Graded Encoding of Food Odor Value in the Drosophila Brain

ריחות מעוררים מאוד, אך עדיין לא ידוע כיצד והיכן במוח נגזרים ריחות. הניתוח שלנו של מוח הדרוזופילה מרחיב את התפקיד של מספר קטן של נוירוני חישת רעב על מנת לכלול ייצוג של ערכי ריח המזון. אין ויוו, הדמיית שתי פוטונים של סידן מראה כי המשרעת של פעילות המעוררת על ידי ריח המזון בנוירונים המבטאים את הנוירופפטיד הדרוזופילי Fן(dNPF), אשר הומולוגי לנוירופפטיד Y, תואמת במידה גבוהה עם אטרקטיביות ריח המזון. הרעב מגביר תגובות עצביות והתנהגותיות לריחות מזון בלבד, אם כי ריחות מזון המעוררים משיכה במצב השבע מעוררים גם פעילות מוגברת של dNPF בזבובים המואכלים. אי-פעילות של תת-קבוצה של נוירונים המביעים dNPF או השתקת קולטני dNPF מבטלת את האטרקטיביות של ריח המזון, בעוד שפעילות dNPF המשופרת גנטית לא רק מגבירה את האטרקטיביות של ריח המזון אלא גם מעלה משיכה לריחות מרתיעים. שינוי כמות הריח המוצג מייצר עקומות עצביות והתנהגותיות תואמות, אשר יכולות לשמש כתחזית בנוגע להעדפה בין ריחות. כך אנו מדגימים “אות ערך” עצבי אפשרי הנגיש מתאים הניתנים לזיהוי ייחודי.

מבוא

כימוסנסציה היא רגולטור קריטי של התנהגויות מחפשות מזון על פני מינים של בעלי חיים (Dethier, 1976; Wilson and Stevenson, 2006; Asahina et al., 2008; Chow and Frye, 2009). ריח המזון לבדו יכול לעורר את הגישה המתאימה או התנהגויות חקירתיות החיוניות להישרדות (Dobzhansky et al., 1956; Ruebenbauer et al., 2008). עם זאת, מעט מאוד ידוע על האופן שבו המוח קובע את ערך הריח, שלא לדבר על מקורות מזון פוטנציאליים במיוחד.

בזבובים, איכות הריח מיוצגת תחילה על ידי הפעלה של הרכב נוירונים קולטני ריח (ORNs) ולאחר מכן על ידי דפוס הפעילות המבוזר של נוירוני ההקרנה (PNs) בתוך מרכז עיבוד הריח הראשי, אונת האנטנה (AL)ו (Su et al., 2009). תת-קבוצות ספציפיות של תאים בשלב זה חיוניות לייצור התנהגויות גישה או הימנעות הקשורות לריח (Suh et al., 2004; Kreher et al., 2008; Semmelhack and Wang, 2009; Ai et al., 2010; Root et al., 2011); אבל בגלל שמתועד היטב כי נוירונים ברמה זו מכוונים באופן כללי (Wang et al., 2003; Wilson et al., 2004; Fishilevich and Vosshall, 2005; Lin et al., 2006; Kreher et al., 2008; Riffell et al., 2009; Johnson et al., 2010), כל קטגוריה ספציפית או ייצוג מידע ערכי צפוי להופיע רק בשלבים מאוחרים יותר של המוח.

ALוPN-ים מתפצלים, ומקרינים לשני מבני מוח מרכזיים: תאי קניון (KC) של גוף הפטריות (MB), ולנוירוני הקרן הצדדים (LHN)ו (Su et al., 2009)ו. LHN-ים מכוונים באופן נרחב (Gupta and Stopfer, 2012) והם היו מעורבים בהתנהגות דחיינית כלפי ריח  (de Belle and Heisenberg, 1994; Wang et al., 2003). מסיבות אלה, הפנינו את תשומת לבנו ל- MB. תגובות MB הן ספציפיות בהתאם לריח, ויש ראיות כי פעילות KC הכרחית עבור משיכת ריח (Wang et al., 2003; Honegger et al., 2011). בנוסף ל-MB התמקדנו גם בנוירונים המבטאים את הנוירופפטיד הדרוזופילי F (dNPF)I, ההומולוג התפקודי של הנוירופפטיד האורקסיגני של היונקים Y (NPY)I (Brown et al., 1999; Garczynski et al., 2002; Nassel and Wegener, 2011). למרות שבעבר הוא לא הוכר כמגיב לגירויים ריחניים, שחרורו של dNPF, ומקבילו היונקי NPY, מעורב בהעברת תיאבון ואף הוצע כסימן ההיכר של מחסור מזון במוח (Flood and Morley, 1991; Bannon et al., 2000; Wu et al., 2003, 2005; Day et al., 2005; Krashes et al., 2009). למרות שהפרשת dNPF / NPY נחשבת כמתאם בולט של הרצון לאכול, הראיות מצביעות על כך שמאשר לקדם עיכול מזון כשלעצמו, פפטידים אלה קשורים בויסות המוטיבציה לאכול (de Bono and Bargmann, 1998; Wu et al., 2003, 2005; Day et al., 2005; Keen-Rhinehart and Bartness, 2007; Xu et al., 2010) ולאחרונה למאפיינים המתגמלים של גירויים בכלל (Shohat-Ophir et al., 2012).

על ידי ניצול ההעדפה הטבעית והמשתנה של תסיסנית המחקר לריחות מזון שונים וזיווג נתונים התנהגותיים עם הדמיה פונקציונלית ומניפולציה גנטית, אנו מראים כי בעוד KC-ים מופיעים כמכוונים לטובה לקידוד זהותו של ריח ייחודי, פעילות dNPF המעוררת בעקבות ריח קשורה קשר הדוק למשיכה לריח המזון.

חומרים ושיטות

זבובים מהונדסים מסוג תסיסנית המחקר גדלו על סביבת אגר קמח תירס סטנדרטי עם תוסף שמרים. חל שימוש במלאי הזבובים הבאים: cry-Gal4/ CyO,   cry-Gal80/TM6B,D3, dNPF-Gal4, UAS-dTRPA1/dNPF-Gal4, dNPF2-Gal4, UAS-hid/CyO; dNPF2-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP3; OK107-Gal4,  UAS-hid/CyO,  UAS-mcd8::GFP;MB247DsRED,  UAS-npfr1^dsRNA, UAS-KIR2.1^ts, ו-UAS-dTRPA1. זבובים גדלו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, למעט הצלבות ובקרות המשמשים לניסויים רגישים לטמפרטורה, שהועלו ב-20 מעלות צלזיוס.

גירויי ריח. ריחות נמסרו באמצעות אולפקטומטרים שנבנו בהתאמה אישית בקצב זרימה של 100 מיליליטר/דקה מבקבוקונים של 100 מ”ל. עבור עקביות, אולפקטומטרים זהים שימשו הן בהדמיית אין ויוו והן בניסויים ההתנהגותיים. ריחות מזון טבעי מורכבים: שמרים (1 גרם ב-5 מ”ל מים; שמרי סאף-אינסטנט, שמרי לסאפרה), אבקת בננה (3 גרם ב-5 מ”ל מים), חומץ תפוחים (דילול 1:2 במים; פודהולד), מיץ לימון (100%, לייקווד אורגניק), מיץ תפוחים (100%, לייקווד אורגניק), תערובת מיץ מנגו (100%, לייקווד אורגניק), רכיבים חד-מולקולריים של שמרים כפי שנקבעו בעבר על ידי ניתוח כרומטוגרפיית גז (Lin and Phelan, 1991)ו: אצטאלדהיד (דילול 1:1000), 2-מתילבוטנול (1:1000), ו-1-פרופנול (1:1000), ריחות חד-מולקולריים נוספים: 3-אוקטנול (1:1000), 4-מתיל-ציקלוהקסנול (1:1000), אתיל אצטט (1:1000) ואליל סיקלוהקסיל פרופיונט (ach)ו(1:100). שני ריחות היו ריחות חד-מולקולריים סינתטיים שאינם טבעיים: פרופיל נונאנואייט (1:100), או “שמרים סינתטיים”, המתואר כבעל ניחוח מותסס ושמרי, ובוטיליטיד הידרוקסיאניזול (1 גרם ב-5 מ”ל מים), או “גומי”, המתואר כבעל ניחוח גומי עדין. שני ריחות היו תערובות ריח מורכבות שמקורן אינו מן המזון: תמצית מחט אורן (1:100; גיואודן) ושמן מנוע (פנצויל). פרומון זכרי הוא תמיסת סיס-וקסניל-אצטט באתנול (קיימן קמיקל), ובקרת אמצעי אתנול נמצאת בדילול דומה (1:100). כל הדילולים מיוצרים בשמן מינרלי אלא אם צוין אחרת. כל הריחות נרכשים מסיגמא-אלדריץ’, אלא אם צוין אחרת. לניסויים נוירומטריים/פסיכומטריים, ריכוזי ריח מתבטאים כמיקרוליטרים של ריח המוחלים על נייר סינון בקוטר 4.25 ס”מ ומונחים בבקבוקונים של 100 מ”ל ומועברים כנ”ל. כמות הריח נעה בין 0.1 ל 1000 μl.

ניסויי הדמיה אין ויוו. הכנת זבובים חיים להדמיית סידן באה בעקבות פרסום קודם (Honegger et al., 2011), באמצעות נקבות הזבובים. זבובים במצב מורעב הועברו לבקבוקונים המכילים נייר סינון בקוטר 4.25 ס”מ (וואטמן) רווי ב ~ 1 מיליליטר מים ≥ ו24 שעות לפני תחילת הניסוי. התמונות הושגו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטון שנבנה בהתאמה אישית המיישם לייזר Chameleon Ti:sapphire (קוהרנטי) מכוון לאורך גל של 910 ננומטר ועדשה אובייקטיבית טבילה במים 40× (צמצם מספרי 0.80; אולימפוס). ההקלטות נלקחו מחלק אופטי אחד של מוח הזבוב שבהן הרגלית של ה-MB והנוירון dNPF המרכזי באותו צד היו גלויים. תמונות ה-256 × 256 פיקסלים הושגו באמצעות תוכנת Fluoview 300 (אולימפוס אמריקה) ב-2 הרץ עם הגדלה דיגיטלית של 4.5×. גירויי ריח נמסרו עבור 3 שניות כל אחד מצינורות אינרטיים הממוקמים ~ 8 מ”מ מן האנטנות. סדר ההצגה למסירת הריח נקבעה באקראי על-ידי מיון ב- Excel ן(Microsoft). כל דגימה מייצגת זבוב אחר, למעט כאשר צוין במצגות חוזרות של אותו ריח באיור 2e, f. כל הבדיקות התרחשו בין 8 בבוקר ל-8 בערב.

בדיקת משיכה התנהגותית. הבדיקה בוצעה בחדר בטמפרטורת 25°C (או 18–20/ 30 מעלות צלזיוס, לניסויי אי-הפעלה והפעלה סלקטיביים) עם 70% לחות יחסית. תא אולפקטומטר בן ארבעה שדות שנבנה בהתאמה אישית שימש למדידת התגובה של זבובים לסדרה של ריחות. לתא המעגלי היה רדיוס של 5.5 ס”מ והוא היה בעומק 2 מ”מ, עם ארבעה יציאות ריח הממוקמות במרחק שווה לאורך הקוטר, מוארות מלמטה על ידי פאנל של דיודות פולטת אור (MXHC). אוויר רגיל או ריחני נמסר עם קווים ייעודיים בקצב זרימה של 100 מיליליטר / דקה מבקבוקונים של 100 מ”ל, ויניקת ואקום מרכזית הנגישה לתא מלמטה. זבובים במצב השבע הועברו לבקבוקונים המכילים נייר סינון בקוטר 4.25 ס”מ רווי ב-1 מ”ל מים 60-90 דקות לפני הבדיקה, תוך התחשבות בתקופת ההכנה להדמיית זבובים חיים, ובכך הפכנו את זמן הגישה האחרונה למזון לעקבי הן בניסויי ההדמיה והן בניסויים ההתנהגותיים. עבור זבובים מורעבים, העברה לבקבוקונים האלה התרחשה ≥ 24 שעות לפני הבדיקה. עבור כל ניסוי ~ 30 זבובים של כל מין (3-4 ימים של גיל לאחר הבקיעה) הועמסו למרכז התא מלמעלה. ניסויים נוספים בוצעו בקבוצות נפרדות של זבובים זכרים ונקביים כדי להבטיח שלא יהיו הבדלים ספציפיים למין בהתנהגות. לזבובים ניתנו 15 דקות כדי להכיל את החדר לפני תחילת כל ניסוי. כל ניסוי נערך במשך 10 דקות, ותמונות של 240 × 320 פיקסלים השוגו ב-15 מסגרות לשנייה באמצעות מצלמת Logitech HD Pro C910 ותוכנת Logitech Webcam Software 2.0. ניסויי הבקרה כללו אוויר רגיל ומסונן המועבר לכל ארבעת יציאות הריח בו זמנית. לניסויי משיכת ריח, אחד מ-19 הריחות הועבר לנמל ריח אחד בזמן ששאר היציאות שנותרו מספקות אוויר מסונן. לניסויי העדפת ריח, שני ריחות הוצגו בו זמנית (שמרים לעומת בננה, שמרים לעומת ACV, בננה לעומת ACV) בשניים מארבעת נמלי הריח בזמן ששאר הנמלים מספקים אוויר מסונן, רק זבובים מורעבים שימשו לניסויי העדפה. לניסויי מניפולציה גנטית, כל ריח הועבר לנמל אחד והנמלים שנותרו סיפקו אוויר מסונן. הפתח שדרכו הועבר הריח נקבע באקראי עבור כל ניסוי על ידי מיון Excel ו(Microsoft). מידת המשיכה הקשורה לריח הוערכה כאחוז הזבובים ברביע הריחני ביחס למספר הזבובים הכולל בתא לאורך משך הניסוי. מדידות אלה התקבלו כל 10 שניות למשך תקופת הניסוי של 10 דקות ולאחר מכן חושב ממוצע בעל ערך יחיד המציין את תפוסת הרביע הכוללת. התא חולק לארבעה רבעים הקשורים לכל אחד מארבעת זרמי האוויר; וככזה, 25% תפוסה הייתה שוות ערך לביצועים מקריים. כל מדגם מייצג קבוצה אחרת של זבובים. כל הבדיקות התרחשו בין 8 בבוקר ל-8 בערב.

בדיקת בליעה. לתא המעגלי היה רדיוס של 5.5 ס”מ והוא היה בעומק 6 מ”מ, מואר מלמטה על ידי פאנל של דיודות פולטות אור (MXHC). הזבובים הועברו לבקבוקונים המכילים נייר מסנן בקוטר 4.25 ס”מ רווי ב-1 מ”ל מים 24 שעות לפני הבדיקה. נייר סינון עגול בקוטר 7 מ”מ הוחדר עם 20 מיקרוליטר של ריח בצבע כחול (מלח דיסודיום אריוגלאוסין עבור 18 מתוך 19 ריחות) מעורבב במים (למעט שמן מנוע המעורבב עם סודאן כחול II; סיגמא-אלדריץ’) כדי להשיג את אותו ריכוז המשמש בבדיקת המשיכה ההתנהגותית וממוקם במרכז התא. עבור כל ניסוי, כ-30 זבובים מכל מין (בגילאי 3 – 4 ימים לאחר הבקיעה) הועמסו לתוך החדר מהצד. כל ניסוי נמשך 20 דקות; ואחרי פרק זמן זה, הזבובים הורדמו עם CO₂ ונבדקו חזותית לנוכחות של צבע כחול בבטן. כל מדגם מייצג קבוצה אחרת של זבובים. כל הבדיקות התרחשו בין 8 בבוקר ל-8 בערב.

ניתוח נתונים. ניתוחים הן של נתוני ההדמיה והן עבור נתונים התנהגותיים נוצרו באמצעות סקריפטים מותאמים אישית שנכתבו ב- MATLAB ו(MathWorks). עבור הדמיית סידן, הנתונים עובדו מראש כדי למזער ממצאי תנועה לרוחב, לתקן את ההלבנה של התמונות ולציין נקודות עניין לניתוח נוסף. שינוי בפלואורוסנטיות (IΔF/F) נקבע ביחס לפלואורוסנטיות בסיסית במהלך חמש המסגרות הראשונות של ההקלטה עבור כל נקודת עניין. האזור שמתחת למהלך הזמן ΔF/F בין 0 ל-5 שניות לאחר מסירת ריחות שולב כדי לקבוע את ההיענות הקשורה לריח עבור כל נקודת עניין. עבור ניתוח KC, תאים מגיבים באופן משמעותי חושבו כפי שדווח בעבר (Honegger et al., 2011). סילום רב ממדי וניתוח היררכי בוצעו בתוך כל זבוב על תגובות הריח של כל אוכלוסיית ה-KC-ים (~ 150 לניסוי). ניתוח היררכי כדי להשיג את הדנדוגרמות שהוצגו בוצע על ערכת הנתונים הכוללת של KCן. MDS שימש רק להדמיה של דפוסי התגובות בתלת מימד. עבור הבדיקה ההתנהגותית, מידע קואורדינטות הזבובים נקבע כל 10 שניות, ואחוז הזבובים בתוך נקודת עניין שצוינה (למשל, הרביע הריחני) נקבע. הרביע המנותח בניסויי הבקרה נקבע באקראי. היסטוגרמה דו-ממדית חושבה כדי להדמות את תפרוסת המיקום לאורך כל תקופת הבדיקה של 10 הדקות.

ניתוחים סטטיסטיים. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו עם SPSS ן(SPSS). גדלי המדגם נקבעו עם גודל אפקט גדול צפוי ורמת כוח סטטיסטית רצויה של 0.8. גדלי אפקטים גדולים אושרו לאחר הוק באמצעות d של כהן. הנורמליות נבחנה במבחן השוויון בשוני של לוין, והבדיקה הפרמטרית נקבעה כהולמת. בסך הכל ניתוחי השונות, כאשר משמעותיים, עברו מבחן פוסט הוק של דונט כאשר ניגודים נעשו בהתייחס לממוצע קבוצת הביקורת; ולכל הניגודים הזוגיים האחרים, ערכי p מותאמי מגוון הושגו באמצעות מבחן ההשוואות המרובות של דאן-סידאק. כל הבדיקות היו דו-זנביות. רמת המובהקות נקבעה ב-p < 0.05.

תוצאות

לריחות אוכל יש משיכה שונה, אשר משתנה לפי המצב המוטיבציוני

בתחילה ביססנו את החלקיות של תסיסנית המחקר לריחות מזון שונים. עבור עקביות, השתמשנו זבובים של אותו גנוטיפ בניסויי ההדמיה (dNPF-Gal4/UAS-GCaMP3; OK107-Gal4 ). זבובים הונחו בתא התנהגותי שנבנה בהתאמה אישית (איור 1א) ונחשפו לאוויר מסונן המועבר לארבעה פתחים כאשר אחד מהם, הנקבע באקראי, נושא אוויר ריחני בתנאי הניסוי. מידת המשיכה לזרם ריח נקבעה על ידי חישוב אחוז הזבובים הנמצאים  ברביע הריחני, או רבע שנקבע באופן אקראי לניסויי בקרה, כל 10 שניות לאורך משך הניסוי של 10 דקות ואז חושב ממוצע אשר מניב אחוז אחד עבור כל סבב. מזבובים ללא העדפה הייתה ציפיה להתפזר באופן אקראי ברחבי ארבעת הרבעים בתא; וככזה, הביצועים המקריים נקבעו על 25% תפוסה. בדקנו שישה גירויי ריח מזון טבעיים מורכבים: שמרים (מקור מזון עיקרי עבור תסיסנית המחקר) (Dobzhansky et al., 1956; Powell, 1997), לימון, תפוח, מנגו, בננה וחומץ תפוחים (ACV).

בנוסף לששת ריחות המזון, בדקנו 13 ריחות בקרה שאינם מזון. קטגוריות מזון ולא מזון נקבעו באופן ניסיוני באמצעות בדיקות בליעה נפרדות שבהן זבובים יכלו לגשת ולבלוע ריחות חדורי צבע על נייר סינון (איור 1ג). שלושה מריחות הבקרה שמצאנו כלא מעוררים אכילה היו המרכיבים המונומולקולריים העיקריים של שמרים: 1-פרופנול, מתיבוטנול, ואצטאלדהיד (Lin and Phelan, 1991). בנוסף, תרכובת חד-מולקולרית סינתטית פרופיל נונאנואייט, שתוארה כבעלת ארומה “שמרית”, נבדקה גם. בקרות נוספות כללו תרכובת חד-מולקולרית סינתטית נוספת שלא נחשבה כקשורה למזון (בוטיליטיד הידרוקסיאניזול, “גומי”) ושני ריחות מורכבים שאינם מזון (תמצית מחט אורן ושמן מנוע), שמא התנהגות המשיכה מונעת פשוט על ידי המורכבות של ריחות המזון הטבעיים, המורכב מרכיבים נדיפים רבים (Lin and Phelan, 1991; Stensmyr et al., 2003), ולא הקשר שלהם לאוכל. כבקרה חיובית, בדקנו גם את הפרומון הנדיף הספציפי לגבר 11-סיס-וקסניל- אצטט (cVA) באמצעות קבוצות של זבובים זכריים, נקבות מזווגות ונקבות בתולות. cVA מגביר את פתיחות הנקבה למהלכי החיזור הגברי, והוא מדווח כחומר המגדיל את התנהגויות האגרגציה עבור זבובים זכר ונקבה כאחד, אם כי נמדד באמצעות בדיקות מלכודת על פני תקופות זמן ארוכות יחסית (Bartelt et al., 1985; Xu et al., 2005; Kurtovic et al., 2007). בנוסף, כדי לקבוע האם הזבובים היו מוטים בכבישת מיקומים ספציפיים בתוך התא שאינם קשורים לנוכחות ריח, בניסויי בקרה הזבובים נחשפו לאוויר מסונן שהועבר לכל אחד מארבעת הפתחים. בדקנו תחילה זבובים ניזונים ולאחר מכן שינינו את מצב המוטיבציה על ידי הרעבת הזבובים במשך 24 שעות.

זבובים הציגו רמות שונות של משיכה לריחות בודדים (איור 1ב,ד) העולים בקנה אחד עם דוחות שפורסמו בעבר באמצעות ה-t-maze השונה למדי וניסויי מלכודות 24 השעות  (Tully and Quinn, 1985; Knaden et al., 2012). שלושה מתוך 13 ריחות הבקרה יצרו התנהגות משיכה בלתי צפויה. מסירת ריח השליטה החיובי הצפוי שלנו, cVA, יצרה גם התנהגות משיכה ברורה, ודימורפית מינית. זבובים נשיים, ללא קשר לחוויה המינית שלהם, הציגו העדפה לרביע הריח עם ה-cVA, אבל התפזרו באופן אקראי עבור האמצעי שלו (אתנול) שהוצג בבידוד (איור 1ד). חשוב לציין, מתוך ארבעת הריחות שאינם מזון שעוררו משיכה, אף אחד מהם לא נבלע על ידי זבובים כאשר ניתנה להם גישה, והם גם לא עוררו עלייה במשיכה לאחר הרעבה.

לעומת זאת, ריחות המזון היו אטרקטיביים יותר באופן עקבי ותלויים במצב. ארבעה מתוך שישה ריחות מזון עוררו משיכה משמעותית במצב השבע. כל ששת ריחות המזון היו מושכים לזבובים מורעבים. מידת המשיכה הייתה מיידית וממושכת במשך תקופת הניסוי של 10 הדקות ולא נצפה שוני בין זכרים לנקבות (הנתונים לא הוצגו). באופן מעניין, התנהגות המשיכה לא הייתה אחידה על פני ריחות מזון בודדים. עבור זבובים מוזנים, המשיכה הייתה קלה, אם כי משמעותית עבור שלושה מתוך חמשת הריחות הפירותיים (תפוח, מנגו ובננה) והייתה בולטת יותר עבור שמרים. לאחר שזבובים גוועו ברעב, המשיכה לכל ששת ריחות המזון הייתה משמעותית (ANOVA דו כיוונית, שובע: F_(1,8) = 60.78, ריח: F_(18,144) = 22.42, שובע × ריח: F_(18,144) = 3.92, כל p < 0.0001); וכמו עם זבובים מוזנים, רמת המשיכה הייתה שונה בעקביות בין ריחות בודדים עם שמרים עדיין הריח האטרקטיבי ביותר.

התנהגות אינה ניתנת לצפייה על-ידי תגובות אוכלוסיית KC

לאחר מכן ביקשנו לקבוע את אזור המוח האחראי להתנהגות הנצפית שלנו. כדי

השיג זאת, פעילות עצבית צריכה להסביר הן את ההבדלים ההתנהגותיים שנצפו לריחות בודדים והן את השינויים בהתנהגות עקב רעב. בחנו תחילה את הפעילות המעוררת על ידי הריח של ה-KC-ים של MB (איור 2א). התמקדנו בביטוי של אינדיקטור הסידן המקודד גנטית GCaMP3ו (Tian et al., 2009)ו לקו Gal4 הספציפי ל-MBו, OK107ו (Connolly et al., 1996; Aso et al., 2009). באמצעות מיקרוסקופיה סורקת לייזר דו-פוטונית בזבוב החי, אפיינו את התגובות של אוכלוסיות של ה-KC-ים לתת-קבוצה של ריחות מונומולקולריים ושל מזון (Lin and Phelan, 1991). דפוסים של תגובות מעוררות בעקבות ריח נצפו בבירור ברזולוציה של תא אחד והיו שונים בין הריחות שהוצגו (איור 2ב). בהסכמה עם עבודה שפורסמה בעבר באמצעות זבובים הנושאים את אותם טרנסג’נים (Honegger et al., 2011), התגובות לריחות מזון טבעי מורכבים לא היו שונות מאלה שהועלו על ידי ריחות חד-מולקולריים, בין אם מבחינת שיעור התאים המגיבים באופן משמעותי (איור 2ג) או בסדר הגודל הכולל של התגובה (איור 2ד). בנוסף, מאפיינים אלה של תגובה מעוררת בעקבות הריח לא היו שונים בין זבובים שבעים וזבובים מורעבים (ANOVA דו כיווני, שובע: F_(1,6) = 3.37, p = 0.07; ריח: F_(5,30) = 13.39, p < 0.0001; שובע × ריח: F_(5,30) = 1.73, p = 0.15). מכיוון שהגורם הרלוונטי בתגובת אוכלוסיית KC עשוי להיות דפוס התאים הפעילים, ולא מספר התגובה או גודל התגובה, יצרנו ייצוג של מרחב הריח באמצעות ניתוח אוסף היררכי המבוסס על המרחקים הזוויתיים בין ריחות שנבדקו (איור 2ה, ו). לאחר מכן השתמשנו בסילום רב מימדי כדי להפחית את מורכבות הנתונים על מנת להמחיש את דפוסי התגובות לריח עבור זבובים בודדים בחלל תלת-ממדי (איור 2ה, ו). נעשה שימוש במרחק הזוויתי מכיוון שלפי דיווחים הוא רגיש יותר לדפוסים של תאים מגיבים ולא לגודל התגובות (Kreher et al., 2008). הצגות חוזרות של אותו ריח התקבצו יחד, ואימתו את חוסנו של ניתוח זה, אם כי לא היו ראיות לכך שריחות מזון יצרו קטגוריה נפרדת בזבובים המוזנים או הרעבים. יחד, ללא קשר לאופן שבו אנו מעריכים את תגובות KC, אנו לא רואים קשר פשוט בין פעילות KC לבין התנהגות ריח המזון שאנו מדווחים.

פעילות מעוררת ריחות dNPF מתואמת מאוד עם אטרקטיביות ריח מזון

לאחר מכן בדקנו אם נוירוני dNPF מגיבים לריחות וספציפיות התגובה שלהם, במיוחד לריחות הקשורים למזון. התמקדנו בביטוי של GCaMP3 לארבעה נוירוני dNPF אימונו-ריאקטיביים בפרוטוצרברום הגבי, באמצעות dNPF מונחה יזם Gal4ן (Wu et al., 2003; Krashes et al., 2009) (איור 3א), ובמקביל ל-OK107ו (Connolly et al., 1996; Aso et al., 2009) (איור 3ב). זה איפשר לנו לעקוב אחר נוירון dNPF ממוצע אחד ואחר פעילות שמתרחשת בו זמנית ברגלית ה-MBו הנמצאת באותו צד, שנוצרת על ידי האקסונים של ה-KC-ים, כבקרה פנימית על הישימות של הכנת ההדמיה שלנו (איור 3ג, ד). ההכנה של זבוב חי ושלם הגבילה את הגישה שלנו לשני נוירונים צדדיים של dNPF. עם זאת, בשימוש בהכנה זו, הצלחנו לשמור על שלמות החיה כולה, שהינה קריטית כאשר חוקרים שאלות של משיכת גירוי או תלות הקשר בתפקוד המוח, ואפשרה לנו להתאים באופן זהה פרמטרי הצגת גירוי לניסויים התנהגותיים ועצביים כאחד.

נוירון ה-dNPF הגיב לרוב הריחות, אם כי עם מגוון רחב של רמות פעילות (איור 3ה – ז). בממוצע, התגובות היו גבוהות משמעותית לריחות מזון מאשר לריחות שאינם מזון. התגובות הממוצעות לריחות מזון היו גם גבוהות משמעותית מריחות שאינם מזון (ANOVA דו כיוונית, קטגוריה: F_(1,34) = 45.485, p < 0.000), אפילו בזבובים המוזנים (מזון לעומת לא מזון, זבובים מוזנים בלבד: t = 3.211, p = 0.005). ראוי לציין, לא רק שנוירון dNPF הגיב לריחות מזון, הוא עשה זאת באופן תלוי בשובע (ANOVA דו כיוונית, שובע: F_(1,34) = 10.889, p = 0.003, שובע × קטגוריה: F_(1,34) = 4.376, p = 0.035) (איור 3ה – ז). חמישה מתוך שישה ריחות מזון טבעי מורכבים עוררו היענות תלוית מצב עם פעילות גבוהה משמעותית שנצפתה בזבובים מורעבים, בעוד 12 מתוך 13 ריחות שאינם מזון נותרו ללא שינוי למעט 1-פרופנול. יתר על כן, נוירון ה-dNPF הראה דרגות שונות של היענות לריחות מזון שונים כאשר הקשר בין הריחות נשמר בדרך כלל הן בזבובים השבעים והן במורעבים (למשל, שמרים>בננה>acv).

למרבה הפלא, משרעת התגובה של נוירוני dNPF הייתה בקורלציה גבוהה לאטרקטיביות ריח המזון שנקבעה באופן התנהגותי: ככל שתגובת dNPF גדולה יותר, כך המשיכה (r = 0.956, p < 0.0001, על פני ריחות מזון ומצבי שובע; איור 3ח). למרות שהמתאם בין הפעלת dNPF למשיכה לריחות מזון היה חזק במיוחד במצב המורעב (r = 0.98, p < 0.0001), הוא היה משמעותי כאשר שקלו רק נתונים ממצב השובע (r = 0.77, p = 0.045). לעומת זאת, למרות שהתגובות ברגלית היו חזקות לכל הריחות שנבדקו, הפעילות לא הייתה קשורה לא ל-dNPF ולא לפרופילים התנהגותיים, ללא מזון שנצפה תלוי במצב: (r = —0.156, p = 0.46; איור 3ט). לא פעילות dNPF ולא פעילות הרגלית בקורלציה עם משיכה לריחות שאינם מזון (dNPF: r = —0.305, p = 0.166; רגלית: r = —0.196, p = 0.53; איור 3ח, ט).

בהתחשב בקורלציה החזקה בין משיכת ריח מזון לבין המשרעת של פעילות dNPF, ניתן לצייר סף כדי לקבוע את רמת פעילות dNPF הדרושה כדי לעורר התנהגות משיכה לריח המזון (קו מקווקו איור 3ז). ריחות מזון שיצרו התנהגות משיכה צפויים לעורר גם רמות פעילות מעל סף זה. ריחות שאינם מזון שיצרו התנהגות משיכה (למשל, cVA פרומון המין) לא היו צפויים לעורר רמות פעילות מעל סף זה. אף פעילות כתוצאה מריח שאינו מזון לא עברה באופן משמעותי את הסף הזה, כולל ארבעת הריחות שאינם מזון שעוררו משיכה התנהגותית (איור 1ד). לעומת זאת, חשוב לציין כי כל ריחות המזון שעברו את הסף הזה יצרו משיכה התנהגותית, כולל מחצית מריחות המזון במצב השבע. תצפית זו תומכת ברעיונות שפעילות dNPFו: (1)ן מתייחסת לאטרקטיביות אך ורק לריחות מזון ו-(2) אינה רק אות רעב.

הפעילות של נוירון dNPF היא הכרחית ומספיקה כדי להגדיר אטרקטיביות ריח מזון

כדי לברר אם נוירון dNPF הכרחי בתיווך המשיכה הנצפית שלנו לריחות מזון, הבענו את ערוץ האשלגן המתקן פנימה KIR2.1, המעכב את יצירת פוטנציאל הפעולה (Baines et al., 2001), בנוירוני dNPFו. KIR2.1 בא לידי ביטוי תחת בקרת Gal80^ts רגישה לטמפרטורה כדי להקל על בלבול התפתחותי אפשרי. ב- 20°Cו, Gal80^ts מעכב את פעילות Gal4 וחוסם ביטוי של KIR2.1, בעוד שב- 30°Cו Gal80^ts מושבת, ומשחרר ביטוי KIR2.1 מונחה Gal4ו (McGuire et al., 2004). בקרות הורים הציגו רמות משיכה אופייניות לשמרים, הריח המועדף ביותר בפאנל שלנו, במצב המורעב ללא קשר לשינויים בטמפרטורה (איור 4א,ב). לאחר מכן בדקנו את המשיכה של זבובי dNPF-Gal4/UAS- KIR2.1Gal80^ts לשמרים. בטמפרטורות מתירניות (20°C), זבובי dNPF-Gal4 /UAS-KIR2.1Gal80^ts הציגו פרופיל משיכה רגיל. עם זאת, לאחר שהלם חום של 30 מעלות צלזיוס (3 d), כדי לבטא את המשיכה הערוצית לשמרים, דוכא כאשר אחוז הזבובים ברביע הריחני הגיע רק לרמות מקריות (מבחן t מזווג, t = 0.05, p = 0.95).

מכיוון ש-dNPF בא לידי ביטוי ב~20–25 נוירונים במוח הבוגר (Lee et al., 2006), אנו ביקשנו לאחר מכן לקבוע אם תת-הקבוצה ספציפית של ארבעת נוירוני dNPF אשר גם ניטרנו וגם עשינו בה מניפולציה נדרשים למשיכת ריח מזון. מתוך נוירוני dNPF הנמצאים הן אצל גברים והן אצל נקבות (Lee et al., 2006), נוירוני dNPF עשויים להיות מסווגים באופן נרחב לשתי קבוצות נפרדות עיקריות על בסיס גודל סומה ולוקליזציה: (1) ארבעת הנוירונים הגדולים של dNPF-חיובי, המסומנים על ידי מה שמכונה dNPF-Gal4 המשמש במחקר זה ומאופיין באחרים (Shen and Cai, 2001; Wu et al., 2003; Krashes et al., 2009), מרווחים יפה על פני שתי ההמיספרות עם נוירון דורסומדיאלי אחד גדול ונוירון רוחבי אחד גדול לכל המיספרה; וכן (2) כשבעה נוירונים קטנים יותר של dNPF וקריפטוכרום (cry)-חיוביים המקובצים לרוחב בכל המיספרה, אשר ניתן להמחיש ולמקד, יחד עם ארבעת הנוירונים הגדולים של dNPF-חיובי שאנו מתארים, על ידי מה שנכנה לבהירות במחקר זה כקו dNPF2-Gal4, שאופיין בעבר (Lee et al., 2006; Hermann et al., 2012). הבענו את הגן האפופטוטי head-involution defective ו(hid) באמצעות קו dNPF2-Gal4 כדי לכרות גנטית ~ 20 נוירוני dNPF לכל מוח (McNabb et al., 1997). אבלציה גנטית של המשלים הגדול הזה של תאים חיוביים ל-dNPF הובילה לירידה מוחלטת במשיכה לריח השמרים בזבובים מורעבים (בדיקת t מזווגת, לעומת אוויר רגיל, dNPF2/ hid: t = 0.23, p = 0.82; איור 4 ג, ד). מכיוון ששבעת התאים הרוחביים הקטנים יותר של dNPF-חיוביים הם cry-חיוביים וארבעת התאים הגדולים יותר של dNPF-חיוביים אינם (Hermann et al., 2012), הצלחנו להדחיק את הביטוי של hid במיוחד בתאים אלה תוך שמירה על אבלציה של ארבעת התאים הגדולים של dNPF-חיובי באמצעות cry-Gal80. זבובים המבטאים UAS-hid / cry-Gal80; dNPF2-Gal4 ביצעו פנוקופי על זבובי dNPF2-Gal4/UAS-hid עם אובדן מוחלט של משיכה שמרים (מבחן t מזווג, לעומת אוויר רגיל, dNPF2;hid/cryGal80: t = 0.97, p = 0.38). עם זאת, אבלציה של תאי cry-חיוביים בלבד (cry-Gal4 / UAS-hid) לא שינתה את המשיכה לשמרים (מבחן t מזווג, לעומת אוויר רגיל, cryGal4 / hid: t = 12.56, p < 0.0001), מה שמרמז על כך שתת-הקבוצה של ארבעת הנוירונים הגדולים של dNPF שעליהם אנו מדווחים הם התאים הרלוונטיים למשיכה לריח המזון.

בנוסף, כדי לקבוע את התפקיד של פפטיד dNPF באופן ספציפי, הרסנו קולטני dNPF על פני המוח הזבוב. השתקת קולטני dNPF (elav-Gal4/UAS-npfr1^dsRNA)I גרמה לפנוקופי הן של ההשתקה הזמנית והן של האבלציה הגנטית של ארבעת הנוירונים הגדולים של dNPF-חיוביים (איור 4ה, ו).

משיכה לשמרים בוטלה בזבובים מורעבים (מבחן t מזווג, לעומת אוויר רגיל, t = 0.75, p = 0.49). זה תומך בתיאוריה שלנו כי נוירופפטידים dNPF הם קריטיים בתיווך המשיכה לריח מזון שראינו.

הניסויים לעיל מראים כי dNPF הוא חלק קריטי של המעגלים שבבסיס המשיכה לריח המזון כי השתקת נוירונים אלה מבטלת משיכה אפילו לריח המזון האטרקטיבי ביותר בפאנל שלנו. לאחר מכן רצינו להוכיח שאנחנו יכולים להשפיע על התנהגות המשיכה של הזבובים באופן צפוי על ידי הגברת הפעילות של נוירוני dNPF בזבובים המוזנים. כדי לקבוע דיות, הפעלנו באופן סלקטיבי נוירוני dNPF על ידי ביטוי חוץ רחמי של ערוץ פוטנציאל קולטן חולף (TRP) וdTRPA1 של תסיסנית המחקר, אשר מרגש את תאי היעד על ידי הובלת Ca ^2+I בטמפרטורות > 25 מעלות צלזיוס (Hamada et al., 2008), בנוירוני dNPF. גירוי של נוירוני dNPF ב-30°C הוביל את זבובי UAS-dTRPA1/+; dNPF-Gal4 להציג רמות גבוהות יותר של משיכת ריח ביחס לטמפרטורה ולבקרות הורים (ANOVA דו כיווני, טמפרטורה, F_(1,18) = 74.8, p < 0.0001; ריח, F_(2,54) = 40.24, p < 0.0001; טמפרטורה × ריח, F_(2,54) = 6.34, p = 0.003; איור 5א, ב). משיכה אסימפטוטית התעוררה לעבר ריח המזון הלא אופטימלי ACV, אשר בדרך כלל מייצר משיכה צנועה בלבד גם במצב המורעב (איור 1ד). בנוסף, המשיכה קודמה לריחות חד-מולקולריים אשר בדרך כלל מושכים במעט (אתיל אצטט) ודוחים במעט (2-מתילבוטנול) (איור 5ב). פרופילי משיכה לריחות בודדים לאחר הפעלה סלקטיבית נראו כמשקפים סיכום של dTRPA1 – ופעילות רגילה המעוררת בעקבות ריח (איור 3ז). עליות במשיכה לריח ב-30°C גם התאימו לעלייה ברמת הפעלת dNPF בעקבות dTRPA1 כאשר זבובים הנושאים את שני הטרנסגנים dNPF-Gal4 הציגו משיכה חזקה יותר לריחות חד-מולקולריים ביחס לזבובים הנושאים רק עותק אחד של הטרנסגן dNPF-Gal4 (בשילוב עם UAS-dTRPA1) (איור 5ב). חקירת ההשפעה של הגברה נוספת של פעילות dNPF לא הייתה אפשרית מכיוון שזבובים הומוזיגוטיים עבור dNPF-Gal4 ו-UAS-dTRPA1 הציגו משיכה ניכרת לכל הריחות בצורה לא רגישה לטמפרטורה. ראינו פנוטיפ דומה עבור זבובים הומוזיגוטיים עבור UAS-dTRPA1 בהיעדר Gal4 (נתונים לא מוצגים).

רמת פעילות dNPF מנבאת העדפת ריח מזון כאשר שני ריחות מוצגים בתחרות

מכיוון שזבובים הגיבו לריחות מזון בודדים בדרגות שונות, בעוצמה הקשורה ברמה גבוהה לרמת הפעלת dNPF, שיערנו כי הפעילות של נוירון dNPF עשויה לשמש בקידוד האטרקטיביות היחסית של הריחות המוצגים בקנה מידה פנימי משותף. העדפה לאפשרות ריח מזון פוטנציאלית אחת על פני אחרת, אם כן, תיקבע על ידי השוואת רמות של פעילות dNPF שעורר כל ריח מועמד ולאחר מכן תיחקר עם כמות הפעילות הגדולה יותר. כדי להעריך העדפה, הצגנו לראשונה שני ריחות שונים בו זמנית. זבובים נאלצו כעת לבחור בין שני ריחות ששניהם נחשבו בעבר לאטרקטיביים כאשר הוצגו לבדם (לעומת אוויר מסונן). אכן, ניתן היה להשתמש בנתונים העצביים כדי לחזות לאיזה ריח נמשכו הזבובים יותר. שמרים, הריח עם הפעלת dNPF הגבוהה ביותר (ראה איור 3ה – ז), נבחר על פני ריחות מזון אחרים כאשר הוצג בתחרות.  הזבובים בעיקר התעלמו מריחות הבננה ו-ACV אם הוצגו בחברת שמרים. זבובים נעו במהירות לכיוון ריח השמרים ונשארו שם למשך הניסוי (איור 6א, ב, ד, ה). כאשר הריחות הפחות מועדפים הוצגו בתחרות, בננה הועדפה על פני ACV כפי שחזינו מההבדל במשרעת התגובה של dNPF (איור 6ג, ו). בהסתכלות על עקבות ניסוי בודדים (איור 6ג), נראה היה כי זבובים מתנדנדים בין שני הריחות כאילו קביעת הרצון לריח הייתה קשה יותר כאשר ההבדלים בתגובות dNPF היו צנועים.

לאחר מכן, יצרנו עקומה נוירומטרית על ידי שינוי הריכוז של ריח השמרים המועבר לזבובים ובחינת שינויים בתגובות dNPF ביחס לתגובה לריכוז יחיד של ACV. לאחר מכן בדקנו משיכה התנהגותית לריכוזים המקבילים של שמרים ו-ACV כדי ליצור עקומה פסיכומטרית. לבסוף, שאלנו אם הבדלים בתגובות dNPF תלויות ריכוז, בעקבות שמרים יכולים לחזות העדפה בין משיכה ל-ACV ולשמרים בריכוזים שונים אלה. ריכוזים מוגברים של שמרים יצרו רמות גבוהות יותר של פעילות dNPF (איור 6ז). התגובה המעוררת עקב ACV נפלה בתוך התגובות המדורגות לשמרים. העקומה הפסיכומטרית שיקפה את העקומה הנוירומטרית (איור 6ח). בנוסף, השוואה של רמות שונות של פעילות dNPF המעוררים על ידי ריכוזים שונים של שמרים ביחס לזה שעורר ריכוז יחיד של ACV יכול לשמש כדי לחזות לאיזה ריח הזבובים יימשכו יותר (איור 6ט). כאשר הוצגו בו זמנית, שמרים נבחרו על פני ACV רק כאשר ריכוז נתון של שמרים עורר רמות פעילות dNPF גבוהות יותר מזה שהופק על ידי ACV. זבובים בחרו ACV על פני שמרים כאשר ריכוז השמרים היה נמוך מספיק כדי לייצר רמה של פעילות dNPF מתחת לזאת המיוצרת על ידי ACV. יחד, נתונים אלה מראים כי למרות שפעילות המעוררת על ידי ריח בנוירוני dNPF מתואמת עם משיכה לריחות שונים, הפעילות יכולה גם להיות מדורגת בתוך ריח אחד והוא יכול לשמש ככלי לחזות את מידת ההעדפה שריח מחזיק על ריחות יריבים.

דיון

הערכת מקורות מזון פוטנציאליים מספקת מסגרת הולמת לטיפול בייצוג ערך במוח בהתחשב בנפוצותה של חיפוש המזון בטבע. רוב בעלי החיים, כולל תסיסנית המחקר, בעלי הבחנה חדה לגבי מקורות המזון שאליהם כדאי לגשת, גם כאשר ניתנה להם הבחירה בין אפשרויות מעשיות מרובות  (Dobzhansky et al., 1956; Ruebenbauer et al., 2008), וריחות הם אחד הרמזים החושיים החשובים ביותר וכל בעלי החיים משתמשים בהם כדי לעקוב, להעריך, ולבחור בין מזונות זמינים (Dethier, 1976; Wilson and Ste- venson, 2006; Asahina et al., 2008; Chow and Frye, 2009). עבור מינים כלליים בעלי נישות רחבות ודיאטות מגוונות, כגון זבובי הפירות או פרימטים, הבעיה של גישת ריח המזון מסובכת עוד יותר על ידי הצורך לבחור את הטוב ביותר האפשרי מאפשרויות רבות על פני מגוון סביבות (Keller, 2007). זה דורש גמישות ממיקום למיקום ולכן ייתכן ואין התחשבות על ידי החיווט הקשיח בפריפריה של המוח. אנו מדווחים כי ריחות מזון שונים מעוררים רמות שונות של גישה בתסיסנית המחקר וכי גישה זו משתנה כפונקציה של הקשר (איור 1). למרבה הפלא, ניתן להסביר את טווח ההתנהגות שאנו מתבוננים בו בתוך ובין ריחות המזון על ידי התבוננות בפעילות המעוררת על ידי הריח של נוירוני dNPF בתוך המוח המרכזי (איורים 3 ו -6), המדגימים את האפשרות של אחד מכמה אתרי מוח נפרדים המקודדים במפורש את ערך הריח.

אנו מראים כי פעילות עצבית dNPF והתנהגות ריח המזון מתואמים מאוד: ככל שתגובת ה-dNPF מעוררת הריח רבה יותר, כך המשיכה לריח זה רבה יותר (איורים 1 ו-3). בנוסף, ניתן להשתמש בהיענות המדורגת של נוירון זה כדי לחזות בחירה כאשר שני ריחות נמצאים בתחרות שבה האפשרות עם רמת הפעילות הגבוהה יותר עדיפה (איור 6). נוירוני dNPF מגיבים יותר לריחות מזון ורמות הפעילות מועצמות גם כדי להסביר קשר פנימי, כלומר גדלות עם הרעב, אשר משתקף על ידי שינויים תואמים בהתנהגות (איורים 1 ו-3). התגובות של תת-הקבוצה של נוירוני dNPF אותם ניטרנו באמצעות הדמיה פונקציונלית חיוניות כדי לתווך את התנהגות המשיכה לריח המזון הנצפית (איור 4) ומספיקות כדי לקדם משיכת ריח לריחות חד-מולקולריים, אפילו אלה שנחשבים בדרך כלל כמרתיעים (איור 5).

הפעילות המעוררת אינה מייצגת לא את זהות הריח האישי ולא את מצב הרעב הגלובלי במוח. רמות התגובות העצביות וההתנהגותיות שנצפו עבור ACV במצב המורעב ושמרים במצב השבע ממחישות נקודות אלה היטב. שניהם מעוררים את אותה רמת פעילות ומפקדים על אותה מידת משיכה אך שונים ביחס לזהות הריח ומצב השובע. בנוסף, רמות גבוהות יותר של פעילות (והתנהגות משיכה) קיימות ללא תלות בשאלה האם ריח המזון היה כזה שעמו הזבובים היו בעלי ניסיון קודם (שמרים, המהווים חלק מהמדיום הסטנדרטי שעליו גדלים זבובים) או היה חדשני (2 מתוך 5 ו-5 מתוך 5 ריחות פירותיים, במצבי השובע והרעב, בהתאמה) (איור 3ז). הנתונים גם מציעים סף של פעילות dNPF הדרוש כדי לעורר התנהגות משמעותית של משיכה לריח המזון. מתגובות גבוהות משמעותית בקטגוריית ריח מזון ועד להסתפקות בתיווך תגובות התנהגותיות דמויות ריח מזון לריחות לא מושכים בעבר, נוירון dNPF עונה על כל הקריטריונים המתוארים לקוד ערך הריח.

תפקיד חדשני עבור סימון נוירופפטידים

dNPF, וההומולוג היונקי NPYו (Brown et al., 1999; Garczynski et al., 2002; Nassel and Wegener, 2011), ידועים זה זמן רב כממלאי תפקיד בביסוס מצבי רעב/שובע וככאלה ממלאים תפקיד קריטי בוויסות היבטי המוטיבציה של צריכת המזון (de Bono and Bargmann, 1998; Wu et al., 2003, 2005; Day et al., 2005; Keen-Rhinehart and Bartness, 2007; Krashes et al., 2009; Xu et al., 2010). ואכן, עבודות קודמות ממחישות כי dNPF מעורב בהזנה מונחית ריחות (Wang et al., 2013) ועיבוד תגמול בכלל (Shohat-Ophir et al., 2012). עם זאת, זיהוי כי dNPF מתואם עם רמת המשיכה, ואפילו העדפה בין, ריחות מזון בודדים שופך אור חדש על האופן שבו הוא עשוי לווסת התנהגויות הקשורות למזון ומציע כי אפנון עצבי באופן כללי עשוי לשחק תפקיד מפורש יותר בקידוד חושי מאשר הובן בעבר. הגישה שלנו מאפשרת לנו להמשיך לחקור תפקידים מובנים בדרך כלל עבור נוירומודולטורים בעיבוד חושי, מה שמרמז כי הם לא רק שער, גיוס או דיכוי ירי מעגל. במקום זאת, זיהינו רמות מדורגות של פעילות מתאים נוירומודולטוריים שיכולים להיות קשורים ישירות לערך הריח בכל הקשור להתנהגות של חיפוש מזון.

עיבוד סלקטיבי במוח המוקדם לעומת המרכזי

הרוב המכריע של הנוירונים במערכת הריח המוקדמת של יונקים וחסרי חוליות מכוונים באופן רחב, מגיבים למגוון גדול של סוגים שונים של ריחות (Wang et al., 2001, 2003; Fishilevich and Vosshall, 2005; Wilson and Mainen, 2006; Lin et al., 2006; Kreher et al., 2008; Riffell et al., 2009; Johnson et al., 2010). פרופילי תגובה לא-ספציפיים אלה פירושם כי ORN-ים או PN-ים בודדים בתסיסנית המחקר המגיבים לריח אטרקטיבי מבחינה התנהגותית יכולים גם להגיב עם כוח שווה לריח מרתיע מבחינה התנהגותית (Wang et al., 2001, 2003; Fishilevich and Vosshall, 2005; Kreher et al., 2008; Semmelhack and Wang, 2009). למרות שהראיות המתעוררות מצביעות על כך שייתכן שיש ייצוג טופוגרפי רחב של ריחות אטרקטיביים ומרתיעים על פני מספר פקעיות בתוך ה-ALו(Knaden et al., 2012), ייצוגי ריח ברמה זו נראים מופצים, כאשר הדרך הטובה ביותר לצפות התנהגות היא על ידי בחינת הפעילות של המשלים המלא של ORN-ים או PN-ים, עבור זחלים ומבוגרים, בהתאמה (Kreher et al., 2008; Knaden et al., 2012).

לעומת זאת, בתאי עצב בודדים של dNPF, כל הריחות שאינם מזון שנבדקו, כולל רכיבים בודדים של ריחות מזון או ריחות אטרקטיביים שאינם מזון, מעוררים רק רמות נומינליות של פעילות, בעוד שריחות מזון טבעיים מעוררים רמות פעילות התואמות מאוד להתנהגות של מחפשי מזון. הדבר ניכר ביותר בזבובים רעבים, שבהם הפעילות העצבית והמשיכה ההתנהגותית גדלות, אך נכון גם לגבי הזבובים השבעים המגיבים לריחות מזון אטרקטיביים במיוחד. רמות הפעילות בנוירוני dNPF תואמות למגוון של משיכה למגוון ריחות מזון שונים. רמות הפעילות המועלות על ידי ריחות בודדים יכולות אפילו לשמש לחיזוי העדפת ריח מזון כאשר שני ריחות אטרקטיביים מוצגים בתחרות זה עם זה. מאפיינים אלה של פעילות dNPF: משקפים ישירות גירוי מעניין (Lebreton et al., 2009; Jenison et al., 2011), לחזות העדפה כאשר מתמודדים עם אפשרויות מתחרות (Tremblay and Schultz, 1999; Padoa-Schioppa and Assad, 2006), והתחשבות בשינויים בהקשר למוטיבציה, כגון רעב, המשפיעים על ההתנהגות (Montague and

איור 5. הפעלת נוירון dNPF מספיקה כדי לייצר משיכת ריח, אפילו לריחות שאינם קשורים למזון. א, היסטוגרמות דו-ממדיות לדוגמה המציגות ספירת זבובים מצטברת על פני תא הריח עבור זבובי UAS-dTRPA1/+;dNPF-Gal4 שבעים שנבדקו ב-18°C וב-30°C (בלוק אפור) החשופים לריחות אטרקטיביים בדרך כלל (ACV), מעט אטרקטיביים (ea) ומרתיעים (mbut). זבובי UAS-dTRPA1/+;dNPF-Gal4 מראים עלייה ניכרת במשיכה לכל הריחות שנבדקו ב-30 מעלות צלזיוס. ב, משיכת ריח ממוצעת לזבובי UAS-dTRPA1/+;dNPF-Gal4 ב-18 מעלות צלזיוס וב-30 מעלות צלזיוס.  הפעלה של נוירון dNPF מקדמת משיכת לריח.

*p < 0.05ו, 18°C לעומת 30°C.  זבובים הנושאים עותקים מרובים של טרנסגן dNPF-Gal4 בשילוב עם UAS-dTRPA1 מראים רמות גבוהות של משיכה לריח ביחס לזבובי dNPF-Gal4/UAS-dTRPA1 הטרוזיגוטיים. Fp < 0.05, שונה מזבובי dNPF-Gal4/UAS-dTRPA1 הטרוזיגוטיים. +, הטרוזיגוטיים לטרנסגן נתון; ++, הומוזיגוטיים עבור טרנסגן נתון. n = 10 קבוצות זבובים עבור כל תנאי, מואכלים. קווי שגיאה מציינים SEM.

King-Casas, 2007; Rangel et al., 2008; Grabenhorst and Rolls, 2011), מה שהופך אותו למתאים עבור קידוד ערך במפורש, במיוחד של ריחות מזון.

באפיון הספציפיות של פעילות dNPF להתנהגות משיכה לריח מזון במיוחד, אנו מסוגלים לתמוך ברעיון כי ייתכנו מרכזי עיבוד ערך נפרדים המתמחים בהערכת סוגים מסוימים של גירויים, אפילו בתוך מוח הזבוב. אנו משערים כי קבוצות נפרדות של נוירונים עשויות להיות אחראיות, למשל, לערך הקשור למין ובכך לתווך התנהגות של משיכה לפרומון cVA, בעוד שתת-קבוצות עצביות אחרות עשויות להיות אחראיות למשיכה לקטגוריות אחרות של ריחות.

סביר להניח כי תאי מוח מרכזיים עם תכונות תגובה מקיפות של הערכת ריח מזון של נוירון dNPF אינם מוגבלים רק לתסיסנית המחקר, אם כי עדיין לא היו מבודדים. בקופים ובחולדות, אוכלוסיות של נוירוני היפותלמוס צדדים וקליפת המוח חזיתיים מגיבים לרמזים צפויים הקשורים למזון באופן התלוי במצב השובע (Rolls, 2002). אצל בני אדם, הראיות מצביעות על כך שייתכן שקיימת חפיפה משמעותית באזורים המופעלים על ידי ריחות מזון ואזורים האחראים לעיבוד הערך ההדוני של גירויים כימוסנסוריים (Small et al., 2001; O’Doherty et al., 2002). כמו בתסיסנית המחקר, הפעילות באזורים אלה יכולה להיות מווסתת גם על ידי מצב שובע (Tataranni et al., 1999). נוירונים אלה ממוקמים באותם אזורים בבני אדם ובפרימטים לא אנושיים המציגים תכונות תגובה התואמות עם הקידוד של ערך הדירוג בקנה מידה משותף (Padoa-Schioppa and Assad, 2008; Lebreton et al., 2009).

המוח המרכזי מפריד בין זהות ריח לבין קידוד ערך הריח

למרות שאוכלוסיות נוירונים בשלבים המוקדמים של עיבוד חוש הריח, ORN-ים ו-PN-ים בתסיסנית המחקר, סביר להניח שברשותם מידע התורם לקידוד של זהות ריח ואטרקטיביות ריח  (Suh et al., 2004; Kreher et al., 2008; Semmelhack and Wang, 2009; Ai et al., 2010; Root et al., 2011), התוצאות שלנו מצביעות על כך שהמוח המרכזי עשוי להפריד ייצוגים חושיים והדוניים של ריחות. למרות שאנו מכירים בכך שבפועל דפוסי הירי מעוררי הריח של הנוירונים שאנו חוקרים עשויים להכיל מידע נוסף שאינו קיים באותות הסידן האיטיים יותר שאנו רואים, התוצאות מרמזות. פעילות dNPF גבוהה יותר לריחות מזון, אך היא אינה מבחינה בין זהותם, אלא רק את האטרקטיביות היחסית שלהם, הניתנת לשינוי עם רעב. זה מתואם עם מה שאנחנו משערים הוא ערך ריח מזון. לעומת זאת, עם דפוסי התגובות הספציפיים לריח שלהם והטיפול הלא ברור בריח טבעי ומונומולקולרי, מעורר תיאבון או מרתיע (איור 2) (Turner et al., 2008; Honegger et al., 2011)ו, נראה כי MBןKC-ים מעבדים זהות ריח ייחודית. הפרדה זו מספקת תובנה למאפיינים כלליים יותר של עיבוד מידע במוח, מה שמרמז על האפשרות שגירויים חיצוניים מחולקים למרכיבי תכונות, שמהן זהות וערך מעורר תיאבון עשויות להיות רק שתיים. המתיחה של מודל זבוב הפירות צריכה גם לספק רמזים לגבי המקורות האבולוציוניים ו/או הקרובים של הערך שאנו מתארים. בהתחשב בכך שייצוגי זהות וערכים נראים כמסתעפים במוח המרכזי, אנו מעוניינים לראות אם אחד מהם או שניהם ניתנים לשינוי כפונקציה של ניסיון.

איור 6. (בדף הבא) רמת פעילות dNPF מנבאת העדפה כאשר שני ריחות מזון נמצאים בתחרות. א, קורסי זמן לדוגמה של אחוז הזבובים ברביעים ריחניים עבור שמרים ובננה כאשר הם מוצגים בו זמנית לרבעים נפרדים שנמדדו כל 10 שניות לתקופת הבדיקה של 10 דקות. ב, אחוזים כאשר שמרים ו-ACV, ו (ג) בננה ו-ACV מוצגים בו זמנית. ד-ו, העדפה ממוצעת עבור שמרים ובננה (ד), שמרים ו- ACVו (ה), ובננה ו- ACV (ו) כאשר מוצגים בנפרד לעומת אוויר מסונן או בו זמנית לרבעים נפרדים. נתונים על ריחות בודדים לעומת אוויר מסונן הוצגו בעבר באיור 1. Fp < 0.05, שונה ממשיכה לריח לעומת אוויר מסונן. n = 5 קבוצות זבובים לכל תנאי, מורעבים. ז, ממוצע משולב ריח-תגובה של נוירון dNPFו (0-5 שניות לאחר תחילת גירוי) למגוון של ריכוזים של שמרים (ירוק) וריכוז יחיד של ACV (כתום). n = 10 קבוצות זבובים לכל תנאי, מורעבים. ח, משיכה מתאימה לאותו טווח של ריכוזים. n = 8 קבוצות זבובים לכל תנאי, מורעבים. ט, העדפה ממוצעת לשמרים לעומת ACV כאשר ריכוז ריח השמרים משתנה. ריכוזי שמרים i-iii מצויינים בז’.*p < 0.05, שונה ממשיכה ל-ACVו. n = 8 קבוצות זבובים לכל תנאי, מורעבים. קווי שגיאה מציינים SEM. מיקומים של רבעים ריחניים במפתח קבועים למטרות תצוגה בלבד; מיקומים בפועל היו אקראיים.