אפרוציטוזיס מידע תומך Saturated-efferocytosis generates pro-resolving CD11blow macrophages – SUPP-MATERIALS

אפרוציטוזיס רווי מייצר מקרופאגים CD11blow מעודדי רזולוציה: אפנון על ידי רזולבינים וגלוקוקורטיקואידים

מתודולוגיה

צפקת מכרסמים

עכברי C57BL/6 זכרים (גיל 6-8 שבועות) קיבלו זריקות של זימוסאן A (1mg בתוך 1 ml). לאחר 66 שעות העכברים הורדמו עם CO2 והאקסודציה נאספה על ידי שטיפה עם 5 ml של תמיסת מלח סטרילית. תאי האקסודציה הוכתמו על קרח במשך 20 דקות עם נוגדן- Ly-6G של חולדות בצימוד-FITC (שיבוט RBC-8C5), נוגדן-F4/80 של חולדות בצימוד-PE (שיבוט CI:A3-1) ונוגדן-עכברים CD11b של חולדות בצימוד-PerCP (שיבוט M1/70; 1 μg כל אחד), נשטפו פעמיים עם 1% BSA בתוך PBS, ונותחו בעזרת FACSCalibur. בחלק מהניסויים המקרופאגים מוינו לאוכלוסיות CD11bhigh ו- CD11blow בזיקוק של > 95% באמצעות FACSaria, והאוכלוסיות הנפרדות שימשו לניתוח מיקרוסקופי וגירוי ex vivo. בחלק מהניסויים הוזרק דיו ירוק PKH2-PCL (0.25 μM, 0.5 ml) לאחר 48 שעות ותאי הצפק נאספו 4 שעות מאוחר יותר, עברו immunostaining עבור F4/80 ו- CD11b כפי שתואר קודם, ועברו ניתוח עבור אינטנסיביות פלורוסנטית של אוכלוסיות מקרופאגים שונות. בניסויים הרלוונטיים, הוזרקו נוזל הבקרה, RvD1, RvE1 (100 ng/mouse כל אחד) או Dex (25 μg לעכבר) לצפק 48 שעות מתחילת הצפקת, והאקסודציה נאספה לאחר 66 שעות ונותחה כפי שתואר קודם.

ניתוח תספיג חלבון

תמציות חלבון ממספר זהה של תאים (1 x 106 תאים) של האוכלוסיות הממוינות של CD11bhigh ו- CD11blow (3 ניסויים בלתי תלויים) הורצו תוך שימוש ב- 10% SDS-PAGE (5 μg/lane, ג’ל בודד), הועברו (שעה אחת, 15V) לממבראנות ניטרוצלולוזה, נחסמו לשעה אחת עם 5% BSA בתוך TBST ועברו תספיג חלבון במשך הלילה ב- 4oC עם נוגדן-עכברים CD11b של עזים (M-19, 1:200) נוגדן-עכברים iNOS של ארנבים (ab3523, 1:1000), נוגדן-עכברים ארגינאז-1 של עזים (ab60176, 1:20000), נוגדן-עכברים COX-2 של ארנבים (160126, 1:1000), נוגדן-עכברים MMP-9 של עזים (AF909, 1:500), אקטין נוגדן-עכברים של עזים (I-19, 1:500), טובולין נוגדן-עכברים של עזים (H-235, 1:600), או נוגדן-עכברים GAPDH של ארנבים (25778, 1:800).  לאחר מכן הממבראנות נשטפו 3 פעמים עם TBST, ועברו אינקובציה עם הנוגדן המשני בצימוד-HRP (1:10000, שעה אחת, טמפרטורת החדר). התספיגים נשטפו ופותחו באמצעות ערכת כמילומינציה EZ-ECL, ונותחו בעזרת אנלייזר לומינציה LAS-4000 ותוכנת TotalLab TL-100.

מיקרוסקופיה קונפוקלית

המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow הממוינים בודדו ו- 2 x 105 תאים נטענו עם 5 nM דיו אדום DND 99  של LysoTracker במשך שעתיים ב- 37oC ב- RPMI. התאים הונחו על סליידים Poly-Prep במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והוכתמו עם Hoechst ונוגדן-עכברים Ly-6G בצימוד-FITC. הסליידים נשמרו בחושך ב- 4oC ונותחו במיקרופסקופיה קונפוקלית. הצילומים נלקחו בטמפרטורת החדר באמצעות מערכת קונפוקלית Zeiss LSM 510 META המחוברת למיקרוסקופ ממונע הפוך Zeiss Axiovert 200M עם עדשה אובייקטיבית 63x/1.4 DIC באימרסיית שמן. אורכי גל אקסיטציה של 405, 488 ו- 561 nm ומעבר פס גילוי של 420-480, 505-555 ו- 575-613 שימשו לגילוי Hoechst, FITC ודיו אדום LysoTracker, בהתאמה. חתכי-Z קונפוקליים בעובי 1 μm עברו דימות. הצילומים עובדו עם תוכנת Zeiss LSM Image Browser.

מספור הבליעה של PMN אפופטוטיים

המקרופאגים של האקסודציה הופרדו באמצעות חרוזים מגנטיים PE או מקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow (2 x 105), הונחו בשכבות על שני cover slips, קובעו עם 2% PFA במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, הוכתמו עם Hoechst, ומוספרו עם מיקרוסקופ פלורוסנטי. שני אזורים של כל cover slip, שכל אחד מהם מכיל לפחות 50 מקרופאגים (200 בסך הכול) עברו ניתוח, וחישבנו את המספר הממוצע של PMN שנבלעו בכל מקרופאג ואת המקרופאגים עם הרף של בליעת ה- PMN. הישויות האפופטוטיות במיקרוסקופיה הפלורוסנטית זוהו על ידי הכתמה ספירלית בהירה עם Hoechst בטווח גודל של 1-10 mM. הישויות הבודדות נמצאו בפגוליזוזום אחד שזוהה באמצעות הכתמת LysoTracker ומיקרוסקופיית שדה בהיר קונפוקלית, ומספור הישויות המזוהות בוצע עבור כל מקרופאג ולאחר מכן נותח לפי הפרמטרים המצוינים. מצאנו מספר גדול יותר של ישויות אפופטוטיות קטנות במקרופאגים שבלעו מספר גבוה יותר של ישויות, והישויות הקטנות בדרך כלל קרובות לגרעין במקום לשולי התא, כלומר קיימת דגרדציה חלקית של תאים שלמים במקום ספיגה של חלקיקים אפופטוטיים. לעומת זאת, לא ניתן לפסול אפשרות זו. בתאים הממוינים, ישויות Ly-6G+ F4/80+ (שזוהו בתור מקרופאגים המחוברים ל- PMN אך לא בלעו אותם לחלוטין, באמצעות גרף פיזור קדמי מול צדדי) הוסרו מהדגימה בכדי למנוע ספירה של PMNs מחוברים.

רגולציה של ביטוי CD11b ex vivo

תאי Jurkat (1 x 106 cell/ml) עברו טיפול עם 1 μM סטאורוספורין (4 שעות) בכדי לגרום לאפופטוזיס. הנויטרופילים מהצפק נאספו 24 שעות מתחילת הצפקת ועברו הזדקנות במשך 24 שעות בתווך התרבית. לאחר מכן, המקרופאגים מהצפק או אוכלוסיות-המשנה הממוינות שלהם עברו אינקובציה עם ובלי תאי Jurkat אפופטוטיים, נויטרופילים מזדקנים (יחס של 1:5 מקרופאגים לתאי המטרה), חרוזי לטקס (LB), LB לאחר אופסוניזציה IgG (5 mg/ml IgG, שעה אחת, 37oC, יחס של 1:10 מקרופאגים לחרוזים) או mAbs נוגדני-CD11b (500 ng/ml, אינקובציה במשך 30 דקות עם מקרופאגים ולאחר מכן שטיפה). בתחילת האינקובציה, ואחרי 20 דקות, המקרופאגים עברו immunostaining ונותחו באמצעות FACS. באופן חלופי, נלקחו תמציות חלבונים מהמקרופאגים לאחר האינקובציה והורצו עם SDS-PAGE, ולאחר מכן בוצע תספיג חלבון (5 μg/lane) עבור CD11b, ארגינאז-1, 12/15-LO, אקטין, טובולין או GAPDH.

איורים נוספים

איור נספח 1: תרשים gate ואפיון של ביטוי CD11b על המקרופאגים בזמן הרזולוציה של צפקת מכרסמים. האקסודציה של הרזולוציה נאספה לאחר 66 שעות מהזרקת הזימוסאן A, והתאים עברו immunostaining עבור GR-1, F4/80 ו- CD11b, ונותחו על ידי FACS. תרשים ה- gate מראה את תחילת ה- gating (A), על בסיס פיזור קדמי וצדדי, וחלקיקי תא מזוהים (i). לאחר מכן, קבוצות סינגלט עברו gating על בסיס הצלבה של ערכי הגובה והרוחב של הפיזור הקדמי והצדדי, בהתאמה (ii-iii). בשלב הבא זיהינו מקרופאגים ו- PMN על בסיס הכתמת F4/80 ו- Ly-6G, בהתאמה (iv), ומתוכם המקרופאגים עברו gating ונותחו עבור הכתמת CD11b מול F4/80 (v). מוצגות האוכלוסיות של CD11bhigh (gate עליון) ו- CD11blow (gate תחתון). הניתוח מראה את השיעור של PMN ומקרופאגים (B), ההתפלגות של תאי CD11bhigh ו- CD11blow באוכלוסיית המקרופאגים (C), והאינטנסיביות הפלורוסנטית הממוצעת (MFI) של CD11b באוכלוסיות מקרופאגים אלו (D). התוצאות הן ייצוג של 10 ניסויים. מוצגים הבדלים מובהקים לפי מבחני-t בין המקרופאגים CD11bhigh לבין CD11blow (*** p < 0.001).

איור נספח 2: המקרופאגים CD11blow מבטאים רמות נמוכות יותר של F4/80 בהשוואה ל- CD11bhigh. המקרופאגים מהצפק נותחו עבור ביטוי של F4/80 על מקרופאגים CD11bhigh (R1) ו- CD11blow (R2). התוצאות מוצגות בתור גרף נקודות מייצג (A) ו- MFI ממוצע (B) של 10 ניסויים. מוצגים הבדלים מובהקים לפי מבחני-t בין המקרופאגים CD11bhigh לבין CD11blow (*** p < 0.001).

איור נספח 3: מיקרוסקופיה קונפוקלית מפורטת של מקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow. המקרופאגים CD11blow (A, C, E ו- G) ו- CD11bhigh (B, D, F ו- H) הממוינים הוכתמו, נותחו במיקרוסקופיה קונפוקלית וצולמו באופן הבא: מיקרוסקופיית אור (A-B), lysotrack (C-D), נוגדן- Ly-6G (E-F), ו- Hoechst (H). התוצאות הן ייצוג של 3 ניסויים.

איור נספח 4: אפנון של פנוטיפ המקרופאגים לפי מטרות פגוציטיות שונות. (A) המקרופאגים מהצפק נאספו 66 שעות לאחר תחילת הצפקת ועברו אינקובציה עם תאי Jurkat  אפופטוטיים (AC), נויטרופילים מזדקנים מהצפק (SN), חרוזי לטקס (LB), LB לאחר אופסוניזציה IgG, או נוגדני-CD11b מונוקלונאליים. לאחר 20 שעות, החומרים הלא-קשורים נשטפו והמקרופאגים נאספו והומסו. תמציות החלבונים הורצו עם SDS-PAGE ונותחו באמצעות תספיג חלבון עבור החלבונים המצוינים. התוצאות הן מערך מייצג של תספיגים מ- 3 ניסויים.

(B) המקרופאגים מהצפק עברו אינקובציה במשך 20 שעות ללא תאים (A-B, קו מקוטע) או עם תאי Jurkat אפופטוטיים (AC), חרוזי לטקס (LB), LB לאחר אופסוניזציה IgG, או נוגדני CD11b מונוקלונאליים. לאחר מכן המקרופאגים נאספו ועברו immunostaining עבור הביטוי של  F4/80, CD11b, CD206 ו- CD163 על פני השטח שלהם ונותחו באמצעות ציטומטריית זרימה. התוצאות הן ערכי MFI ממוצעים ± SE של 3 ניסויים (C). מוצגים הבדלים מובהקים לפי מבחני-t בין מקרופאגים מטופלים ולא מטופלים (* p < 0.05, * p < 0.005, *** p < 0.001).