שבהם השתמשנו

 מדידה כמותית של פעילות הלוציפראזה בעזרת שני גנים מדווחים

 גידלנו תאי HEK293T בתוך צלחות של 6-גומות, בטמפ’ 37 מעלות צלסיוס  ובתמיסת CO₂ של 5 אחוזים, בתווך  DMEM של סיגמא (מסק”ט # D6429) בתוספת סרום של עובר שור (FBS) של סיגמא, (מסק”ט  # F7524). פירקנו את ממברנת התאים היישר על הצלחת באמצעות מנה אחת של Glo Lyse  מתוצרת פרומגא (מסק”ט # E266A) 24 שעות בדיוק אחרי שהכנסנו DNA לתוך גנים מדווחים של לוציפראזה מגחלילית ומרנילה, באמצעות טורבופקט מתוצרת תרמו סיינטיפיק (מסק”ט # R0531). את תוצר הפירוק העברנו לצלחת שטוחה של 96 גומות, וחלק ממנו שמרנו לשם בידוד RNA. השתמשנו  במערכת לניתוח לוצפראזה דואל-גלו מתוצרת פרומגא (מסק”ט ( # E2940 ע”פ הוראות היצרן. רמת אותות בלוציפראזה של הרנילה שימשה להאחדה. בודדנו את כל ה-RNA בעזרת ריאגנט אר-אנ-איי בלו מתוצרת טופ ביו (מסק”ט # R013) ע”פ הוראות היצרן. אחרי  שנספג הדאוקסירובונוקלאזה מסוג טורבו (תוצרת אמביון, מסק”ט # AM2238) , סינתזנו cDNA באמצעות ערכת שעתוק-הפוך של cDNA מתוצרת אפלייד ביוסוסטמז, (מסק”ט # 4368813). ביצענו תגובת שרשרת פולימראזית מכמתת (qPCR) באמצעות חמש מנות של HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix Plus מתוצרת סוליס ביו-דיין (מסק”ט # 08–25–00020).רמות ה-mRNA של לוציפראזת הגחלילית הואחדות עם אלו של לוציפראזת הרנילה. התקן למדידות פעילות הלוציפראזה היה תוצאות ה- qPCR.

טיפול במשתיק RNA, הכנות להפקת תאים שלמים ותספיג חלבון

גידלנו תאי HeLa בצלחות של 6 גומות, בטמפ’ של 37 צלסיוס בתמיסת CO₂ של 5 אחוזים, בתווך DMEM של סיגמא (מסק”ט # D6429) בתוספת סרום של עובר שור (FBS) של סיגמא, (מסק”ט  # F7524). 24 שעות לאחר הזריעה שתלנו בתאים תערובת משתיק RNA או טארגט פלאס מתוצרת דארמקון, בריכוז סופי של 5 ננומולר (  eIF3a אנושי מסק”ט # L-019534–00; eIF3h מסק”ט # L-003883–00; eIF3k מסק”ט  #L- ; משתק RNA לא ייעודי מסק”ט #D-001810-10). ההשתלה התבצעה בעזרת הריאגנט אינטרפרון מתוצרת פוליפלוס (מסק”ט# 409  ) ע”פ הוראות היצרן.

בתספיג החלבון התאים נקצרו שלושה ימים אחרי הטיפול במשתיק RNA, בתמיסת פירוק ממברנה שכללה HCL בריכוז מולר אחד וברמת חומציות 6.8; 20 אחוזים גליקוג’ל, 20 אחוזים נתרן דודציל פוספט (SDS), 2 אחוזים בטא-מרקאטואתנול, ו 5 אחוזים ברומפנול בלו. לפני התספיג, המסנו את כל הדגימות  בשיטת SDS-PAGE. הגברנו את אותות התספיג בעזרת סובסטראט סופר סיגנל ווסט פמאטו מקסימום סנסיטיוויטי מתוצרת תרמו סיינטיפיק (מסק”ט  # 34096  ). איתרנו אותם בזמני חשיפה משתנים בעזרת מדמה מסוג ג’י-בוקס מתוצרת סינג’ין, ועיבדנו אותם בעזרת תוכנת קואנטיטי 1 של ביו-ראד.

אחרי הטיפול במשתיק RNA ביצענו ניתוחים של הגן-המדווח על הלוציפראזה של הגחלילית. לשם כך  הכנסנו פלסמידות של הגן המדווח 48 שעות אחרי הטיפול במשתיק RNA, ו-24 שעות אחר כך קצרנו את התאים.  את רמת אותות הלוציפראזה של הגחלילית השווינו לזאת של ה-mRNA בגן המדווח. קודם לכן השווינו אותה ל-RNA  המכייל (mRNA של גן שנמצא בשמרים,  RPL41a), שהוספנו לפני הפקת ה-RNA.

פרטי התהליך:

פרקנו את הממברנה של תאי HeLa בצלחות בנות 6 גומות, בעזרת 200 מיקרוליטר של תמיסת פירוק מסוג גלו ליסיס מתוצרת פרומגה (מס’ # E266A) 70 מיקרו ליטר  מתוצר הפירוק ניצלנו מיד לבדיקת הגן המדווח של הלוציפראזה, ועוד 70 מיקרו ליטר ערבבנו ב 2 מיקרו ליטר של RNA מכייל (mRNA שנמצא בשמרים,  RPL41a). בכל דגימה הייתה כמות של כ-100 ננו גראם, ואז הוספנו 750 מיקרו ליטר ריאגנט אר-אנ-איי בלו מתוצרת טופ ביו (מסק”ט # R013). כל ה-RNA בודד ע”פ הוראות היצרן. אחרי  שנספג הדאוקסירובונוקלאזה מסוג טורבו (תוצרת אמביון, מסק”ט # AM2238) , סינתזנו cDNA באמצעות ערכת שעתוק-הפוך של cDNA מתוצרת אפלייד ביוסוסטמז, (מסק”ט # 4368813). ביצענו תגובת שרשרת פולימראזית מכמתת (qPCR) באמצעות חמש מנות של HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix Plus מתוצרת סוליס ביו-דיין (מסק”ט # 08–25–00020). את רמת אותות הלוציפראזה של הגחלילית השווינו לזאת של ה-mRNA בגן המדווח. קודם לכן השווינו אותה ל-RNA  המכייל (mRNA של RPL41a שנמצא בשמרים), כדי לקזז כל אובדן בזעת בידוד ה-RNA. את הערכים לגבי כל מבנה נפרד השווינו לבסוף לאלה של תאי הביקורת שלא טופלו במשתיק RNA ולמבנים ללא uORF1. האחרונים שימשו כקיזוז לפגמים בהפעלת התרגום הכולל.