דיכוי דיורנלי Diurnal suppression of EGFR signalling by glucocorticoids and implications for tumour progression and treatment

דיכוי דיורנלי של איתות EGFR על ידי גלוקוקורטיקואידים והשלכות לגבי התקדמות הגידול והטיפול בו

טרנסדוקציית אותות על ידי רצפטורי טירוזין קינאז (RTKs) ורצפטורי גרעין עבור הורמונים סטרואידים הינה חיונית עבור הומיאוסטזיס של הגוף, אך ה- cross-talk בין משפחות רצפטור אלו אינו ברור דיו. מצאנו כי גלוקוקורטיקואידים מעכבים את האיתות במורד הזרם של EGFR, ה- RTK. המנגנון הבסיסי כולל דיכוי של לולאות המשוב החיובי של EGFR והפעלה סימולטנית של לולאות משוב שלילי המרסנות את EGFR. המחקרים שערכנו על עכברים מראים כי הרגולציה של לולאות המשוב החיובי של EGFR על ידי גלוקוקורטיקואידים מתורגמת לשליטה סירקדית באיתות EFGR: אותות EGFR מדוכאים על ידי גלוקוקורטיקואידים גבוהים במהלך השלב האקטיבי (לילה, אצל מכרסמים), בזמן שאותות ה- EGFR מתגברים במהלך שלב המנוחה. בהתאם לדפוס זה, טיפול בחיות הסובלות מגידולים הנגרמים מ- EGFR עם מעכב קינאז ספציפי היה אפקטיבי יותר כאשר הוא בוצע בזמן שלב המנוחה ביום, כאשר הגלוקוקורטיקואידים הם נמוכים. ממצאים אלה תומכים בפרדיגמה סירקדית מתוזמנת שעתית של טיפול בסרטן.

גורמי גדילה הפועלים דרך RTKs, לצד הורמונים סטרואידים הפועלים דרך רצפטורי גרעין (NRs), מווסתים באופן קריטי אינטראקציות תא-לתא במהלך ההתבגרות והבגרות. לדוגמא, RTKs מסוג 1 (הנקראים גם ERBB או HER) והליגנדים שלהם ממשפחת גורם הגדילה האפידרמי (EGF) מווסתים את המורפוגנזיס הדוקטלי והאלוואולרי של בלוטות החלב. בדומה, ה- NR הנקרא רצפטור גלוקוקורטיקואיד (GC) שולט בפרולפרציה של התא בזמן ההתפתחות הלובולו-אלוואולרית של בלוטת החלב. למרות גיוס של דרכים שונות ביותר של טרנסדוקציית אותות, ה- RTKs וה- NRs משמרים cross-talk נרחב. לדוגמא, רצפטור אואסטרוגן (ER) מתפקד בתור גורם שעתוק (TF) המתווך את התגובה לאואסטרוגנים, ולטיפולים נוגדי-סרטן שונים, כולל טמוקסיפן. ה- ER מאופנן על ידי מספר RTKs, כמו EGFR, HER2 ורצפטור גורם הגדילה דמוי-אינסולין. ביטוי-יתר או גירוי של RTKs אלו יכול להפעיל את פרוטאין קינאז מופעל-מיטוגן (MAPK)/ERK במורד הזרם ונתיבי פוספואינוסיטיד3-קינאז (PI3K)/AKT, המפעיל תוכניות שעתוק ספציפיות. האקטיבציה של נתיבי מורד הזרם הללו נמצאה קשורה בפוספורילציה של ER בשיירי סרין רבים.

אחד מאבות הטיפוס של RTK הוא רצפטור EGF (EGFR/ERBB1). לצד ה- EGF, ה- EGFR קושר מספר גורמי גדילה, כולל גורם גידול התמרתי-α (TGFA), וגורם גדילה דמוי-EGF קושר-הפארין (HB-EGF). האינטגרציה של אותות בהשראת EGF מובילה לדפוס דמוי-גל של שעתוק. בתגובה ל- EGF, קבוצה של מיקרו-RNAs עוברת downregulation מהירה, ובאותו זמן, שעתוקי המטרה שלהם, המקדדים TFs מוקדמים מיידיים (EITFs) וגנים מוקדמים מיידים אחרים, מופעלים גם הם. לאחר מכן, השעתוק של גנים מאוחרים מעוכבים, קבוצה המקדדת מדכאי שעתוק ומווסתי משוב שלילי, כמו פוספטאזים MAPK (DUSPs) ו- ERRFI1/MIG6, המעודדת דגרדציה ומעכבת פוספורילציה-עצמית של EGFR, ומווסתת את הביטוי של גנים מאוחרים וקובעי-גורל.

באנלוגיה ל- RTKs, הפעולות הביולוגיות של GCs, וכמו גם של הורמונים סטרואידים אחרים, מתווכות על ידי הרצפטורים השכיחים של משפחת-העל NR. ה- GCs עוברים סינתזה בבלוטת האדרנל ומועברים בסירקולציה מערכתית ל- GRs. בהגיעם לגרעין, GRs קשורי-ליגנד מפעילים שעתוק על ידי קשירה לאלמנטים ספציפיים של ה- DNA, הנקראים אלמנטים של תגובת GC (GREs). באופן חלופי, ה- GR מתווך דיכוי ישיר של גנים ספציפיים על ידי קשירה ל- GREs שליליים (nGREs) או על ידי שינוי מצב הכרומטין. אך קיים מנגנון נוסף של רגולציה המערב טרנס-רפרסיה מחוברת (tethered) על ידי יצירת קומפלקס פיזי בין GRs לבין TFs אחרים, כמו טרנסדוסר אותות ומפעיל שעתוק 5 (STAT5). צורות רגולציה אלו מתווכות השפעות מעודדות הישרדות על תאים אפיתליאליים ואינדוקציה של אפופטוזיס אצל תאים לימפואידים ומיאלואידים, שהובילו לאישור של אנלוג GC לפני כ- 50 שנה, לטיפול בלוקמיה של ילדים. ה- GCs משמשים בנוסף כתרופה נלווית של קרצינומות שונות, תודות ליכולת שלהם להפחית את הטוקסיות של הכימותרפיה. ייתכן וניתן להפיק יישומים תרפויטיים נוספים באמצעות הבנה מעמיקה יותר של תפקיד ה- GCs במקצבים יומיים. הפרשה אדרנלית של GCs משתנה באופן סירקדי וקשור-עקה, והפרעה של המקצב הסירקדי מאיצה צמיחה של גידולים אצל בעלי חיים. בדומה, תנאי עקה נמצאו קשורים בטומוריגנזיס אגרסיבי של בלוטת החלב אצל חולדות, אך יחסים אלה עדיין אינם ברורים אצל בני אדם. לפיכך, הבנה מעמיקה יותר של גורמים הנמצאים תחת שליטה סירקדית, כמו סטרואידים, מלטונין וגורמי גדילה, מהווה כיוון מבטיח עבור הטיפול בסרטן.

המחקר הנוכחי נולד מהאבחנה כי GR יכול לעכב נדידה של תאי בלוטת החלב בהשראת-EGF. המנגנון הבסיסי מערב דיכוי של מפעילי איתות EGFR, לצד הגברה של מספר לולאות משוב שלילי של EGFR. בפרט, מצאנו כי ה- cross-talk של EGFR-GR כולל רגולציה הדדית של נתיב MAPK. מחקרי בעלי החיים שלנו אימתו את קיומה של אוסילציה מנוגדת יומית של לולאות המשוב של EGFR, וניתוח של דגימות קליניות חשפה אסוציאציה בין GR גבוה, פעילות MAPK נמוכה ופרוגנוזה חיובית של חולי סרטן השד. בנוסף, נטילת תרופה נוגדת-EGFR במהלך השלב האקטיבי של היום, במקום בזמן המנוחה, עיכבה את צמיחת הגידולים אצל חיות באופן פחות אפקטיבי. ממצאים אלו וה- cross-talk היומי של GR-to-RTK תומכים ביצירת לוח זמנים מבוסס מקצב סירקדי של תרופות נגד סרטן.

תוצאות

GRs מופעלי-ליגנד מעכבים מוטיליות תאים בהשראת-EGF

בעת הגירוי עם EGF, תאי MCF10A אפיתליאליים של בלוטת החלב מאתחלים תוכניות שעתוק המובילות לנדידה ופלישה. בכדי לבחון אינטראקציות אפשריות בין נתיב EGFR ואיתות הורמונים סטרואידים, הנחנו תאים במגשי transwell וערכנו טיפול עם EGF, בנוכחות של אסטרדיול (E2), פרוגסטרון (PRG), מדרוקסיפרוגסטרון אצטט (MPA), שהוא וריאציה סינתטית של PRG, או דקסמתזון (DEX), שהוא GC סינתטי (איור נספח 1A). התוצאות הצביעו על DEX בתור מעכב עוצמתי של נדידת תאים בהשראת-EGF, וניסויים שאינם מפורטים כאן אישרו כי הידרוקורטיזון (HC) פועל באופן דומה. ה- MPA היה פחות עוצמתי, ו- E2 ו- PRG שניהם הציגו פעילות חלשה או היעדר פעילות, ככל הנראה כתוצאה מהיעדר הרצפטורים התואמים. חשוב לציין כי מארקרים של אפופטוזיס (אנקסין V) ונקרוזיס (פרופידיום יודיד) שללו את האפשרות של טוקסיות תאית (איור נספח 1B).

למרות ש- GCs יוצרים אינטראקציה עם GR ועם רצפטור מינרלוקורטיקואיד (MR), תאי MCF10A, בדומה לרוב קווי התא של בלוטות החלב, אינם מבטאים MR בר-זיהוי. בנוסף, ה- MPA קושר את PRG, אנדרוגן ו- GRs עם ערכי EC50 של ~0.01, 1 ו- 10 nm, בהתאמה. לפיכך, עיכוב נדידה על ידי DEX, ובמידה מסוימת על ידי MPA, יכול להיות מתווך על ידי GR, כפי שהתגלה על ידי שימוש ב- RU486, אנטגוניסט של GR (איורים 1a, b). בנוסף, RNAs מתערבים קטנים ספציפיים ל-GR (siRNAs) שהפחיתו את ביטוי הרצפטור ב- ~80% (איור נספח 1C) עיכבו את ההשפעה של DEX על הנדידה (איורים 1c, d). תוצאות אלו העלו את האפשרות כי GRs קשורי-ליגנד מעכבים נדידת תאים בהשראת-EGF על ידי אפנון של אירועי שעתוק. אך מכיוון ש- DEX עשוי להפעיל MRs, שאינם מזוהים ב- PCR, איננו יכולים לשלול את המעורבות של MRs באנטגוניזם של השפעות בתיווך-EGFR על נדידת תאי MCF10A.

בשלב הבא, בדקנו האם טיפול DEX משנה את כיווניות הנדידה, כלומר היכולת של התאים לשמור על מסלול נדידה. כימות הכיווניות מתאר את המרחק הליניארי בין נקודות ההתחלה והסיום (D) למרחק הנדידה הכולל (T). תרשימי ה- rose של מסלולי התאים (איורים 1e, f) הראו כי EGF הגביר את ההתמדה של הכיווניות (D/T) והאיץ את המהירות, אך DEX עצר את השפעות אלו. בכדי להשלים אבחנות אלו, ביצענו ניסוי איחוי פצע, כפי שתואר במחקרים קודמים (איורים 1g, h). התוצאות חיזקו את האפשרות כי אקטיבציה של GR מפריעה לנדידה בהשראת-EGF.

השוואה בין תוכניות גנים בגירוי של GR ו- EGFR

ניתן לשער כי ההשפעה המעכבת של GR כוללת שינויים בשעתוק בהשראת-EGF. בפרט, ה- GR עשוי להשפיע על סינתזת השעתוק או לאפנן שחבור RNA בהשראת-EGF בתאי MCF10A. בכדי לבחון מודלים אלו, ביצענו גירוי תאים עם EGF, DEX או שילוב שלהם, בודדנו RNAs שליחים בציר זמן מ- 20 דקות עד 4 שעות, וביצענו היברידיזציה של RNA עם Affymetrix Exon Arrays המסוגלים ליישב שינויים קטנים בשחבור. התוצאות מוצגות באיור 2a. בנוסף, איור נספח 2 מציג ניתוח PCR מאשש. באופן ראוי לציון, הטיפול המשולב לא גרם להשפעות מזוהות על שחבור ה- RNA. בכדי לקבץ אירועי שחבור אחרים, יישמנו מערך של חוקים לוגיים והגדרנו מודולים של גנים אקטיביים (איור 2b):

מודול A: שעתוקים שעברו upregulation גם על ידי EGF וגם על ידי DEX (EGFUP/DEXUP).

מודול B: שעתוקים שעברו upregulation על ידי EGF ו- downregulation  על ידי DEX (EGFUP/DEXDN).

מודול C: שעתוקים שעברו downregulation על ידי שני הסוכנים (EGFDN/DEXDN).

מודול D: שעתוקים שעברו downregultion על ידי EGF ו- upregulation על ידי DEX (EGFDN/DEXUP).

באופן מעניין, מצאנו כי מודול A (EGFUP/DEXUP) כלל מספר מעכבים ברי-השראה של EGFR, כמו ERRFI1/MIG6, ZFP36L2, ו- DUSP1, שבדרך כלל עוסקים בעיכוב משוב מושהה של איתות EGFR. ניתן לשער כי ההשראה שלהם על ידי GR מייצגת אסטרטגיית עיכוב אפקטיבית. בהתאם לרעיון זה, מודול B (EGFUP/DEXDN) כולל מווסתי משוב חיובי של נתיב EGFR, כמו נוירגולין 1, HB-EGF ו- EREG, המשמרים את איתות ה- EGFR. לסיכום, ה- GR שולט על תגובת שעתוק המובילה ל- downregulation של מספר רגולטורים חיוביים של EGFR (מודול B) לצד upregulation של מעכבי EGFR רבים (מודול A), ובכך מפסיק באופן איתן את איתות ה- EGFR.

השוואה בין הדפוסים הטמפורליים של גנים המווסתים על ידי EGF ו- DEX הראתה כי ההופעה של שעתוקים בהשראה או בדיכוי של EGF הייתה מהירה ביותר בהשוואה להשפעה של DEX (כאשר הוא יושם לבדו). ההשפעה העיקרית של סטימולנט זה הציגה שיהוי של 40 דקות ושיא שהתרחש לאחר 60 דקות (איור 2c). לאחר מכן, בדקנו את ההשפעה של תערובת של EGF ו- DEX על שעתוקים בהשראת-EGF (upregulation) (איור 2d). ניתוח זה חשף כי ההשפעה המדכאת המקסימאלית של DEX היא על הגנים העוברים אינדוקציה מוקדמת (< 40 min) על ידי EGF: ההשפעה המעכבת של DEX הגיעה ל- 70% מקיבולת הדיכוי המקסימאלית כבר לאחר 20 דקות (איור 2d), מוקדם יותר באופן מובהק בהשוואה לשיא השינויים בהשראת DEX לבדו. באופן כללי, אבחנות אלו מעלות אפשרות כי GR מתערב ב- TFs ספציפיים העוברים מודיפיקציות פוסט-שעתוק במורד הזרם של איתות ה- EGFR.

איור 1: GRs קשורי-ליגנד מעכבים נדידה של תאי בלוטות החלב. (a) תאי MFC10A הגדלים ב- transwells טופלו במשך 16 שעות עם EGF (10 ng ml-1), DEX (100 nM), RU486 (5 μM) או שילובים שלהם. מוצגות תמונות צביעת crystal violet מייצגות של תאי הנדידה מ- 3 ניסויים. קנ”מ: 500 μm. (b) אזורים מכוסי תאים מ- 4 שדות מיקרוסקופיים של a. *** p < 0.0001 (ANOVA). (c) תאים שקיבלו טיפול מוקדם עם אוליגונוקליאוטידים siRNA נזרעו ב- transwells, עברו גירוי, ולאחר 16 שעות צולמו תאי הנדידה. (d) כימות התוצאות של c. *** p < 0.001 (ANOVA). (e) תאי MCF10A שטופלו עם EGF או DEX נמצאו במעקב עם מיקרוסקופיה time lapse. מוצגות rose plots של מסלולי תאים בודדים. הקווים האדומים מסמנים התמדת נדידה הקטנה מ- 0.3. (f) כימות פרמטרי הנדידה של e (ממוצעים ± SE, 60 תאים). (g) ניסויי איחוי פצעים נערכו לאחר הטיפולים בתאי MCF10A. הקווים הירוקים מסמנים את חזית הנדידה. ניסוי זה חזר על עצמו פעמיים. (h) כימות סרטי time lapse של g. נעשה שימוש בפריימים של 5 דקות (קווים דקים) ומוצגים הממוצעים של מרחק הנדידה והמהירות.

איור 2: GRs אקטיביים מדכאים תוכניות שעתוק בהשראת-EGF. (a) ה- RNA בודד מתאי MCF10A שעברו טיפול מוקדם כמצוין ועברו היברידיזציה למערכי Affymetrics Exon. מפות החום מציגות את שינויי ה-fold של ה- RNA, שנאספו ל- 4 קבוצות וסודרו בהתאם לזמן השיא של ה- RNA. (b) תרשים המתאר את היחסים בין EGFR, GR ו- 4 המודולים של הגנים. (c) בכל נקודת זמן, חישבנו את שינויי ה- fold הממוצעים בביטוי הגנים (EGF בלבד מול DEX בלבד) ביחס ל- t = 240 min. הקווים האדומים מסמנים גנים לאחר upregulation, והקווים הירוקים מסמנים גנים לאחר downregulation. (d) ההבדל הממוצע בין שינויי ה- fold לאחר טיפול EGF וטיפול DEX + EGF מראה את מידת הדיכוי ביחס ל- t = 40 min.

GR מנצל מודול משוב המפסיק את איתות ה- RTK

ניתוח של הפגמים בהיווצרות הפות אצל תולעים, וליקויים בהתפתחות העין אצל חרקים, שני תהליכים הנשלטים על ידי EGFR, עזר להגדיר מספר לולאות משוב שלילי משומרות אבולוציונית ויתירות חלקית המסוגלות להפסיק את איתות EGFR באופן איתן. מכיוון שמודול A (EGFUP/DEXUP) כולל מספר אורתולוגים של לולאות המשוב השלילי של חסרי חוליות, בחרנו 3 עבור המשך הניתוח. ה- DUSP1 הוא האבטיפוס של פוספוטאזים ספציפיים ל-MAPK, הגורמים לדה-פוספורילציה של המוטיב המשותף Thr-Xxx-Tyr של MPAKs. ה- ERRFI1/MIG6 (המכונה גם RALT) הוא אדפטור בהשראת-סטרואידים שזוהה בעבר, הקושר ומעכב פיזית את תחום הקינאז של EGFR. רגולטור המשוב השלישי שחקרנו היה sprouty 4, חבר במשפחה הקטנה של אדפטורים המסוגלים לעכב איתות RAS-to-ERK באופן ספציפי. על ידי שימוש בפריימרים ספציפיים לשעתוקים הצעירים או הבוגרים, עקבנו אחר שעתוק de novo של שלושת הרגולטורים השליליים הללו (איור 3a). השעתוקים המקדימים והבוגרים הציגו פרופילים דומים, אך בניגוד לאינדוקציה החלשה יחסית והחולפת של DUSP1 ו- ERRFI1 על ידי EGF (פי 3-5), הטיפול בתאים עם DEX, ובמיוחד עם שילוב DEX + EGF, הגביר והאריך את אות ה- upregulation באופן משמעותי (פי 20-25). מכיוון שכל רגולטור משוב פועל ברמה אחרת של מפל האותות (איור 3b), וכל השלושה עברו אינדוקציה מהירה, האינדוקציה הארוכה והמוגברת על ידי השילוב DEX + EGF ככל הנראה מתורגמת לעיכוב איתן של נתיב האיתות RTK-to-ERK. המשכנו לבחון אפשרות זו על ידי התמקדות ב- ERRFI1.

באופן עקבי לנתוני ביטוי הגנים, תספיגי חלבון אישרו את ה- upregulation החזק של החלבון ERRFI1 בתאים שקיבלו טיפול עם EGF ו- DEX יחד (איור 3c). בדומה, כימות האותות הראה כי הטיפול המשולב הוביל לאקטיבציה מוקדמת וארוכה יותר של ERRFI1 (איור 3d). מכיוון ששלושת הרגולטורים שבחרנו לניתוח פועלים במעלה הזרם של ERK, בחנו את הסטאטוס של ERK אקטיבי (ERK שעבר פוספורילציה, איורים 3e , f). ה- EGF גרם לגירוי מהיר של ERK, אך ההוספה של DEX הפחיתה את האמפליטודה וקיצרה באופן משמעותי את משך האקטיבציה של ERK. נראה כי השפעה זו תלויה בשעתוק de novo, מכיוון ש- DEX לא הצליח להפחית את האקטיבציה של ERK בנוכחות של מעכב השעתוק אקטינומיצין D (איור נספח 3).

בכדי לנטר את התוצאות הפונקציונאליות של ה- cross-talk של GR-to-RTK, הפחתנו באופן יציב את הביטוי של ERRFI1 ובחנו את היכולת של DEX לעכב נדידה בהשראת-EGF (איור 3g). באופן מעניין, תחת תנאי חוסר גירוי, תאים עם חוסר של ERRFI1 הציגו נדידה גבוהה יותר בהשוואה לתאי הבקרה. אף על פי כן, ה- EGF בכל זאת הגביר את הנדידה של תאים חסרי-ERRFI1, אך ההשפעה המעכבת של DEX הייתה קטנה בהרבה בהשוואה לתאי הבקרה. בעוד ש- DEX הפחית את הנדידה של תאי הבקרה ב- 90%, השפעה זו הצטמצמה ל- 30% בתאים עם חוסר של ERRFI1. לסיכום, האקטיבציה של GR מערבת upregulaion של קבוצה מאופיינת היטב של מווסתי משוב שלילי של איתות EGFR. בהתאם לתפקידים הקריטיים של מווסתי המשוב של EGFR באיתות GR, ההתערבות בתפקוד של רק אחד ממווסתים אלו, ERRFI1, הגבילה באופן מובהק את היכולת של GR לעכב את איתות ה- EGFR.

GR מדכא את המשוב החיובי של EGFR דרך השעתוק

תגובות שעתוק תלויות-EGF מאופיינות באינדוקציה מוקדמת של לולאות אוטו-סטימולציה המורכבות ממספר גורמי גדילה, כמו TGFA, NRG1, EREG ו- HBEGF, שלא רק גורמות לאוטו-סטימולציה של EGFR אלא גם מפעילות חברים נוספים במשפחת EGFR. ה- DEX עיכב באופן חזק את לולאות אוטו-סטימולציה אלו, כפי שזיהינו באמצעות ניסויי זמן-אמת וניסויים אימונולוגיים (איורים 4a, b). ההשפעות המהירות של DEX על הרמות של קדם-mRNA ו- mRNA העלו את האפשרות כי GR גורם לטרנס-רפרסיה של IETFs קיימים האחראים לרגולציה של ליגנדי EGFR וגנים אחרים של מודול B. בכדי לבחון רעיון זה, ראשית חיפשנו אחר מוטיבים של קשירת TF בעלי ביטוי-יתר בפרומוטרים של גני מודול B, ולאחר מכן אימתנו את התוצאות בעזרת Cscan, תוכנה המבוססת על ניסויי אימונו-פרסיפיטציה נרחבים (טבלה 1). בשלב הבא, ערכנו בחינה פונקציונאלית של כל חלבון ברשימה בעזרת ניסוי siRNAs ונדידה. התוצאות המוצגות באיור 4c מלמדות כי התכלות של רוב המועמדים הפחיתה את הנדידה בהשראת-EGF, בהתאם למודל טרנס-רפרסיה המפעיל במהירות קבוצה קטנה יחסית של TFs בכדי לעכב איתות EGFR. מעניין לראות כי חלק מה- TFs החזויים, כמו GABPA, ELK1 ו- ELK4, שייכים למשפחת ETS, המווסתת ישירות על ידי נתיב ה- MAPK, בעוד שאחרים (כמו SP1 ו- E2F1) מווסתים באופן שונה על ידי גורמי גדילה.

לצד החיבור הפיזי של TFs ספציפיים, כמו גורם גרעין-κB (NF-κB) ו- STAT5, ה- GR עשוי לגרום לדיכוי ישיר באמצעות קשירה לרצפים פלינדרומים המורכבים משני מוטיבים הפוכים חוזרים, nGREs הפוכים חוזרים (IR), שהם אלמנטי תגובה מפעילי-cis. על ידי בחינה של תאי MCF10A, זיהינו 128 גנים המכילים IR nGRE באזורים הרגולציה שלהם (~1% מכל הגנים המבוטאים). באופן מדהים, על ידי התמקדות בגנים של מודול B בלבד, ההעשרה עבור IR nGREs הגיעה ל- 15% (P = 1.2781e – 06, איור 4d). לדוגמא, קבוצה זו מקדדת BCL3, המווסת גני מטרה NF-κB. לסיכום, ממצאים אלה מצביעים על 2 צורות מתווכות-GR של דיכוי האיתות של RTK; ראשית, על ידי טרנס-רפרסיה של TFs קיימים, ושנית, על ידי קשירה ל- IR nGREs.

איור 3: GR מפעיל מווסתי משוב שלילי של איתות EGFR. (a) תאי MCF10A מורעבי-סרום טופלו עם EGF או DEX. ניתוח PCR כמותי נערך באמצעות RNA ופריימרים התואמים ל- pre-mRNAs (קווים מקוטעים) או לצורה הבוגרת (קווים מלאים). (b) תרשים המציג מווסתי משוב שלילי של איתות EGFR. (c,d) התאים עברו גירוי כמו ב- a והתמציות עברו תספיג חלבון עבור ERRFI1, GR ו- ERK2. מוצגים אותות ERRFI1 מנורמלים. (e,f) אותות ERK אקטיביים (ERK לאחר פוספורילציה (pERK)) זוהו ועברו נורמליזציה. התמונות נחתכו לטובת המצג; התמונות בגודל מלא מוצגות באיור נספח 7. (g) הנדידה של נגזרות MCF10A המבטאות באופן יציב RNAs short hairpin ספציפיים ל- ERRFI1 (shRNAs), לאחר הטיפולים. הכימות נערך באמצעות ANOVA. * p < 0.05, *** p < 0.0001.

אוסילציה יומית של GC שולטת בתוכניות גנים של EGFR in vivo

בשלב הבא, בחנו את ה- cross-talk בין GR לנתיב RTK in vivo. ה- GCs מציגים מקצב יומי, המשפיע על דפוסי ההתנהגות, ואוסילציה זו משויכת באופן כללי לציר ההיפותלמוס-בלוטת יותרת המוח-אדרנל (HPA) הנוירואנדוקריני. פרופיל האוסילציה מציג דפוס אופייני, עם שיא בתחילת שלב החשיכה האקטיבי אצל מכרסמים. על מנת לבחון את התחזית לפיה GCs שולטים בביטוי של הרגולטורים השליליים של EGFR, ניתחנו את רמות ה- mRNA של שני גנים של מודול A, Errfi1 ו- Dusp1, באיברי עכברים. מכיוון שניתוחים של רגולציה דיורנלית של ביטוי גנים לעתים קרובות משתמשים בכבד בתור האיבר הנבדק, ובשל השכיחות של רקמה הפטית הזמינה לדגימות RNA, הניסויים שלנו התמקדו בכבד של עכברים. יש לציין כי בחנו בנוסף רקמות של ריאות ומעיים, והשגנו תוצאות דומות לאלו שהושגו מהכבד. כתמיכה ב- cross-talk מדכא, Errfi1 ו- Dusp1 הציגו אוסילציות יומיות עם אמפליטודות של שינויים פי 2-4, ורמות גבוהות יותר בזמן השלב האקטיבי בשעות הלילה (איור 5a). בניגוד לכך, שני רגולטורים חיוביים של EGFR, Hbegf ו- Tgfa, הציגו דפוסים הדדיים, עם שיאים בזמן שלב המנוחה (דיורנלי) (איור 5b). באמצעות ניסוי ELISA ודגימות דם עכברים שנאספו בזמן השלב הדיורנלי (ZT4-ZT10) ובלילה (ZT15-ZT20), מצאנו תמיכה באפשרות כי הרמות של HB-EGF ו- TGFA מציגות אוסילציה סירקדית (איור 5c). בנוסף, תשלובת של נתונים ניסויים ממערכי ביטוי הזמינה דרך Circa DB, מאגר הנתונים של פרופילי ביטוי סירקדיים, אימתה את הקיום של אוסילציות מנוגדות של מווסתי משוב שלילי (Mig6, Dusp1 ו- Sulf1) וחיובי (Tgfa, Hbegf ו- Ereg) של EGFR, כפי שזוהו על ידי ניתוח סט של 4 רקמות מכרסמים שונות (איור 5d). לסיכום, גם מווסתי משוב שלילי וגם מווסתי משוב חיובי של איתות RTK מציגים דפוסי אוסילציה in vivo, בהתאם להפרשה הדיורנלית של האקטיבטורים, כלומר הליגנדים של EGFR, לצד סינתזה לילית של מספר מעכבים תוך-תאיים של איתות EGFR, בכדי לקבל דיכוי איתן ואקטיבציה של איתות EGFR במהלך השלב האקטיבי (לילי) ושלב המנוחה (דיורנלי), בהתאמה, אצל מכרסמים.

בכדי לאמת מסקנות אלו, חיפשנו אחר מודל מכרסמים עם ייצור חריג של GC. ה- CRFR1 מקדד אחד מתוך שני רצפטורים עבור הגורם משחרר קורטיקוטרופין, המשמר את ציר HPA. עכברים הומוזיגוטיים עם חוסר-Crfr1 (Crfr1-/-) מציגים ריכוזים נמוכים של קורטיקוסטרון פלסמה כתוצאה מאגנזיס של אזור ה- zona fasciculate של בלוטת האדרנל. לפיכך, מודל זה מייצג מערכת הולמת לבחינת ה- cross-talk של GR-to-RTK. באופן עקבי לראיות אחרות, רמות הביטוי של שני מווסתי משוב שלילי, Errfi1 ו- Dusp1, באופן כללי פחתו בכבדים שבודדו מעכברים עם חוסר-Crfr1, והם לא הציגו את התנודות הסירקדיות שנצפו בעכברי הבקרה (איור 6a). תוצאות אלו מלמדות כי איתות ה- EGFR נמצא תחת שליטה של ציר ה- HPA הנוירואנדוקריני. עם זאת, מכיוון שלליגנדים CRFR יש השפעות נוספות מלבד אלו המשפיעות על ציר HPA, ערכנו את ניסויי ה- rescue הבאים: במשך 7 ימים, סיפקנו HC לעכברי Crfr1-/- דרך מי השתייה, ולאחר מכן בחנו את דפוסי ה- in vivo של שני גני מכרסמים: רגולטור משוב שלילי של EGFR (Mig6/Errfi1) ורכיב משוב חיובי (Hbegf). התוצאות מראות כי תוספת של HC שיקמה את הפנוטיפ של עכברי Crfr1-/- (איור נספח 4); למרות ש- Hbegf עבר downregulation בעכברי knockout שטופלו עם HC (ביחס לעכברי Crfr1-/- שלא טופלו), Mig6 עבר upregulation, בהתאם להולמות של מודל בעלי החיים.

בשלב הבא, בחנו את האקטיבציה של ERK, אפקטור של EGFR הנמצא במורד הזרם, בתמציות כבד שנאספו במשך כל היום מעכברי בר (WT) ועכברים לאחר מוטציה (איורים 6b, c). באופן מעניין, עכברי המוטציה Crfr1 הציגו אקטיבציה נורמאלית של ERK, אך לא הציגו את שלב האי-אקטיבציה (סימן Δ, איור 6c), ממצא התואם את השיא של ריכוז הקורטיקוסטרואיד בדם. בנוסף, בהתאם לפעילות הדיכוי של GR, ה- ERK הציג רמות גבוהות יותר באופן כולל במוטציות בהשוואה לעכברי WT. בסך הכול, ההשוואה בין עכברי WT לבין עכברי מוטציה Crfr1 תמכה באפשרות כי מאפננים שליליים של EGFR (כלומר, Errfi1) ו- MAPK (כלומר, Dusp1) נשלטים in vivo על ידי ליגנדים של GR.

איור 4: GR מחווט מחדש תוכניות EGFR דרך IR nGREs ו- טרנס-רפרסיה. (a) תאי MCF10A נותחו עבור ביטוי הגנים המצוינים בדומה לאיור 3a. (b) התאים טופלו במשך 4 שעות, והתמציות נבדקו עבור HB-EGF באמצעו ניסוי immunosorbent מחובר-אנזים. התוצאות מציגות שכפולים ביולוגיים שבוצעו בשלשות טכניות. ערכי p (מסומנים מעל הקווים האופקיים) חושבו באמצעות ANOVA ומבחן השוואת מרובות של Tukey. (c) ה- siRNAs עברו טרנספקציה לתאי MCF10A, שנזרעו בשנית 48 שעות מאוחר יותר, גורדו ועברו גירוי עם EGF. הנדידה (ממוצע ± SEM) נבדקה 12 שעות לאחר מכן בשלשות. (d) התפלגות של גנים המבוטאים על ידי תאי MCF10A, כולל גנים מכילי-IR nGRE לאחר downregualtion של DEX, וגנים ממודול B. שבעת הגנים החופפים נאספו באמצעות מבחן היפר-גיאומטרי (P = 1.28 x 10-6).

טבלה 1: גורמי שעתוק של מודול B המווסתים על ידי GR, לפי התחזית.

ChIP-SEq – ריצוף כרומטין אימונו-פרסיפיטציה. O/E – תוצאה ביחס לתחזית. התשמשנו ב- Pscan כדי למצוא אתרי קשירת TF בעלי ייצוג-יתר בגני מודול B בהשראת-EGF (n = 593). מוצגים ערכי-p בתיקון Bonferroni עבור מבחנים מרובים. הסט של הגנים נותח באמצעות קומפנדיום Pscan של ניסויי ChIP-Seq. ערכי-p התואמים מוצגים כחציון של הערכים בתיקון Bonferroni.

איור 5: שליטה דיורנלית בתוכניות שעתוק EGFR אצל בעלי חיים. (a,b) הכבדים של העכברים (n = 4) נאספו בזמן המצוין של היום או הלילה (אזורים אפורים) ונותחו באמצעות PCR-רוורס טרנסקריפטאז הפוך עבור ERRFI1 ו- DUSP1 (מווסתים שליליים) או HBEGF ו- TGFA (מווסתים חיוביים). ZT אפס מציין הדלקת אורות. (c) הסרום של עכברי WT נאסף ב- ZT4 ו- ZT10 (“יום”), או ZT15 ו- ZT20 (“לילה”), ונבחן באמצעות ניסוי immunosorbent קשור-אנזים עבור TGFA ו- HBEGF. (d) פאנל משולב  של אוסילציות מנוגדות של המווסתים השליליים (mig6, Dusp1 ו- sulf1) והחיוביים (Tgfa, Hbegf ו- Ereg) של EGFR כפי שדווחו במאגר Circa DB. רקמות המכרסמים הבאות שימשו כמקור ל- RNA במהלך שלב המנוחה והשלב האקטיבי: כבד, יותרת המוח, גזע המוח ואדיפוזה חומה.

תגובות טובות יותר לתרופת EGFR במהלך שעות היום

האותות הנוצרי על ידי EGFR והקרובים שלו, הנקראים HER2 או ERBB2, מניעים מספר סוגים של גידולים, והתרופות המפריעות לאותות אלו הן אקטיביות אצל מטופלים בעלי גידולים המציגים צורות חריגות של RTKs אלו. לפטיניב, תרופה אוראלית בעלת משקל מולקולארי נמוך המשמשת לטיפול בסרטן השד, מעכבת באופן ספציפי את פעילות הטירוזין קינאז של EGFR ו- HER2. ההשערה שלנו חזתה כי נטילת לפטיניב בתחילת שלב המנוחה (דיורנלי) אצל עכברים הנושאים גידולים הנגרמים מ- EGFR/HER2, תעכב באופן מוצלח יותר את הצמיחה הטומוריגנית בהשוואה לנטילה במהלך השלב האקטיבי, שבו איתות ה- EGFR מדוכא באופן איתן על ידי GRs ליגנדיים בכל מקרה. באופן ראוי לציון, תאי MCF10A אינם טומוריגניים, ותאים טומוריגניים רבים של בלוטות החלב זקוקים לאואסטרוגן עבור הישרדותם. לפיכך, עבור ניתוחי in vivo, בחרנו במודל תאים חלופי, תאי סרטן גסטרי אנושיים N87, הרגישים לתרופות ממוקדות-EGFR-HER2. באופן ראוי לציון, יישום של תאים שונים in vivo (גסטריים) ו- in vitro (בלוטות החלב) הינו בעייתי, בהתחשב במחסור של קו תאי סרטן שד הולם. חשוב לציין כי אימתנו את התגובה של תאי N87 ל- EGF ו- DEX באופן הדומה לתגובות של תאי MCF10A במונחים של שני מווסתי משוב (איור נספח 5). בדומה, הוכחנו כי התאים הגסטריים, כמו תאי בלוטות החלב, הגבירו את הנדידה שלהם בתגובה ל- EGF, אך טיפול עם DEX עיכב את הנדידה. בשלב הבא, העכברים (CD1/nude) קיבלו זריקות תת-עוריות של תאי N87, ולאחר שהגידולים הפכו למוחשיים ביצענו חלוקה אקראית של העכברים למספר קבוצות. קבוצת ה”יום” קיבלה לפטיניב, בדיוק לפני תחילת שלב המנוחה, בעוד קבוצה ה”לילה” טופלה בתחילה השלב האקטיבי (תרשים באיור 6d), שתיהן בהזנה אוראלית כפויה. עקבנו אחר נפח הגידולים ומשקל הגוף במשך תקופה של מספר שבועות, ומשקלי הגידולים נבדקו בסוף הניסוי (איורים 6e, f). התוצאות הוכיחו התגברות מובהקת סטטיסטית של ההשפעה התרפויטית של הלפטיניב כאשר היא נערכה בדיוק לפני תחילת שלב המנוחה (ZT23), ושללו השפעות שליליות על משקל הגוף.

מעניין לראות כי נמצאו הבדלים בין הגידולים לא רק בגודל, אלא גם בצורתם החיצונית, ממצא המלמד כי נטילת הלפטיניב במהלך שלב המנוחה עיכבה בנוסף את האנגיוגנזיס של הגידולים (איור 6f, פאנל ימני), בהתאם להשפעה דומה של נוגדן נוגד-HER2 בניסויים על בעלי חיים. לצד מחקרי ה- in vitro ותצפיות שנערכו על עכברים עם מודיפיקציות גנטיות, השפעת התזמון על יעילות התרופה מספקת לא רק ראיות נוספות התומכות במודל שלנו, אלא גם מציעה אסטרטגיה פוטנציאלית המסוגלת לשפר את ההשפעות התרפויטיות של תרופות נגד סרטן.

איור 6: אוסילציות סירקדיות שולטות באיתות EGFR וצמיחת הגידולים. (a) עכברי WT ו- CRFR1-/- הומתו בזמנים המצוינים ונלקחה אקסטרקציה של mRNA מהכבד. ה- Errfi1 ו- Dusp1 נבדקו באמצעות PCR- רוורס טרנסקריפטאז. (b) הסטאטוס של אקטיבציית ERK בעכברי WT ו- CRFR1-/- (KO) נקבע באמצעות תספיג חלבון של תמציות הכבד. (c) הרמה המנורמלת של פעילות ה- ERK, לצד ריכוזי הקורטיקוסטרואיד בסרום התואמים, לפי radioimmunoassay (קווים מקוטעים; “גבוה מאוד” מתייחס לרוויה של הניסוי). Δ – הנקודה הנמוכה ביותר של פעילות ERK התואמת לשיא של GCs בעכברי WT. (d-f) עכברי CD1/nude קיבלו זריקות של 5 x 106 תאי N87. טיפול הלפטיניב (40 mg kg-1 ליום) התחיל לאחר שהגידולים הפכו למוחשיים, בערך שבועיים לאחר האינוקולציה. קבוצת ה”יום” קיבלה לפטיניב בהזנה אוראלית כפויה בדיוק לפני תחילת שלב המנוחה, בעוד שקבוצת ה”לילה” קיבלה לפטיניב בהזנה כפויה בתחילת השלב האקטיבי. מוצגים גדלי הגידולים ± SEM. בסוף הניסוי, הגידולים נשקלו (כל נקודה מייצגת עכבר אחד) וצולמו.

HR גבוה קשור בפרוגנוזיס חיובי של סרטן השד

מכיוון ש- EGFR ו- RTKs אחרים ממלאים תפקיד משמעותי בהתקדמות של סרטן השד אצל בני אדם, ומכיוון שהתוצאות שלנו מראות כי איתות GR מדכא RTKs, בחנו את החשיבות הפרוגנוסטית של GR בדגימות גידולים. לשם כך, השתמשנו בסט נתונים של סרטן השד המייצג אוסף של מעל 2000 דגימות סרטן שד ראשוני מבוארות קלינית, ממאגרי גידולים ב- UK ובקנדה (מערך נתונים METABRIC). כמעט כל המטופלים שהיו חיוביים ל- ER ו/או שליליים לקשרי הלימפה לא עברו כימותרפיה, בעוד שהמטופלים שהיו שליליים ל-ER וחיוביים לקשרי הלימפה כן עברו כימותרפיה. בנוסף, אף אחד מהמטופלים שהיו חיוביים ל- HER2 לא קיבל טרסטוזומב. בשל כך, הטיפולים היו הומוגניים בכל הנוגע לקיבוץ הרלוונטי קלינית. הניתוח של נתונים קליניים אלו מצא קשר בין שפע של GR (NR3C1) לבין זמן הישרדות ארוך יותר של המטופלים (P = 0.002, איור 7a). יחסים אלו אומתו על ידי שתי קבוצות בלתי תלויות קטנות יותר של מטופלים (איור נספח 6a). באופן ראוי לציון, אחד המחקרים הקודמים מצא קשר בין הישרדות נטולת-רלפסיה ארוכה יותר לבין ביטוי GR גבוה יותר בקבוצה של 87 מטופלים, אך ממצא זה היה מוגבל למטופלים חיוביים ל- ER. מעניין לראות כי ריבוד המטופלים מקוהורט METABRIC לפי שלב המחלה הראה כי ביטוי GR נמוך עשוי לנבא הישרדות ירודה רק בשלבים מתקדמים של המחלה (איור 7b), וניתוח דומה של שני קוהורטים קטנים יותר של מטופלים הראה כי GR נמוך קשור בפרוגנוזה ירודה רק אצל חולים ברמה 2 ו- 3, אך לא נמצא קשר דומה בקבוצת רמה 1. (איור נספח 6B). כלומר, קיימת אפשרות כי אובדן  ה- GR מתרחש בשלב מאוחר של התקדמות סרטן השד.

על מנת לשייך אבחנות אלו לתפיסה לפיה GR מדכא את איתות ה- RTK, ערכנו צביעה-אימונית ב- 362 דגימות של סרטן השד עבור GR והצורה האקטיבית של ERK. הגידולים דורגו, מצד אחד, כחיוביים או שליליים ל- phospho-ERK, ומצד שני לפי רמות GR גבוהות/בינוניות, נמוכות או בלתי מזוהות. ניתוח זה זיהה קורלציה הפוכה בים שפע ה- GR לבין האקטיבציה של ERK (איור 7c, P = 0.013). לסיכום, נראה כי מחסור ב- GR קשור לאקטיבציה גבוהה יותר של ERK ולפרוגנוזה ירודה.

לסיכום, חשפנו cross-talk שעתוק מורכב בין שני נתיבי איתות חשובים, RTKs ו- GRs. ה- cross-talk נשלט על ידי היכולת של GR לדכא אקטיבטורים עיקריים של איתות EGFR, ובו-זמנית, להפעיל לולאות משוב שלילי עזות, שבדרך כלל מרסנות את ה- RTKs. האבחנות אליהן הגענו במודלים של העכברים וניתוח דגימות המטופלים תומכות של רגולציה סירקדית של RTKs על ידי ציר ה- HPA הנוירואנדוקריני. המודל שלנו ומחקרי קסנוגרפט גידולים של בעלי חיים, מציעים גם הם אסטרטגיה לשיפור ההשפעה התרפויטית של תרופות סרטן נוגדות-RTK, באמצעות תזמון קפדני של נטילת התרופה.

איור 7: GR גבוה קשור בפרוגנוזה טובה יותר של סרטן השד. (a) דגימות סרטן שד ממאגר הנתונים METABRIC סווגו לשתי קבוצות בגודל זהה לפי רמות שעתוק ה- GR (גבוהה ונמוכה). מוצגת ההישרדות נטולת הרלפסיה (RFS) של כל קבוצה. (b) החולים בסרטן השד חולקו ל- 3 קבוצות בהתאם לשלב הגידול, והישרדות המטופלים נותחה ביחס לשפע ה- GR. (c) סקציות ייצוגיות של צביעה-אימונית של GR של קרצינומות שד פולשניות (331 מטופלים). נקבע המקטע של דגימות חיוביות ל- pERK בכל קבוצה ( P = 0.013, χ2-test). (d) מודל המציג את ה- cross-talk בין EGFR ל- GR במהלך השלב האקטיבי (מימין, רמה גבוהה של GC) ושלב המנוחה (שמאל, GC נמוכה). מוצגות לולאות משוב חיובי ושלילי המווסתות את איתות EGFR, והאיתות מחולק ל- 3 שכבות.

דיון

באופן משולב, הקליידים של 48 ה- NRs ו- 58 החברים במשפחת ה- RTKs ממלאים תפקיד מרכזי ברוב המוחלט של התהליכים הפיזיולוגיים והפתולוגיים, אך ה- cross-talk ההדדי שלהם אינו מובן דיו. נקודה זו הינה חשובה במיוחד בכל הנוגע לבלוטות החלב, שבהן יחסי גומלין מורכבים בין RTKs כמו EGFR ו- MET מצד אחד ו- NRs מן הצד השני שולטים בחילופים מורפוגניים ופונקציונאלים פוסט-נטאליים. באמצעות ניתוח EGFR ו- GR בתאי בלוטת החלב, הסקנו כי הצורה הליגנדית של GR מיישמת שתי זרועות מכאניות בכדי ליצור אנטגוניזם עם אותות EFGR, שבדרך כלל מובילים לנדידת תאים (מודל באיור 7d). באופן עקבי לאבחנות אליהן הגענו במודלים של בעלי החיים, ניתן לשער כי כתוצאה מאוסילציות סירקדיות של ליגנדי GR, האיתות של EGFR מדוכא באופן חזק במהלך שעות היום האקטיביות. אם נרחיב זאת לגבי RTKs אחרים, ה- cross-talk המדכא של GR-to-RTK עשוי להסביר את היכולת האופיינית של GR לעכב פרוליפרציה, אנגיוגנזיס ודלקות, תהליכים המתווכים על ידי סטים חופפים חלקית של RTKs. בנוסף, אוסילציות יומיות של איתות RTK עשויות להסביר את האתחול של השעון הסירקדי על ידי גורם פפטידרגי פוטטיבי, החולק יכולת לשלוט בגורם תגובת הסרום ובדינאמיקת האקטין יחד עם ליגנדים ספציפיים ל-EGFR. ראוי לציין בנוסף את הקורלציות המובהקות בין רמות הסרום של TGFA לבין אינטרלוקין-6, דפוסים סירקדיים בפעילות פרק היד וקורטיזול בסרום, וסימפטומים קשורי-גידול אצל מטופלים הסובלים מסרטן קולו-רקטאלי בעל גרורות.

האקטיבציה של GR מווסתת את הנדידה של תאים דנדריטים, יוצרת אנטגוניזם עם EGFR במהלך היווצרות העפעף. בדומה, טרום-טיפול של תאים אפיתליאליים עם קורטיזול או DEX, אך לא עם סטרואידים מינרלים, הוביל ל- downregulation של הביטוי בהשראת-EGF של 12-ליפוקסיגנאז ברמת ה- mRNA. בדומה, מצאנו כי נדידת תאי בלוטות החלב בהשראת-EGF מעוכבת באופן חזק על ידי DEX. ייתכן והשפעה מעכבת זו נגרמת מהאנטגוניזם של נתיב ERK/MAPK, מכיוון שנמצא כי איתות ERK-to-ETS הינו חיוני עבור נדידת תאי בלוטות החלב. בנוסף, ההשפעה המעכבת של DEX נמצאה קשורה לאקטיבציה קצרה יותר של ERK (איור 3f), ככל הנראה כתוצאה מאינדוקציה סימולטנית של מעכבי EGFR ו- ERK (ERRFI1 ו- DUSP1, בהתאמה). לפיכך, היכולת של GRs אקטיביים לעכב נדידה בהשראת-EGF הינה עקבית לאבחנות קודמות וייתכן והיא מפעילה מספר מנגנונים משלימים.

ההופעה המוקדמת בהשראת-EGF של שעתוקי משוב חיובי (מודול B) עשויה להיות מתווכת על ידי TFs קיימים, העוברים מודיפיקציות קוולנטיות מהירות לאחר הגירוי. ההשערה כי אלו עוברים טרנס-רפרסיה על ידי חיבור GRs, כפי שדווח לגבי AP1, STAT5, NF-κB ו- TFs אחרים. לפיכך, ניתחנו את הפרומוטרים של גני מודול B עבור אלמנטי תגובה חוזרים וזיהינו השערה מובהקת סטטיסטית עבור אתרי קשירה התואמים את IETFs שבדרך כלל מופעלים על ידי RTKs (לדוגמא, SP1 ו- ELKs). לפיכך, בהתאם ליכולת הדיכוי המוקדמת (איורים 2c,d) נראה כי GRs מפעילים באופן סלקטיבי תת-קבוצה של TFs, כולל EGR1, GABPA ו- ELK1, חלבונים המווסתים נדידה של תאי בלוטות החלב. באופן מעניין, חלק מה- IETFs המאומתים העוברים טרנס-רפרסיה על ידי GR, כמו GABPA ו- ELK1, שייכים למשפחת ETS, בעוד שאחרים (כמו SP1 ו- E2F1) מווסתים על ידי גורמי גדילה.

למרות שמחקרים קודמים הציגו את הפעולות הציטופלסמיות של GR, פעילויות הגרעין מתווכות את רוב הפעולות הפיזיולוגיות של GCs. לאחר טרנס-לוקציה לגרעין, ה- GRs מזרזים או מדכאים את השעתוק של גני המטרה באמצעות קשירה לאלמנטי תגובה “פשוטים”, וכמו גם ל- GREs שליליים, בהתאמה. באופן חלופי, ה- GRs עשויים להתחבר למספר TFs אחרים. התוצאות שלנו מראות כי הרגולציה של שעתוק בהשראת-EGF על ידי GR מיישמת את שתי הצורות. חשוב לציין כי גילינו שאיתות GR רותם מוטיבי רשת מאופיינים היטב. סטים אלו של משוב חוזר ולולאות feed-forward משמשים כאבני הבניין של רשתות השעתוק והאיתות. ברשת ה- EGFR, קבוצה של גורמי גדילה מופרשים תלויי-אקטיבציה, הכוללת ציטוקינים וליגנדי EGFR, גם מזרזת וגם מאריכה את משך האיתות. באופן הדדי, קבוצה ברת-השראה נוספת, המקדדת חלבוני ציטופלסמה שונים, מפסיקה את האיתות. על מנת לחסום באופן איתן את הנדידה, נראה כי ה- GR מגייס את שתי זרועות הרוגלציה של הרשת: ציטוקינים וליגנדים דלקתיים של EGFR עוברים damping ובאותו זמן מעכבי EGFR ציטופלסמיים מוגברים.

על ידי שימוש בעכברי Crfr1-knockout ויישום של משוב שלילי (מודול A) (Errfi1 ו- Dusp1) ומשוב חיובי (מודול B, Hbegf ו- Tgfa) בתור מארקרים, השגנו ראיות in vivo התומכות ברגולציה סירקדית של איתות EFGR, בדומה לרגולציה הדיורנלית המדווחת של ERK בכבד. אוסילציות יומיות של איתות RTK מדווחות כאן לראשונה, וייתכן והן קשורות למחקר קודם המראה כי פרמטרי קשירת ליגנדים הפטיים של EGFR (קשירה מקסימאלית וקבוע דיסוציאציה) עוברים שינויים קצביים; אצל עכברים שניהם הגיעו לשיא מאוחר בשלב החשיכה ופחתו מאוחר בשלב האור. אוסילציות אלו ככל הנראה משפיעות על תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים. לדוגמא, חלק מתרופות האסתמה האפקטיביות ביותר הן GCs נשאפים, המעכבים דלקות בדרכי הנשימה, אך משפיעים לרעה על איחוי פצעים אפיתליים על ידי דיכוי של נדידת התאים. ככל הנראה, השפעה כפולה זו של GCs נובעת מדיכוי של RTKs ספציפיים הרלוונטיים לפסוריאזיס, פיברוזיס וטרשת העורקים, פתולוגיות המושפעות מ- RTKs ספציפיים. בפרט, האסוציאציה בין התקדמות הסרטן לבין דלקות הינה מוכרת היטב, ובהתאם לכך, תרופות אנטי-דלקתיות יכולות למנוע היווצרות ספונטנית של גידולים אצל אנשים עם פוליפוזיס משפחתית (FAP). חשוב לציין כי ליגנדי EFGR המעוכבים על ידי DEX, כמו HB-EGF ו- TGFA, הינם גורמים מניעים מוכרים של איתות אוטוקריני בסרטן, בעוד שמעכבי EFGR בהשראת-DEX, כמו ERRFI1/MIG6, עוברים downregulation באופן קולקטיבי בגידולים שונים. בהתאם לראיות אלו, אספנו נתונים ממטופלים הסובלים מסרטן השד זיהו אסוציאציה בין GR גבוה לבין זמן הישרדות ממושך יותר, וצביעה-אימונית שנערכה על קוהורט בלתי תלוי זיהתה קורלציה הפוכה בין GR נמוך לבין ואקטיבציה של נתיב ERK. באופן ראוי לציון, התוצאות שלנו עקביות למחקר שכלל הרס מוחלט של הגרעין הסופרכיאזמטי, שהוביל לאבלציה של מחזור המנוחה-פעילות של 24 השעות והמקצבים היומיים של רמת הקורטיקוסטרון בסרום. שינויים אלו לצמיחה מהירה פי 2-3 של שני סוגי הגידולים.

הרגולציה הדיורנלית של פעילות EGFR על ידי GR מלמדת כי התקדמות הגידולים הנגרמת מצורות חריגות של RTKs מדוכאת באופן חזק במהלך השלב האקטיבי בשעות היום, אך היא עשויה להגיע להשפעה מלאה במהלך שלב המנוחה, כאשר רמות ה- GC הן נמוכות. מחקרי קסנוגרפט הגידולים תומכים במודל זה, כלומר, ייתכן וחולי סרטן יפיקו תועלת רבה יותר מכרונותרפיה במקום מאינפוזיה קבועה של תרופות ממוקדות-RTK. מספר אבחנות הן רלוונטיות לתרחיש זה. לדוגמא, EGFR ואחד הליגנדים שלו, TGFA, מעורבים בשליטה היומית בפעילות הלוקומוטורית. בנוסף, מקצב קורטיזול דיורנלי שטוח יכול לנבא גרורות של סרטן השד, ומחקרים שנערכו על עכברים הראו כי תרופת pan-RTK עיכבה באופן מוצלח יותר גידולים כאשר היא נלקחה בשלב המנוחה, במקום בשלב האקטיבי.

חשוב לציין כי פיזיולוגיה סירקדית, לצד מגדר, גני שעון ומחזור התאים משפיעים באופן קריטי על התוצאות של הכרונותרפיה, כולל טיפול בסרטן קולו-רקטלי עם נוגדן אנטי-EGFR.יהיה מעניין לבדוק את ההשפעה של תזמון הטיפול על תגובת הגידולים לנוגדני אנטי-EFGR כמו צטוקסימב. למרות שפרמטרי הפרמקוקינטיקה של הנוגדנים הם בדרך כלל ארוכים יותר מאלו של מעכבי טירוזין קינאז, יש לציין כי אחד המחקרים הקודמים מצא רזקטביליות כירורגית משנית משופרת של סרטן קולו-רקטלי שטופל עם צטוקסימב וכימותרפיה סירקדית באפנון כרונולוגי, המיושמת בדרך כלל יחד עם DEX. בנוסף, תזמון קפדני של התרופות עשוי לשפר את התגובה הגבולית של סרטן הריאות לכימותרפיה עם צטוקסימב. המחקרים העתידיים עשויים לפתור שאלות כמו הרלוונטיות של כרונו תרפיה ממוקדת-RTK לנוגדנים מונוקלונאליים נוספים וסוגים אחרים של תרופות נגד סרטן.

שיטות

תרבית תאים וריאגנטים

תאי MCF10A גודלו בתווך DME:F12 בתוספת 10 μg ml-1 אינסולין, 0.1 μg ml-1 כולרה טוקסין, 0.5 μg ml-1 HC, 5% סרום סוסים שעבר אי-אקטיבציה בחום, ו- 10 ng ml-1 EGF. התאים הורעבו במשך הלילה בתווך, ולאחר מכן עברו גירוי עם EGF (10 ng ml-1) או DEX (100 nM). טרנסקציות siRNA השתמשו באוליגופקטמין, ואוליגונוקליאוטידים ON-Target SMART. הלפטיניב (di-p-Toluenesulfonate salt) נרכש מ- LC Laboratories ונוסח כתרחיף ב- 0.5% הידרוקסיפרופיל מתילצלולוזה ו- 0.1% Tween 80. התרופה יושמה בהזנה אוראלית כפויה במינון יחיד. חלקיקי RNA short hairpin ספציפיים ל-Mig6 נוצרו בתאי 293FT באמצעות הפלסמיד התואם.

הכנת ליזטים וניתוח תספיג חלבון

הליזטים של התאים טוהרו באמצעות צנטריפוגה ויושבו באמצעות אלקטרופורזיס, ולאחר מכן בוצעה העברה אלקטרופורטית לממבראנת ניטרוצלולוזה. הממבראנות נחסמו עם TBS-T (תמיסת מלח עם חוצץ-Tris המכילה Tween-20) המכיל 1% חלב דל-שומן, עברו blotting עם נוגדן ראשוני במשך שעה אחת, נשטפו 3 פעמים עם TBS-T, עברו אינקובציה במשך 30 דקות עם נוגדן משני המחובר לפרוקסידאז חזרת ונשטפו עם TBS-T. בנדים אימונו-ריאקטיביים זוהו באמצעות ריאגנט ECL.

בידוד RNA, PCR ומיקרו-מערכים

ה- RNA מתרביות התאים בודד באמצעות ערכת PerfectPureו ה- RNA מרקמות בעלי החיים בודד באמצעות ערכת PerfectPure Tissue. השתמשנו במערכי Affymetrix GeneChip Human Exon 1.0 ST והנתונים הופקדו ב- Gene Expression Omnibus. ה- PCR של pre-mRNA או mRNA השתמש בפריימרים קדמיים הממוקמים באינטרון או האקסון השני, בהתאמה. כל התגובות בוצעו באמצעות Power SYBR Green PCR Master Mix. רצפי הפריימרים מפורטים בטבלה נספחת 1. עבור PCR בתפוקה גבוהה, השתמשנו במערכת Fluidigm BioMark. השתמשנו ב- Affymetrix Expression Console עבור ניתוחי מערכי ה- DNA.

ניסויי מוטיליות תאים

התאים (5 x 104 תאים לכל החדרה) הונחו בחלק העליון של מגש 24-well transwell, ובחנו את הנדידה שלהם. לאחר מכן, התווך בחלק התחתון של התא קיבל תוספת של הסוכנים המסומנים והתאים הורשו לנדוד במשך 16 שעות ב- 37oC דרך ממבראנת הניטרוצלולוזה המתערבת (גודל נקבובית 8 μm). לאחר מכן המסנן הוסר וקובע במשך 15 דקות בתמיסת מלח המכילה פרפורמלדהיד (3%), ולאחר מכן בוצעה פרמאביליזציה של התאים ב- Triton X-100 (0.05% ב- PBS) והכתמה עם crystal violet. התאים שגדלו על הצד העליון של המסנן גורדו עם מקלון כותנה, והתאים הממוקמים על הצד התחתון צולמו ונספרו. בנוגע לנדידה הקולקטיבית, 8 x 104 תאים נזרעו ב- Insets מפלסטיק, ולאחר אינקובציה במשך הלילה מחסומי הפלסטיק הוסרו והוקלטו תמונות time lapse. ניסויי פלישת התאים נערכו באמצעות BioCoat Matrigel Invasion Chambers. עבור המעקב, התאים נזרעו (3 x 103 תאים לכל cm2) על micro-slides מצופי קולגן. בנוגע לנדידה הקולקטיבית, 8 x 104 תאים נזרעו ב- Insets מפלסטיק, ולאחר אינקובציה במשך הלילה מחסומי הפלסטיק הוסרו והוקלטו תמונות time lapse תחת התנאים המצוינים. נערך מעקב אחר הפוזיציות של גרעיני התאים תוך כימות באמצעות ImageJ.

ניתוח דגימות אנושיות

אימונו-היסטוכימיה של רקמות בקיבוע פורמלין והטמעת פרפין נערכה באמצעות מערכת Envision Detection. לאחר השבת האנטיגן, הוסף נוגדן אנטי-ERK או אנטי-GR ועבר אינקובציה במשך הלילה ב- 4oC. לאחר צביעה-אימונית, הסליידים עברו צביעה-נגדית עם המטוקסילין Mayer. שני פתולוגים בלתי תלויים אמדו את רמות החלבון. ניתוח הנתונים הסטטיסטי נערך באמצעות SPSS suite. ניתוח הישרדות המטופלים נערך על קוהורט שתואר בעבר. מבחן ה- χ2 שימש לניתוח אסוציאציות בין משתנים קטגוריים, ומודל Cox הותאם לנתונים תוך שימוש במוות הספציפי לסרטן השד בתור נקודת הסיום.

מחקרי בעלי החיים

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה האתית של מכון וייצמן. C57BL/6 (Harlan), B6SJL CRFR1 (WT ומוטציות) נשמרו תחת תנאי flora במחזורי 12 שעות של אור-חושך. עבור מבחני השעון היומיים, הנקבות (גיל 10-12 שבועות) התחלקו לשתי קבוצות: קבוצה אחת נשמרה בחדר היום-לילה, והקבוצה השנייה נשמרה בחדר מיוחד (עם מחזורי יום-לילה הפוכים). העכברים התאקלמו במשך שבוע לפני האקסטרקציה של החלבון וה- RNA. עבור מבחני קסנוגרפט הגידולים, עכברי athymic nude (nu/nu) בני 8 שבועות שימשו ונשמרו בסביבה נטולת-פתוגן. העכברים (n = 10 לכל קבוצה) עברו אינוקולציה תת-עורית ברגל שמאל (באמצעות מחט סטרילית 22-gauge) עם 5 x 106 תאי N87. העכברים התחלקו אקראית לשתי קבוצות שקיבלו טיפול יומי של לפטיניב בהזנה אוראלית כפויה (40 mg kg-1) בלילה (שעתיים לאחר כיבוי אורות) ובשעות היום (~70 דקות לפני הדלקת האורות). הטיפולים התחילו שבועיים לאחר הזרקת התאים. הרוחב (W) והאורך (L) של הגידולים נמדדו פעם בשבוע עם קליפר ונפח הגידולים (V) חושב לפי הנוסחא: V = 0.5 x W2 x L.