(13/06/2024) עלו היום לאתר 9 סמינריונים 2 תזות 2 מאמרים

לרכישה גלול למטה לסוף הדוגמית

דימות פוטו-אקוסטי ביו-רפואי Biomedical photoacoustic imaging

דימות פוטו-אקוסטי ביו-רפואי

דימות פוטו-אקוסטי (PA), הנקרא גם דימות אופטו-אקוסטי, הינו מודאליות דימות ביו-רפואית המבוססת על שימוש באולטראסאונד לייזר, שהתפתחה במהלך העשור האחרון. זוהי מודאליות היברידית, המשלבת את הספציפיות בעלת הקונטרסט הגבוה המבוססת-ספקרטרוסקופ של דימות אופטי, עם הרזולוציה המרחבית הגבוהה של דימות אולטראסאונד. במהותה, תמונת PA יכולה להיחשב כתמונת אולטראסואנד שבה הקונטרסט אינו תלוי בתכונות המכאניות והאלסטיות של הרקמה, אלא בתכונות האופטיות שלה, ובפרט הבליעה האופטית. בשל כך, היא מאפשרת ספציפיות רבה יותר בהשוואה לדימות אולטראסאונד רגיל, עם יכולת לזהות המוגלובין, ליפידים, מים וכרומופורים בולעי-אור אחרים, אך עם עומק חדירה גדול יותר מאשר מודאליות דימות אופטי טהורה המסתמכת על פוטונים בליסטיים. לצד דימות של מבנים אנטומיים כמו המערכת המיקרו-וסקולארית, היא יכולה בנוסף לספק מידע פונקציונאלי בצורת אוקסיגנציה של הדם, זרימת דם וטמפרטורה. ניתן להשיג כל זאת בטווח רחב של סקאלות אורך, ממיקרומטר עד סנטימטר, עם סילום של הרזולוציה המרחבית. מאפיינים אלו מאפשרים שימוש בדימות PA בשלל יישומים ברפואה הקלינית, מחקרים פרה-קליניים וביולוגיה בסיסית עבור חקר הסרטן, מחלות קרדיו-וסקולריות, אבנורמאליות במיקרו-סירקולציה ומצבים אחרים. תודות למגוון תמונות in vivo שהושגו על ידי מספר קבוצות ברחבי העולם ב- 2-3 השנים האחרונות, הטכניקה השתכללה והפוטנציאל של דימות PA מתחיל כיום להתממש. ההישגים הבולטים האחרונים כוללים הדגמה של דימות כלל-גופני של בעלי חיים קטנים, הדגמה ראשונה של דימות מולקולארי, הצגת צורות חדשות של מיקרוסקופיה, והצעדים הראשונים לקראת דימות שד קליני, לצד שלל מחקרי in vivo של דימות פרה-קליני. במאמר זה אנו מציגים סקירה של העקרונות הפיזיים בבסיס השיטה, היישום הפרקטי שלה, ומגוון יישומים קליניים ופרה-קליניים.

1. סקירה כללית

המחקר לגבי הפיזיקה הבסיסית של דימות PA כולל היסטוריה ארוכה וספוראדית שהחלה ב- 1880, כאשר אלכסנדר גראהם בל גילה לראשונה את אפקט ה- PA לאחר שהבחין בהתחוללות קול לאחר בליעה של אור-שמש מאופנן. לאחר מכן נערכו מחקרים מועטים בלבד או התפתחויות טכניות, עד הפיתוח של הלייזר בשנות ה- 60, שסיפק את עוצמת השיא, טוהר ספקטראלי והכיווניות הנדרשים עבור יישומי PA רבים. גל של יישומי חישה תעשייתיים ומדעיים החל לצבור תאוצה בשנות ה- 70 וה- 80. עם זאת, יישומים אלו ניצלו את סוג התא העקיף של פאזת הגז של גילוי PA, שבה גלים אקוסטיים המתחוללים בגז ונגרמים על ידי משטח מחומם בלייזר מתגלים באמצעות מיקרופון. תהליך זה מנוגד לגילוי הישיר של גלי אולטראסאונד בהשראת-לייזר המשמש בדימות PA ביו-רפואי. למרות שגילוי ישיר זה נחקר עבור מוצקים מאפיינים בתור כלי ניסוי בעל פוטנציאל בלתי-הרסני, רק באמצע שנות ה- 90 הוא החל להיבחן למטרות דימות ביו-רפואי כאשר התמונות הראשונות החלו להופיע לאחר מכן. מחקרים מוקדמים אלו, שנערכו על ידי מספר קטן של חוקרים, התקדמו באופן יציב אך איטי למדי, עד תחילת ואמצע שנות ה- 2000 כאשר התמונות הברורות הראשונות in vivo החלו להופיע. מנקודה זו ואילך, תחום זה צמח במהירות במונחים של התפתחות הכלים, אלגוריתמים של שחזור תמונות, יכולות דימות פונקציונאליות ומולקולאריות, ויישומי in vivo של רפואה קלינית, ובמחקרים ביולוגיים. מאמר זה מתמקד בתקופה מאוחרת זו.

בדימות PA או תרמו-אקוסטי, גלי אוטלראסאונד עוברים עירור על ידי הקרנה של רקמות באמצעות קרינה אלקטרומגנטית מאופננת, בדרך כלל בפולסים של ננו-שנייה, למרות שניתן להשתמש בטכניקות אפנון אחרות. בדימות PA, אורכי גל אופטיים בחלק הנראה והאינפרא-אדום הקרוב (NIR) של הספקטרום, בין nm 550-900, מיושמים באופן הנפוץ ביותר. הטווח הספקטראלי של NIR ב- 600-900 nm מאפשר את עומק החדירה הגדול ביותר, עד מספר סנטימטרים. דימות תרמו-אקוסטי מיישם אורכי גל גדולים יותר באופן משמעותי, מעבר לספקטרום האופטי ועד הבנד של מיקרו-גל (300 MHz – 3 GHz), ויכולים לספק עומקי חדירה גדולים אף יותר. במקרה של עירור אופטי, הבליעה על ידי כרומופורים ספציפיים ברקמה כמו המוגלובין, מלנין, מים או ליפידים, ולאחר מכן המרה מהירה לחום, מפיקה עלייה קטנה בטמפרטורה (פחות מ- 0.1 K בקירוב) – הרבה מתחת לזו הנדרשת בכדי לגרום לנזק פיזי או שינויים פיזיולוגיים ברקמות. מצב זה מוביל לעלייה ראשונית בלחץ, הפוחת לאחר מכן ומוביל לפליטה של גלים אקוסטיים בפס רחב (עשרות מגה-הרץ בקירוב) באמפליטודה נמוכה (פחות מ- 10 kPa). גלים אלו עוברים פרופגציה אל פני השטח שם הם מתגלים על ידי רסיבר אולטראסאונד בודד בסריקה ידנית, או מערך של רסיברים בכדי לאסוף רצף של קווי-A. על ידי מדידה של זמן ההגעה של הגלים האקוסטיים והכרת מהירות הקול, ניתן לבנות תמונה באופן הדומה ליצירת תמונת אוטלראסאונד פולס-הד קונבנציונאלית. בהתחשב בצורת הדימות הספציפית (ראה 4§) קווי ה- A המתועדים יכולים לשמש באופן ישיר בכדי ליצור תמונה, או לשמש יחד עם אלגוריתם שחזור המבוסס על עקרונות של הקרנה אחורית או עיצוב אלומה במערך מופע. אחד ההבדלים החשובים בין אולטראסאונד פולס-הד (US) ודימות PA הוא כי ב- US, ניתן להשיג לוקאליזציה על ידי מיקוד האלומה המשודרת ועל ידי מיקוד האלומה החוזרת. בדימות PA, בעומקים גדולים מ- 1 mm בקירוב, רוב הפיזור האופטי הנוצר על ידי מרבית הרקמות הרכות שולל את המיקוד של האות המשודר – אור העירור – למטרות לוקאליזציה. בדימות PA, עבור עומקים העולים על 1 mm בקירוב, ניתן להשיג לוקאליזציה באמצעות קליטה בלבד. הבדל נוסף בין דימות PA ל- US הוא במגניטודה של הלחצים האקוסטיים. סורקי US קליניים דיאגנוסטיים יכולים להפיק לחצי שיא ממוקד של מעל 1 MPa, בעוד שאמפליטודות הלחץ של PA הן נמוכות במספר סדרי גודל, בדרך כלל פחות מ- 10 kPa. לפיכך, פרופגציה אקוסטית לא-ליניארית אינה מתקיימת בדימות PA, כך שלא קיימת מקבילה בדימות PA לדימות רקמות הרמוני ב- US. אמפליטודות הלחץ הנמוכות ב- PA פירושן בנוסף כי הסכנות הפוטנציאליות הנובעות מדימות US אינן מהוות בעיה – אלו הקשורות בחשיפה ללייזר גוברות על שיקולי הבטיחות.

למדות שדימות PA ו- US והגורמים המשפיעים על האיכות והרזולוציה המרחבית הם זהים באופן בסיסי, מקורות הקונטרסט של התמונות הם שונים ביותר. תמונת US מספקת ייצוג של חוסר ההתאמה האקוסטית בין רקמות שונות. לפיכך, דימות US תלוי במאפיינים האלסטיים והמכאניים של הרקמה. דימות PA לעומת זאת, מייצג את התפלגות הלחץ הראשונית הנוצרת על ידי הדפוזיציה של האנרגיה האופטית. באמצעות מספר הנחות, ניתן להתייחס לתמונה זו כפרופורציונאלית להתפלגות האנרגיה האופטית הנבלעת, התלויה בבליעה האופטית ומאפייני הפיזור של הקרמה. למעשה, בליעה זו היא הדומיננטית ולפיכך הקונטרסט של דימות PA נחשב כ”מבוסס-בליעה”. כתוצאה מכך, דימות PA יכול לספק בידול גדול יותר בין הרקמות וספציפיות מאשר US, מכיוון שהבדלים בבליעה האופטית בין סוגי רקמות שונים יכולים להיות גדולים בהרבה מאלו בעכבה (אימפדנס) אקוסטית. דוגמא לכך היא הבליעה האופטית החזקה של המוגלובין. עובדה זו הופכת את דימות PA למתאים במיוחד עבור דימות של המערכת המיקרו-וסקולארית, אותה קשה לדמות באמצעות US פולס-הד בשל האקוגניות החלשה של כלי דם זעירים. בנוסף, התלות הספקטראלית של בליעה אופטית מאפשרת קונטרסט בזכות כרומופורים ספציפיים ברקמות אותם ניתן להגביר באופן סלקטיבי על ידי כוונון גל העירור של הלייזר לשיא הבליעה שלהם. לפיכך, לדוגמא, הנוכחות של מאגרי ליפידים בפלאקים אתרומטים ניתנת לזיהוי באמצעות בחירה באורך גל עירור התואם את שיא הבליעה של ליפידים ב- 1210 nm. ניתן לנצל את האופי הספקטרוסקופי של אפקט ה- PA בכדי לכמת את הריכוז של כרומופורים ספציפיים באמצעות החתימה הספקטראלית שלהם בכדי להפיק פרמטרים פיזיולוגיים. אחת הדוגמאות החשובות לכך היא מדידה ספקטרוסקופית של החמצן הרווי בדם (sO2). על ידי הפקת תמונות באורכי גל שונים ויישום של ניתוח ספקטרוסקופי, ההבדלים הספקטראליים הידועים באוקסיהמוגלובין (HbO2) ודאוקסיהמוגלובין (HHb) יכולים לשמש לכימות הריכוזים שלהם ובכך לקבל מדידה של sO2 בדם.

עם זאת, למרות שהשונות הגדולה במאפייני הבליעה האופטית של הרקמות מאפשרת את הקונטרסט הגבוה בדימות PA, יש לה מחיר, הבא לביטוי בעומק החדירה. לדוגמא, למרות שהבליעה המועדפת החזקה של המוגלובין מהווה יתרון במונחים של קונטרסט, היא תורמת בנוסף להחלשה האופטית החזקה של מרבית הרקמות. כתוצאה מכך, למרות שניתן להשיג עומקי חדירה של מספר סנטימטרים, דימות PA ככל הנראה לעולם לא יוכל להתחרות בגבול עומק החדירה של US, היכול להגיע ל- cm 10  ומעלה ברקמות רכות. מצד שני, עומד החדירה האפשרי באמצעות PA עולה באופן מובהק על זה של טכניקות דימות אופטי טהורות כמו מולטי-פוטון או מיקרוסקופיה קונפוקלית המסתמכות על פוטונים בלתי מפוזרים או בליסטיים. לצד היכולת לדמות מבנה ופונקציות באמצעות בליעה אופטית והתלות שלה באורך גל, יכולות אחרות של דימות PA כוללות מדידת זרימת הדם על ידי ניצול אפקט דופלר אקוסטי באופן דומה לדופלר US, וחישת טמפרטורה באמצעות התלות בטמפרטורה של תהליך התחוללות ה- PA.

השילוב של הדיסקרימינציה הספקטראלית החזקה הנובעת מאינטראקציות אופטיות של הרקמות עם הרזולוציה המרחבית הגבוהה הקשורה בפרופגציה של אולטראסאונד, מאפשרת שימוש ב- PA במגוון יישומים פוטנציאליים ברפואה קלינית, מחקרים פרה-קליניים, וביולוגיה. היכולת למפות את המבנה, מצב החמצון ומאפייני הזרימה של כלי הדם הופך את דימות PA למתאים במיוחד לבדיקת גידולים ופתולוגיות אחרות המאופיינות באבנורמאליות במורפולוגיה ובתפקוד של כלי הדם. יישומים קליניים נוספים היכולים לנצל יכולת זו הם דימות של סרטן שד ועור. יישומים נוספים הם אומדן של המערכת המיקרו-וסקולרית בכדי לבחון נזקים שטחיים לרקמות הרכות, כמו כוויות או אבנורמאליות של המיקרו-סירקולציה אצל חולים עם מחלות ורידים בגפיים התחתונות וסכרת. באמצעות ניצול הקונטרסט הנוצר מבליעה של ליפידים, קיים פוטנציאל לזיהוי של פלאקים פגיעים העלולים להיקרע בעורקי הלב באמצעות דימות PA תוך-ורידי, בדומה לאולטראסאונד תוך-ורידי (IVUS). יישומים קליניים אחרים כוללים רפואת עיניים, אולטראסאונד באינטנסיביות גבוהה (HIFU), והשגחה טיפולית פוטו-תרמית. דימות PA יכול לשמש בחקר של מודלי עכברים, המשמשים באופן נפוץ בתור פלטפורמה פרה-קלינית לחקר של תהליכי מחלה אצל בני אדם. לצד דימות של האנטומיה והפיזיולוגיה של מודלי בעלי חיים קטנים, לדימות PA יש פוטנציאל רב בתור מודאליות דימות מולקולארית פרה-קלינית באמצעות שימוש בסוכני בליעה אופטית ממוקדי קונטרסט או גנים מדווחים המבטאים חלבוני בליעה.

בספרות קיימים מספר מחקרים קודמים לגבי דימות PA, כולל כאלו המתמקדים בהיבטים ספציפיים של השיטה כמו התפקיד שלה בדימות נוירוני, דימות מולקולארי, ודימות מיקרו-וסקולארי, לצד סקירות כלליות יותר. מטרת מאמר זה היא לספק סקירה כללית של הפיזיקה הבסיסית של דימות PA, ההטמעה הפרקטית שלה, יכולת הדימות הפונקציונאלית והמולקולארית שלה והיישומים הביו-רפואיים בהם ניתן להשתמש בה. המאמר נועד בנוסף להשוות בין שיטה זו לבין אולטראסאונד קונבנציונאלי, בהתחשב בדמיון בין שתי מודאליות אלו. לפיכך, ב- §2מוצגת בחינה של התכונות הפיזיות העומדות בבסיס הקונטרסט של דימות PA ורכיבי הרקמות הספציפיים התורמים לו. חלק 3 דן בגורמים המגדירים את עומק החדירה ואת הרזולוציה המרחבית. שתי הצורות העיקריות של דימות PA והוריאציות שלהן, טומוגרפיית PA (PAT) ומיקרוסקופיה, מתוארות ב- §4. האמצעים בהם ניתן לחרוג מדימות מבני טהור ולספק מידע פונקציונאלי, פיזיולוגי ומולקולארי באמצעות ספקטרוסקופיית PA, פלומטריה ותרמומטריה מתוארים ב- §5. לבסוף, מגוון של יישומים קליניים ופרה-קליניים קיימים ופוטנציאליים של הדימות מוצגים ב- §6.

2. קונטרסט דימות פוטו-אקוסטי

בכדי לזהות את המקור של קונטרסט דימות PA, יש לבחון את תהליך התחוללות האות של PA. כפי שתיארנו מעלה, אור לייזר מועבר בפולסים על שטח הרקמה. בהתחשב באורך הגל, האור חודר לעומק מסוים. לאחר מכן האור מתפזר ונבלע, כאשר הבליעה נעשית באמצעות מולקולות בולעות אור הנקראות כרומופורים. אנרגיית הלייזר הנבלעת מומרת לחום באמצעות רלקסציה ברעידות והתנגשויות. תהליך זה גורם לעלייה ראשונית בלחץ ולאחר מכן לפליטה של גלים אקוסטיים העוברים פרופגציה לפני השטח שם הם מתגלים. באופן זה, מנגנון התחוללות האות נחשב ככזה שבו התפלגות הלחץ הראשונית בהשראה אופטית p0 מקודדת לגל אקוסטי בפרופגציה אשר לאחר הגילוי באמצעות רסיבר אולטראסאונד הממוקם על פני השטח, עובר המרה לאות חשמלי ברזולוציית זמן. מכיוון שתמונת ה- PA נוצרת לאחר מכן מסט של אותות PA כאלו המזוהים בנקודות מרחביות שונות, נובע מכך כי תמונת ה- PA הינה ייצוג של p0. בהתחשב בכך, באילו תכונות פיזיות של הרקמה תלוי p0? כצפוי, p0 קשור לחום המופק מאנרגיית הלייזר. אם נניח כי קיים חימום אימפולסיבי, מצב זה דורש כי זמן הפרופגציה האקוסטית יהיה קטן בהשוואה לאורך של נפח החימום, אזי באמצעות בחינה תרמו דינאמית פשוטה ניתן להראות כי p0 בנקודה r הינו פרופורציונאלי לאנרגיה האופטית הנבלעת H(r).

image3 123

כאשר Γ ידוע בתור מקדם גרונאייסן, קבוע תרמו דינאמי נטול-ממד המספק מדידה של יעילות ההמרה של אנרגיית חום ללחץ הנקבע על ידי image1 158כאשר β הוא נפח התפשטות החום, c הוא מהירות הקול ו- Cp הוא קיבולת החום הספציפית בלחץ קבוע. התפלגות האנרגיה האופטית הנבלעת H(r) נקבעת על ידי התוצר של מקדם הבליעה המקומית μa(r) והזרימה האופטית image2 141כאשר μa ו- μs הם מקדמי הבליעה והפיזור על פני נפח הרקמה המואר ו- g הוא גורם האניסוטרופיה. כאשר כותבים את p0 באופן מפורש, מקבלים:

image5 97

כפי שניתן ללמוד ממשוואה (2.2), P0 תלוי במגוון פרמטרים מכאניים, תרמו דינאמיים ואופטיים. עם זאת, בדימות PA, התכונות המכאניות והתרמו-דינאמיות משתנות באופן חלש ביותר בין סוגי רקמות שונים, כך שניתן להתייחס אליהן למעשה כבלתי משתנות מבחינה מרחבית. קיימות מגבלות מסוימות להנחה זו וקיימת הכרה גוברת בכך כי קונטרסט הדימות המופק מרקמות מסוימות עשוי לנבוע בחלקו מהטרוגניות במקדם גרונאייסן. עם זאת, ניתן להניח כי קונטרסט הדימות נשלט על ידי תכונות הבליעה האופטית והפיזור של הרקמה. למעשה, הבליעה האופטית היא דומיננטית ובשל כך תמונות PA מתוארות לעתים קרובות כ”מבוססות בליעה”. עם זאת, חשוב להכיר בכך כי אין פירוש הדבר כי הקונטרסט הוא פרופורציונאלי באופן ישיר למקדם הבליעה μa. כפי שמראה משוואה (2.2), p0 הוא פרופורציונאלי לתוצר של μa והזרימה φ שבעצמה תלויה ב- μa, כך ש- p0 הוא פונקציה לא-ליניארית של μa. הבחנה זו חשובה ביותר כאשר שוקלים את היכולת הספקטרוסקופית של השיטה, כמתואר ב- §5.1.

הדומיננטיות של הבליעה האופטית כמקור העיקרי של קונטרסט דימות ה- PA מאפשרת שימוש בדימות PA להמחשה של תכונות אנטומיות המכילים שפע של כרומופורים כמו המוגלובין, ליפידים ומים. מתוכם, המוגלובין הוא החשוב ביותר עבור אורכי גל של פחות מ- 1000 nm. כפי שניתן לראות באיור 1, בין 650-900 nm מקדמי הבליעה של מצבי האוקסיגנציה והדאוקסיגנציה של ההמוגלובין בריכוזים ריאליסטיים מבחינה פיזיולוגית הם לפחות סדר גודל אחד גבוה יותר מאשר הכרומופורים העיקריים האחרים, כמו מים,ליפידים ואלסטין, הנוכחים ברקמות חיבור, כלי דם ושאר מרכיבים של האיברים. באורכי גל קצרים יותר הנמשכים לתוך החלק הנראה של הספקטרום, בליעת ההמוגלובין היא גבוהה אף יותר ויכולה לעלות על זו של כרומופורים אחרים ביותר משני סדרי גודל. הבליעה המועדפת החזקה של המוגלובין המאפשרת את הוויזואליזציה של כלי הדם בקונטרסט גבוה בדימות PA. בנוסף, ניתן לנצל את ההבדלים בספקטרום הבליעה של HbO2 ו- HHb המוצגים באיור 1 בכדי למדוד את האוקסיגנציה של הדם על ידי יצירת תמונות באורכי גל שונים ויישום של ניתוח ספקטרוסקופי כפי שמתואר ב- §5.1. באופן זה, הקונטרסט מבוסס-הבליעה של דימות PA מאפשר יצירה של תמונות פונקציונאליות ומבניות של כלי הדם.

למרות שלמלנין יש מקדם בליעה גבוה יותר משל דם, הוא נוטה להיות ממוקד באזורים שונים כמו העור או הרשתית, מאשר כמרכיב עיקרי במרבית הרקמות. לפיכך, הוא אינו דומיננטי בדימות PA באותה מידה כמו המוגלובין. אף על פי כן, הוא מהווה מקור חשוב של קונטרסט עבור ויזואליזציה של מבנים עשירים במלנין כמו לזיות בעלות פיגמנטציה בעור ואפיתל פיגמנט הרשתית (RPE). הבליעה על ידי ליפידים היא נמוכה יותר באופן מובהק מזו של המוגלובין בטווח הנראה ובטווח ה- NIR עד בערך 1100 nm כאשר הדומיננטיות של הבליעה בדם היא של מים להבדיל מהמוגלובין, ושיא הבליעה החזק של ליפידים ב- 1210 nm הופך לדומיננטי. שיא זה יכול לשמש בכדי לדמות מאגרי ליפידים מקומיים כמו אלו הנמצאים בפלאקים אטרוסקלרוטיים.

כרומופורים כמו המוגלובין ומלנין בולעים באופן חזק יותר מאשר כרומופורים אחרים ברקמות וכך מספקים מקור בולט לקונטרסט. עם זאת, הכרומופורים בעלי הבליעה החלשה יותר כמו מים וליפידים, שייתכן ולא יהיו נראים באופן בולט בתמונת PA , עדיין ניתנים לזיהוי על ידי ניצול החתימות הספקטראליות האופייניות שלהם. תהליך זה מערב שימוש בהיפוך ספקטרוסקופי או טכניקות פירוק עירובים (unmixing) המיושמות על תמונות הנרכשות באורכי גל שונים – באופן דומה לכך שניתן למדוד חמצן בדם על ידי שימוש בהבדלים הספקטראליים הידועים בין HHb ל- HbO2. כך לדוגמא, למרות שמקדם הבליעה של מים בריכוזים פיזיולוגיים ברקמות הוא קטן יותר באופן מובהק מזה של המוגלובין על פני רוב טווח אורך הגל הנראה ו- NIR, עדיין ניתן לזהות אותו באמצעות רכישת תמונות בטווח של אורכי גל סביב שיא הבליעה שלו ב- 975 nm ויישום של היפוך ספקטרוסקופי. ניתן לנצל את השיאים החלשים יותר של בליעת הליפידים ב- 920, 970 ו- 1040 nm בכדי ליצור קונטרסט מבוסס-ליפידים.

לצד קונטרסט אנדוגני, מגוון של סוכני קונטרסט ממוקדים הבולעים בטווח הנראה וב- NIR יכולים לספק מקורות נוספים של קונטרסט PA סלקטיבי מרחבית ולשמש לדימות רצפטורים ספציפיים-למחלות. אלו כוללים צבע אורגני כמו ירוק אינודקיאנין (ICG) וכחול מתילן בהם ניתן להשתמש באופן קליני תחת נסיבות מסוימות, או ננו-מבנים כמו ננו-מוטות או ננו-שלים מטאליים המוגבלים כיום לשימוש פרה-קליני. כאשר הם ממוקדים כהלכה, סוכנים אלו יכולים להיקשר לרצפטור תאי או תוך-תאי ספציפי-למחלה כאשר החתימה הספקטראלית של הצבע/ננו-מבנה משמשים כמקור לקונטרסט בדימות ה- PA. ננו-חלקיקים של גיאומטריות שונות, בפרט, מהווים מוקד לעניין רב מפני שחתכי הרוחב של בליעת התהודה הפלסמונית שלהם יכולים להיות מספר סדרי גודל גבוהים יותר מאשר מולקולות צבע. בנוסף, על ידי התאמת הפרמטרים הגיאומטריים שלהם, אורכי הגל של שיא הבליעה שלהם ניתנים לכוונון לאורכי גל NIR היכן שהחדירה לרקמות היא הגדולה ביותר.

image12 31

איור 1: ספקטרום מקדמי הבליעה של כרומופורים אנדוגניים ברקמות. אוקסיהמוגלובין (HbO2), קו אדום, 150 gl-1; דאוקסיהמוגלובין (HHB), קו כחול, 150 gl-1; מים, קו שחור (80% נפח ברקמות); ליפיד, קו חום (20% נפח ברקמות); ליפיד, קו ורוד; מלנין, קו שחור מקווקו (μa תואם את זה שבעור). הספקטרום של קולגן (קו ירוק) ואלסטין (קו צהוב) לפי [24].

3. עומק חדירה ורזולוציה מרחבית

3.1. עומק החדירה

עומק החדירה מוגבל על ידי החלשות אופטיות ואקוסטיות. באופן כללי, עבור רוב הרקמות הרכות, למרות שההחלשה האקוסטית היא מובהקת, ההחלשה האופטית היא הדומיננטית. החלשה אופטית תלויה גם במקדמי הבליעה וגם במקדמי הפיזור, וכפי שניתן ללמוד מאיור 1, היא תלויה באופן ברור באורך הגל.

במדיה מפזרת-אופטיקה כמו רקמות, עומק החדירה האופטית מאופיין בצורה הטובה ביותר על ידי מקדם ההחלשה האפקטיבי μeff הנגזר מתיאוריית הדיפוזיה כאשר image6 76ו- μa ו- image4 114הם מקדמי הבליעה והפיזור המופחת, בהתאמה. במדיה של פיזור הומוגני, ברגע שהוא מגיע לעומק של יותר ממספר מעברי מהלכים חופשיים ממוצעים (1 mm בקירוב), האור עובר דיפוזיה ועוצמת ההקרנה פוחתת באופן אקספוננציאלי עם העומק, עם μeff כקבוע אקספוננציאלי. לפיכך, 1/μeff הוא העומק שבו עוצמת הקרינה פחתה ב- 1/e ונקבע כעומק החדירה. באורך גל עירור של 700 nm הנמצא בתחום הספקטראלי (600-900 nm) שבו הרקמה היא השקופה ביותר, ויישום של ערכים ריאליסטיים מבחינה פיזיולוגית של μs (1.6 mm-1) וריכוזים של HbO2 ו- HHb (1% בנפח והנחה של 95% sO2), מים (74% בנפח) וליפידים (25% בנפח) מוביל לערך של μeff ~ 0.13 mm-1. עומק החדירה האופטית של 1/e הוא לפיכך 8 mm בקירוב. פירוש הדבר כי ברגע שעוברים את המילימטר הראשון ברקמה, האור מוחלש פי 4 בקירוב עבור כל סנטימטר נוסף של חדירה. אם נניח ערך של 0.75 dB cm-1 MHz-1 עבור החלשה אקוסטית של גל מישורי בתדירות של 10 MHz, ההחלשה הכוללת הנגרמת מהחלשה אקוסטית והחלשה אופטית היא לפיכך לפחות סדר גודל אחד לכל סנטימטר. תוצאה זו מייצגת את אחד האתגרים המשמעותיים של דימות PA, מכיוון שחדירה של מספר סנטימטרים ברקמה מובילה להחלשת אות של מספר סדרי גודל, ובכך נדרש גילוי של אותות אולטראסאונד חלשים ביותר. למרות זאת, באמצעות בחירה קפדנית של אורכי גל, אופטימיזציה של שידור האור, פרמטרים של תכנון המתמר ועיבוד אותות, הוכח כי ניתן להשיג עומקי חדירה של מספר סנטימטרים. עומק חדירה של 4 cm הושג in vivo בשד באמצעות אורך גל עירור של 800 nm. מחקרים אחרים שהשתמשו ברקמות-דמה ורקמות ex vivo הראו כי ניתן להגיע לעומקי חדירה של 5-6 cm באמצעות סוכני קונטרסט. בנוגע לאורך הגל האופטימאלי, נטען כי אורכי גל גדולים יותר, כמו 1064 nm, שבהם בליעת הדם היא נמוכה, יכולים להוות יתרון עבור עומק החדירה כאשר משתמשים בסוכני קונטרסט הבולעים באורך גל זה.

3.2. רזולוציה מרחבית

בדומה ל- US פולס-הד, הרזולוציה המרחבית תלויה בסופו של דבר בתוכן התדירות של הגל האקוסטי המגיע לגלאי. בדימות PA, פולסי לייזר עירור של ננו-שנייה משמשים לעתים קרובות, ויכולים להוביל לגלים אקוסטיים בפס רחב עם תוכן תדרים המגיע לעשרות ואפילו מאות מגה-הרץ, תלוי במידת האורך של הבולעים האופטיים. תחת תנאים אלו, רוחב הפס של אות ה- PA ולפיכך הרזולוציה המרחבית, אינם מוגבלים על ידי תהליך ההתחוללות עצמו. במקום זאת, הגבלת הפס של הפרופורציה של גל ה- PA הנגרמת מההחלשה האקוסטית תלוית-התדירות המתרחשת ברקמות הרכות היא זו הגורמת להגבלת תוכן התדרים המקסימאלי של גל ה- PA ולפיכך מגדירה את גבול הרזולוציה המרחבית הסופי אותו ניתן להשיג. תחת נסיבות אלו, הרזולוציה המרחבית עוברת סילום עם העומק. ההחלשה האקוסטית תלויה באופן משמעותי בסוג הרקמות, אך כלל אצבע כללי הוא כי עבור עומק חדירה של סנטימטרים, רזולוציה מרחבית של תת-מילימטרים הינה אפשרית, הפוחתת לפחות מ- 100 μm בעומקי חדירה של מילימטרים ופחות מ- 10 μm רזולוציה מרחבית בעומק של כמה מאות מיקרומטר. למרות שהחלשה אקוסטית מגדירה את גבול הרזולוציה המרחבית הסופי, גורמים אחרים כמו רוחב הפס של הגלאי, גודל האלמנטים ואזור התיעוד של אותות ה- PA – האפרטורה של הגילוי – עשויים להוות גורמים מגבילים בפרקטיקה. מצב זה נכון במיוחד כאשר יוצרים דימות של מאפיינים שטחיים הנמצאים בעומק של מספר מילימטרים. רוחב הפס של אות ה- PA יכול לגדול לכמה עשרות מגה-הרץ, מצב המהווה אתגר משמעותי במונחים של עמידה בדרישות של רוחב פס הגילוי והדגימה המרחבית.

קיים יוצא דופן לגבול הרזולוציה המרחבית המוגדר אקוסטית אותו תיארנו מעלה. במצב מיקרוסקופיית רזולוציה מרחבית של דימות PA (OR-PAM) המתואר ב- §4.2.2, מיושמת אלומת לייזר עירור ממוקדת. בעומקי חדירה קטנים ביותר (פחות מ- 1 mm), לפני שהאלומה הממוקדת מתעוותת בגלל פיזור אופטי, הרזולוציה המרחבית הלטראלית מוגדרת על ידי קוטר אלומת הלייזר במיקוד. תחת נסיבות אלו, הרזולוציה הלטראלית מוגבלת על ידי דיפרקציה אופטית התלויה באורך הגל האופטי ובאפרטורה הנומרית (NA) של עדשת המיקוד והיא עשויה להיות בגודל של מספר מיקרומטרים בלבד. רזולוציה אנכית, אם כך, נותרת מוגבלת על ידי ההחלשה האקוסטית.

4. קונפיגורציות של דימות פוטו-אקוסטי

ניתן לחלק דימות פוטו-אקוסטי למספר קטגוריות: PAT, מיקרוסקופיית PA ווריאציות שונות שלה. במידה מסוימת, קטגוריות אלו הן כולן וריאציות של אותו רעיון והן תוצאה של כלי הדימות השונים שהתפתחו בשנים האחרונות, יותר מאשר הבדלים מתודולוגיים מהותיים.

image7 66

איור 2: גיאומטריות גילוי PAT. a) כדורית; b) גלילית; c) מישורית.

image8 60

איור 3: שחזור תמונת PAT בהקרנה אחורית עבור גיאומטריית גילוי מישורית. צורות גל PA מתועדות על ידי כל אלמנט במערך ב- r, עוברות רזולוציה מרחבית באמצעות מהירות קול c, ועוברות הקרנה אחורית על משטחים כדוריים של רדיוס R = ct לנפח התמונה. מכיוון שכמות ההקרנה האחורית היא פוטנציאל המהירות, הפלט של כל גלאי מוצג בתור צורת גל לחץ באינטגרציית-זמן למטרות המחשה – בפועל, הגלאים מתעדים צורת גל לחץ ואינטגרציית הזמן מתבצעת באופן חישובי.

4.1. טומוגרפיה פוטו-אקוסטית

ניתן להתייחס ל- PAT בתור מצב מסורתי של דימות PA, כפי שיושם על ידי אנשי המקצוע הראשונים בתחום. זוהי גם גישת דימות ה- PA הכללית והפחות מגבילה ביותר, עם מספר מועט של מגבלות על ביצועי התמונות הנגרמות על ידי ההטמעה הפרקטית שלה.

ב- PAT, מיושמת הארת שדה מלאה, שבה פולס אלומת לייזר בקוטר גדול מקרין את שטח הרקמה. באורכי גל NIR שבהם הרקמה היא שקופה יחסית, האור חודר לעומק ומתפזר באופן חזק, מה שמוביל לכך שנפח גדול יחסית של הרקמה הופך ל”טבול” באור דיפוזיה. בליעה של הקרינה הפוגעת על ידי הכרומופורים ברקמה מובילה לחימום אימפולסיבי של נפח הרקמה המוקרן ולאחר מכן התחוללות מהירה של גלים אולטראסוניים בפס רחב. אלו עוברים פרוגפציה לשטח הרקמה שם הם מתגלים על ידי רסיבר אולטראסאונד בסריקה ידנית או מערך של רסיברים. אותות האולטראסאונד בעלי שונות-זמן יכולים לאחר מכן, בעזרת מודעות למהירות הקול, לעבור רזולוציה מרחבית והקרנה אחורית בכדי לשחזר תמונה תלת-ממדית. איור 2 מציג 3 גיאומטריות גילוי נפוצות: כדורית, גלילית ומישורית. ברור כי הגיאומטריה הכדורית והגלילית דורשות גישה לכל הנקודות סביב המטרה ולפיכך מוגבלות ליישומים כמו דימות שד או בעלי חיים קטנים כמו עכברים. גיאומטריות גילוי מישוריות הן ורסטיליות יותר ומספקות גישה לטווח גדול יותר של מטרות אנטומיות, בעיקר כאלו הממוקמות באופן שטחי.

פותחו מספר שיטות לשחזור תמונת ה- PAT מהאותות המזוהים. מבחינה קונספטואלית, ניתן להתייחס לאמפליטודה בכל נקודה t בתיעוד הזמן של צורת הגל של ה- PA שתועדה בנקודה r כמייצגת של סכום כל הנקודות בהתפלגות הלחץ הראשונית po הממוקמות על משטח כדורי שמרכזו r ועם רדיוס הזהה לתוצר של מהירות הקול ו- t – כלומר, לומר כי התפלגות המקור של PA נחשבת ככזו המורכבת ממכלול של מקורות נקודה אקוסטית יסודיים שכל אחד מהם פולט גלים כדוריים. ניתן להחשיב את תהליך שחזור התמונה ככזה שבו כל אחת מצורות הגל המזוהות של PA עוברות רזולוציה מרחבית באמצעות מהירות הקול, בהקרנה אחורית על פני משטחים כדוריים שמרכזם r ומסוכמים על פני נפח התמונה – איור 3 מציג זאת בגיאומטריית גילוי מישורית. סוג זה של הקרנה אחורית אד-הוק פשוטה הינו דומה למיקוד קליטה DAS (delay-and-sum) או עיצוב אלומות, המיושמים בדימות US במערך מופע. למרות שהוא מספק תיאור פשוט ואינטואיטיבי של יצירת תמונות ב- PAT ושימש ביישומים מוקדמים, הוא אינו אופטימאלי במונחים של דיוק ומורכבות חישובית.

שיטות מתקדמות המאפשרות שחזור מדויק יותר ו/או יעילות חישובית רבה יותר התפתחו בשנים האחרונות, שרבות מהן מתוארות במאמר של קוצ’מנט וקניינסקי. ניתן לחלק שיטות אלו למספר קטגוריות, בהתחשב בסוג האלגוריתם המיושם. אלגוריתמים מסוג הקרנה אחורית מסוננת מערבים סינון לפני או אחרי שלב של הקרנה אחורית, ויכולים לאפשר שחזור מדויק עבור גיאומטריות גליליות, כדוריות או מישוריות. למרות האינטנסיביות החישובית, נמצאו יישומים פרקטיים לגיאומטריות גילוי כדוריות בדימות PAT שד ודימות של בעלי חיים קטנים. בעבר תוארו מספר שיטות מבוססות-סכום סדרה, כמו אלו המבוססות על הדה-קומפוזיציה הספקטראלית המרחבית והטמפוראלית של צורות הגל המזוהות ב- PA, ומיפוי לרכיבי תדירות מרחבית ב- p0. הן יכולות לספק שחזור מדויק בגיאומטריות כדוריות, גליליות ומישוריות, וגיאומטריות אחרות כמו קובייה. רק במקרה של גיאומטריות מישוריות או קובייתיות ניתן להשיג זמני חישוב מהירים מספיק עבור יישומים פרקטיים. במקרה המישורי הפרקטי יותר, ההטמעה מערבת התמרת פורייה של נתוני הלחץ תלויי-הזמן הנמדדים על השטח, למיפוי של התדירות הטמפוראלית לתדירות המרחבית הצירית והתמרת פורייה הפוכה בכדי לקבל את p0. תהליך זה מהווה יתרון מבחינה חישובית מכיוון שחלק גדול מהעיבוד מושג באמצעות התמרת פורייה מהירה ואינטרפולציית חלל-k פשוטה באמצעות יחס הדיספרסיה. יתרון זה והפשטות החישובית הובילו לשימוש נפוץ בפרקטיקה. שיטות היפוך-זמן מערבות פליטה חישובית מחודשת של צורות הגל הנמדדות של PA בכל נקודת גילוי בסדר טמפוראלי הפוך על ידי הרצה הפוכה של מודל פרופגציה אקוסטית נומרית. אלו האלגוריתמים הכי פחות מגבילים, המסתמכים על מספר קטן של הנחות וניתנים ליישום בכל גיאומטריית גילוי והתפלגות גלאי, ומסוגלים להסביר הטרוגניות אקוסטיות ידועות. בנוסף, ניתן להשתמש בהם למיתון של יחס אות-רעש (SNR) והשפעות התדרדרות הרזולוציה של הבליעה האקוסטית. למרות שדרישות הזיכרון הן צנועות, עבור שימוש פרקטי נדרש מודל פרופגציה אקוסטית נומרי מהיר מכיוון שחיוני לחשב את כל שדה הגל עבור כל שלב פרופגציה אחורית טמפוראלית. דרישה זו מגבילה את היישום הפרקטי, למרות שנערכו מחקרים שבדקו סכמת היפוך-זמן המשתמשת במודל יעיל של פרופגציית חלל-k פסאודו-ספקטראלית באמצעות נתונים ניסויים. שיטות היפוך מבוססות-מודל מיישמות מודל נומרי קדמי בכדי לדמות את אותות ה- PA המזוהים מאומדן ראשוני של p0 או כמות קשורה. לאחר מכן ניתן לקבל אומדן משופר עדכני על ידי התאמה איטרטיבית של p0 בכל נקודה מרחבית עד שהפער בין אותות ה- PA הצפויים והנמדדים מצומצם. על ידי יישום של שיטות היפוך מטריצה וטרום-חישוב עבור גיאומטריה ספציפית כפי שמתואר אצל רוזנטל ועמיתיו, שיטות אלו יכולות להיות מהירות, אך על חשבון הגמישות והעלות החישובית הגבוהה של שלב הטרום-חישוב.

בלתי נמנע כי יתקיימו מגבלות פרקטיות. שחזור מדויק בדרך כלל דורש הנחה של מספר אינסופי של גלאים דמויי-נקודה אומני-כיווניים המתפלגים על אפרטורת גילוי זוויתית מוצקה של 4 π sr עבור גיאומטריית גילוי גלילית או כדורית ו- 2π sr עבור גיאומטריה מישורית, כאשר זו מצביעה על גילוי על פני מישור אינסופי – תנאי אפרטורה אלו פירושם כי כל חזית הגל האקוסטי מתועדת, כך שמתקבלת מדידה מלאה של מערך נתונים כולל. רסיברי אולטראסאונד פיאזו-חשמליים  בעלי פס-רחב המסוגלים לספק רוחב פס מגה-הרץ דרוש הינם זמינים, אך עם מגבלות מסוימות. השגה של גדלי אלמנט קטנים אקוסטית בכדי לספק תגובה קרובה לאומני-כיוונית ואינטרוול דגימה מרחבית העונה על קריטריון נייקוויסט מרחבי (< λ/2) בתדירויות מגה-הרץ הינה מאתגרת יותר אך אפשרית, בהתחשב בגבול התדרים העליון. דרישות גילוי האפרטורה עשויות, עם זאת, להציג מגבלה בסיסית יותר. עבור גיאומטריות כדוריות ניתן באופן עקרוני לסגור באופן מלא את אזור המקור בכדי למלא את הדרישה של אפרטורה זוויתית מוצקה ב- 4π. עם זאת, עבור גיאומטריות גליליות ומישוריות, האפרטורה תמיד חסומה בפרקטיקה. עבור גיאומטריות גילוי מישוריות בפרט, המדידות תמיד מוגבלות לתחום סופי של המישור האינסופי אותו מניח אלגוריתם השחזור. כתוצאה מכך, מתועד רק חלק מחזית הגל, מה שמוביל לארטיפקטים בתמונות ורזולוציה מרחבית מופחתת – מה שמכונה בעיית הראות המוגבלת או סריקה חלקית. ארטיפקטים, עיוות תמונה או טשטוש יכולים להיגרם גם מהטרוגניות של מהירות הקול והחלשה אקוסטית, שאינן נשקלות במרבית שיטות השחזור. פותחו מספר שיטות המיועדות לפצות על הפרעות של מהירות הקול והחלשה אקוסטית, במטרה לשיפור איכות התמונה ברקמות בעלות הטרוגניות אקוסטית.

למרות שרוב שיטות השחזור מסתמכות על ההנחה של גילוי באמצעות רסיברים אומני-כיווניים דמויי-נקודה, קיימות שיטות המיישמות גלאי אזור-רחב מישוריים כיווניים בסריקה מכאנית או גלאי קו. במקרה הראשון, פלט רזולוציית הזמן של הגלאי מייצג סט של הקרנות זמן-מאוחר של p0, על פני מישורים המקבילים לגלאי במקום הקרנה של משטחים כדוריים אותה מייצג פלט של גלאי דמוי-נקודה. לאחר מכן ניתן לשחזר תמונה באמצעות היפוך התמרת ראדון, בדומה לזו המיושמת בטומוגרפיית X-ray ממוחשבת (CT).

4.1.1. מערכות דימות טומוגרפיה פוטו-אקוסטית

סורקים כדוריים

הודגמו מספר מכשירי סריקה תלת-ממדיים המיישמים גיאומטריית גילוי כדורית. כפי שציינו קודם, עבור יישומים כמו דימות שד או דימות של בעלי חיים קטנים המאפשרים ל- ROI להיתחם על ידי משטח הגילוי, גיאומטריה זו מאפשרת את איכות התמונה הפרקטית הגבוהה ביותר, תודות לאפרטורת הגילוי הזוויתית המוצקה הגדולה אותה ניתן להשיג.

איור 4 מציג תכנון של סורק כדורי המשמש לדימות PA של שד ובעלי חיים קטנים. המכשיר כולל אגן גילוי חצי-כדורי עם אפרטורה בתחתית בכדי לאפשר שידור של אור עירור הלייזר. 128 אלמנטים פיאזו-חשמליים בלתי-ממוקדים בקוטר 3 mm ב- 5 MHz מתפלגים בדפוס ספיראלה על פני השטח. האגן ממוקם על מוט בכדי לאפשר לו להסתובב באופן הדרגתי עם פולסי עירור עוקבים כך שניתן לקבל דגימות מרחביות מדויקות. אגן נוסף, בקוטר קטן יותר, שקוף אקוסטית ואופטית, עליו מניחים את השד, מורכב בתוך אגן הגילוי. שניהם מתמלאים במים בכדי לאפשר צימוד אקוסטי. מערך זה מאפשר סיבוב עצמאי של אגן הגילוי מבלי להזיז את השד. אור העירור, המגיע ממערכת לייזר הכוללת מתנד פרמטרי אופטי מתכוונן (OPO), בפליטה של 800 nm עם PRF של 10 Hz, מוכוון למעלה דרך האפרטורה בתחתית האגן. הושגה רזולוציה מרחבית קרובה-לאיזוטרופית של 250 μm בקירוב על פני שדה ראייה (FOV) של 6.4 x 6.4 x 5 cm . זמן רכישת התמונות שהושג ב- FOV זה תוך שימוש ב-240 שלבים זוויתיים לכל סיבוב מושלם היה 24 s. איור 4 מציג תמונות של הקרנה באינטנסיביות מקסימאלית (MIP) של כלי הדם של השד השמאלי, של מטופלת עם כלי דם תת-מילימטריים הנראים עד עומק של 4 cm. סרטי האנימציה התלת-ממדית התואמים ב- MIP הזמינים באינטרנט (סרטים S1 ו- S2 בנספח) ממחישים את מלוא ההיקף של האנטומיה המפורטת של כלי הדם הנוצרת באמצעות תמונות אלה. עומק החדירה in vivo שהושג במחקר זה מהווה הדגמה מוצלחת של יכולות דימות הרקמות העמוקות של PAT, בעיקר בהתחשב בכך שהזרימה האופטית שיושמה הייתה נמוכה ביותר מסדר גודל אחד מהחשיפה הבטוחה המקסימאלית המותרת (MPE) עבור העור.

ניתן להשיג בנוסף גיאומטריית גילוי כדורית על ידי סידור הגלאים בקשת, ולאחר מכן לסובב באופן צירי את המטרה הממוקמת בתוך החלל הפנימי בכדי לסנתז את הגילוי על פני משטח כדורי, כפי שמתואר על ידי קרוגר ועמיתיו. במחקר זה, הושגו תמונות ex vivo של עכבר. סורק בעלי חיים קטנים נוסף המיישם גישה דומה תואר על ידי ברכט ועמיתיו, ושימש לרכישה של תמונות כלל-גוף in vivo (איור 5). בסכמה זו, מערך הקשת כלל 64 מתמרים פיאזו-מרוכבים מרובעים (2 x 2 mm) עם תדירות מרכזית של 3.1 MHz המתפלגים על פני אפרטורה זוויתית דו-ממדית של 152o. כאשר האובייקט מסובב ב- 360o, התוצאה מתורגמת לאפרטורת גילוי זוויתית מוצקה של 10.6 sr הקרובה לאפרטורה האידיאלית של 4π sr הדרושה לשחזור מדויק. בעל החיים נטבל במים, עם מערך פעמון צלילה המאפשר העברה של גזים מאלחשים ונשימתיים הממוקם במרכז המערך כפי שמוצג באיור 5. סיבים הממוקמים באופן אורתוגונאלי למישור המערך ומוכוונים אל העכבר מספקים פולסי עירור של 755 nm הנוצרים על ידי לייזר אלכסנדרייט זרימת שטח פוגעת של 1 mJ cm-2. בכדי ליצור הדגשה מועדפת של גלי ה- PA הנפלטים על ידי התכונות האנטומיות של מידות אורך וגיאומטריות שונות, האותות הגולמיים בגילוי-RF עברו עיבוד עם משפחה של גלונים ומסננים אחרים לפני שחזור התמונה, כשזו מושגת באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורית כדורי. הרזולוציה המרחבית הייתה 0.5 mm וזמן הרכישה היה 8 min על בסיס 150 שלבים לכל סיבוב של בעל החיים, ועם ממוצע של מעל 32 פולסים של לייזר. איור 5 מציג תמונת נפח שהושגה על ידי המערכת, המראה כי ניתן ליצור ויזואליזציה של האיברים הפנימיים, כמו הטחול, הכבד והכליות. ניתן לראות את היתרונות של שילוב מידע מבני מוקדם ביצירת התמונה, במקרה זה באמצעות סינון הגלונים שהוזכר מעלה, בכדי להגדיל באופן סלקטיבי איברים, כלי דם ומבנים אנטומיים אחרים.

image18 21

איור 4: סורק PAT שד עם גיאומטריית גילוי חצי-כדורית. a) סכמה של המערכת. b) MIP של שד שמאל של המטופלת (הקרנה לטראלית), על FOV 64 x 50 mm2. החצים למעלה מציינים את כיוון אור עירור הפגיעה. החץ החלול מסמן את פוזיציה של כלי דם בעומק 40 mm. הבוקסה החלולה מייצגת 1 x 1 cm2. c) הקרנה אורתוגונאלית (מלפנים לאחור )64 x 64 mm2. אורך גל של לייזר העירור: 800 nm. ניתן לצפות באינטרנט בסרטי אנימציה MIP תלת-ממדיים של שתי ההקרנות, סרטים S1 ו- S2 בנספח.

image10 47

איור 5: סריקת PAT של כלל הגוף של בעלי חיים קטנים, על בסיס גיאומטריית גילוי כדורית. a) מערך ניסויי המציג מערך קשת של 64 אלמנטים והעברה בסיבים. b) תמונ תלת-ממדית של עכבר עירום המואר ב- 755 nm. ויזואליזציה של שתי הכליות, הטחול ואונה חלקית של הכבד. c) תמונה המציגה את אזור עמוד השדרה ואת שתי הכליות. ניתן לצפות בסרטים תלת-ממדיים של התמונות בנספח, סרטים S3-S5.

image9 52

איור 6: סריקת PAT גלילית לדימות מוח של בעלי חיים קטנים. a) מערך ניסוי. b) תמונה של כלי דם שטחיים קורטיקליים ולזיה שנגרמה מניתוח. MCA: עורק צרברלי מרכזי. RH: המיספרה צרברלית ימנית. LH: המיספרה צרברלית שמאלית. c) פני השטח הצרברלי לאחר חלוקת הגולגולת בעקבות רכישת דימות PAT. אורך גל לייזר: 532 nm.

סורקים גליליים

למרות שגיאומטריית גילוי גלילית דו-ממדית אמיתית משמשת לדימות תלת-ממדי בפרקטיקה רק באופן נדיר, המקבילה החד-ממדית שלה, תיעוד על פני מעגל או קשת בכדי לקבל תמונת חתך-רוחב דו-ממדית, מיושמת באופן נפוץ. הפופולאריות שלה נובעת מפשטות היישום והיכולת לרכוש תמונה איכותית עם ארטיפקטים מועטים – כתוצאה מהעובדה כי גילוי על פני אפרטורה זוויתית מלאה ב- 360o ניתן להשגה עבור מטרות תחומות. אם לא נדרש קצב פריימים גבוה, ניתן להטמיע אותו בזול בתור מערכת מעבדתית המיישמת רסיבר בודד בסריקה מכאנית ובמה מסתובבת עם מנוע stepper. למרות השכיחות שלה, שיטה זו וגיאומטריית גילוי כדורית מוגבלות ליישומים כמו דימות שד ודימות בעלי חיים קטנים.

איור 6 מציג סורק חד-ממדי גלילי פשוט עבור דימות חתכי-רוחב דו-ממדי. הוא כולל מתמר PZT בודד של 3.5 MHz הממוקד בכיוון העלייה בכדי להחליש אותות חוץ-מישוריים, הנסרק באופן מכאני מסביב למטרה, במקרה זה ראש העכבר. אור עירור הלייזר (532 nm) משודר על ציר הסיבוב בכדי להקרין את השטח באופן רוחבי. למרות שהחלשת האור ב- 532 nm ברקמות היא גבוהה למדי, כפי שניתן לראות באיור 6, כלי הדם הקורטיקליים השטחיים עדיין עוברים ויזואליזציה בקונטרסט גבוה. הרזולוציה המרחבית של המערכת נאמדה ב- 200 μm בקירוב. לאחר הדגמה ראשונית זו, נעשה שימוש נרחב במערכות מעבדתיות בעלות אלמנט בודד בסריקה מכאנית, בכדי לדמות אירועים אפילפטים, התפתחות גידולים, ושינויים צרברו-וסקולריים בעכברים ומפרקים פריפריים. בכדי לגבור על זמני רכישת התמונות הארוכים של מערכות אלו (דקות עד שעות), פותחו מספר סורקים גליליים מבוססי-מערך המספקים קצב פריימים בזמן-אמת של תמונות דו-ממדיות, המשמשים לחקר של המו-דינאמיקה צרברלית, דינאמיקה קרדיו-וסקולרית, ופרפוזיה של איברים בעכברים. אחת ממערכות אלו מיישמת מערך של 512 אלמנטים המסודר על פני אפרטורה של 360o. עם מולטיפלקס של 8:1, ניתן לקבל רכישה של כל האלמנטים ב- 1 s. מצב זה מאפשר דימות דינאמי של השטיפה של סוכן קונטרסט מערכתי כאשר הוא עובר פרפוזיה דרך כלי הדם הקורטיקליים השטחיים אצל העכבר. מערכת דומה המיישמת 64 אלמנטים על פני קשת של אפרטורה בת 180o שימשה לדימות כלל-הגוף של בעלי חיים קטנים. תמונות תלת-ממדיות הושגו על ידי תרגום צירי של המטרה בכיוון-z וחיבור של חתכי-הרוחב הדו-ממדיים שנרכשו בכל שלב צירי. מערכת זו שימשה לרכישת תמונות מבניות של אזורי הבטן, בית החזה והלב. קצב הפריימים הגבוה שלה (10 Hz) מאפשר ויזואליזציה בזמן-אמת של אירועים דינאמיים כמו תנועה של חדרי הלב ופרפוזיית כליות בתיווך-ICG. גישה נוספת יישמה מערך אולטראסאונד ליניארי מקובע של 128 אלמנטים ותושבת מטרה מסתובבת בכדי להטמיע סכמת גילוי גלילית דו-ממדית. מערכת זו שימשה בכדי להשיג תמונות PA ex vivo של פלג הגוף העליון של העכבר ותמונות PA ו- US של פאנטומים.

סורקים מישוריים

למרות שגיאומטריות גילוי גליליות וכדוריות יכולות לספק אפרטורה זוויתית גדולה הדרושה לשחזור תמונות מדויק, היישומיות שלהן מוגבלת בשל הצורך בגישה לכל הצדדים של המטרה. הן אינן מתאימות לדימות של מאפיינים שטחיים, כמו המערכת המיקרו-וסקולרית של העור, או אם מבנים אקוגניים חזקים כמו עצמות או הריאות ממוקמים לאורך נתיב הפרופגציה האקוסטית. נסיבות אלו דורשות גיאומטריה מישורית גמישה יותר, שבה הגילוי נערך על פני מישור סופי באמצעות מערך אולטראסאונד דו-ממדי או מערך חד-ממדי שבו הגילוי מתבצע על קו באמצעות מערך ליניארי. מכשירי דימות PA המיישמים גיאומטריה זו מתחילים להתחרות בסורקי US דיאגנוסטיים קונבנציונאליים, שבחלק מהמקרים כוללים גשוש מערך ידני המוצמד אקוסטית לעור אותו מזיזים בעת צפייה בתמונות בזמן-אמת. מגוון מכשירי דימות PA משתמשים בסורקים דיאגנוסטיים הזמינים בשוק, המותאמים כך שרכישת RF מופעלת על ידי לייזר העירור בכדי לגלות גלי PA לצד תהודת US. תמונות PA ו- US משותפות ניתנות לשחזור באמצעות חומרת עיצוב האלומות של הסורק או באמצעות שלב פוסט-עיבוד באמצעות אלגוריתם שחזור. לפיכך, הקונטרסט מבוסס-הבליעה הנוצר על ידי דימות ה- PA יכול לחשוף את המבנה ואת התפקוד של כלי הדם בזמן שתמונת ה- US מספקת מידע לגבי המורפולוגיה של הרקמה הסובבת על בסיס התכונות האלסטו-מכאניות שלה. באופן זה, הקונטרסט השונה אך משלים הנוצר מכל מודאליות יכול לשמש באופן משולב בכדי לספק מידע דיאגנוסטי נוסף.

למרות הגמישות הרבה, במיוחד בשימושים קליניים, איכות התמונה הנוצרת מגיאומטריית גילוי מישורית בדרך כלל אינה משתווה לאיכות התמונה הנוצרת מגיאומטריית גילוי כדורית או גלילית, בשל האפרטורה המוגבלת. לצד ארטיפקטים ועיוותים, מצב זה מפחית בנוסף את הרזולוציה המרחבית הלטראלית – הראות המוגבלת, ולא ההחלשה האקוסטית תלוית-התדירות, נוטה להגביל את הרזולוציה הלטראלית. רזולוציה אנכית, לעומת זאת, אינה תלויה באפרטורת הגילוי והיא מוגבלת על ידי ההחלשה האקוסטית. מצב זה מוביל לפער בין הרזולוציה הלטראלית והאנכית הגורם לפונקצית פיזור אניסוטרופית של הנקודה המרחבית, המהווה בעצמה מקור לעיוותים. השידור של אור עירור הלייזר עשוי להיות בעייתי גם הוא, אם מיושם מערך של רסיברים במקום רסיבר סריקה מכאנית בודד. הפתרון המקובל הוא לקזז אנכית את המערך משטח הרקמה, למלא את החלל עם couplant אקוסטי שקוף-אופטית ולשדר את אור הלייזר אלכסונית לשטח הרקמה מתחת למערך, כפי שניתן לראות באיור 7a. ניתן להשיג זאת באמצעות מערך ליניארי עבור דימות דו-ממדי, מכיוון שניתן לשדר את אלומות לייזר העירור באופן אורתוגונאלי לציר האורך של המערך וכך הן “מנקות” רק את הרוחב של האלמנטים של המתמר. עם זאת, הדרישה לספייסר מגבילה את הממדים של המערך הדו-ממדי בו ניתן להשתמש – ככל שהאזור גדול יותר, כך יש צורך בספייסר עבה יותר אשר בתורו מפחית את אפרטורת הגילוי האפקטיבית ואת איכות התמונה.

image15 22

איור 7: שימוש בגשוש דימות אוטלראסאונד קונבנציונאלי לדימות PA. a) גשוש מערך דו-ממדי. b) הטמעה באמצעות גשוש מערך ליניארי לדימות מצב-כפול PAT-US המתואר אצל קים ועמיתיו.

איור 7b מציג יישום ספציפי שבו גשוש מערך דיאגנוסטי ליניארי זמין מסחרית וזוג צרורות סיבים משולבים בכדי ליצור ראש דימות US-PA ידני בעל מצב-כפול. מערכת זו מספקת תמונות PA ו- US דו-ממדיות משותפות בקצב פריימים בזמן-אמת (10 fps) ומיועדת ליישום של דימות רקמות עמוקות: גילוי בלוטות לימפה סנטינליות בשד. סכמות דומות הודגמו עבור ויזואליזציה של אנטומיה שטחית של כלי הדם, כולל סכמה המיישמת מערך ליניארי של 64 אלמנטים ב- 7.5 MHz המספק בנוסף קצב פריימים מוגבל-PRF בזמן-אמת בלייזר (7.5 fps). איור 8 מציג תמונת PA ו- US של מערכת זו, המראה את כלי הדם בעומק של 10 mm בקירוב ברגל. פרונהייזר ועמיתיו מתארים שימוש במערכת PA-US כפולה המיישמת גשוש מערך ליניארי של 128 אלמנטים מסורק אולטראסאונד מסחרי בכדי לדמות את כלי הדם בזרוע בזמן-אמת לשם זיהוי של כלי דם לפני המודיאליזה. מערך מופע של 1.75 D הכולל 1280 אלמנטים יושם גם הוא בכדי לספק תמונות PA ו- US תלת-ממדיות משותפות. סורק אולטראסאונד Visualsonics של בעלי חיים קטנים עבר אדפטציה בכדי לספק יכולת דימות PA-US במצב-כפול במכשיר הקיים בימים אלו בשוק.

image11 35

איור 8: משמאל, תמונות PAT in vivo, מימין תמונות US תואמות של וריד בחלק הפנימי של מרכז הרגל התחתונה שהושגו באמצעות מערך אולטראסאונד ליניארי. אזור התמונה הוא 2.6 x 2 cm (טיקים בכל סנטימטר). a) תמונת חתך-רוחב מהחלק הפנימי של הרגל. בתמונת ה- PAT משמאל, העור (S) נראה כקו שחור. חצים שחורים ולבנים מצביעים על המיקום של כלי דם משותפים המזוהים בתמונות PAT ותמונות US. b) תמונות שנרכשו באותו מיקום אך במישור האורתוגונאלי. אורך גל לייזר: 760 nm.

השימוש בסורקי אולטראסאונד קיימים מסחרית מהווה אמצעי זול ונוח להטמעת דימות PA, המנצל את ההתקדמות בטכנולוגיית המערכים הפיאזו-חשמליים, חומרת עיצוב אלומות ואלקטרוניקת רכישת RF שהתרחשה בשני האחרונות בדימות אולטראסאונד דיאגנוסטי. עם זאת, איכות תמונת ה- PA הנוצרת במערכות אלו נוטה להיות מוגבלת למדי, במיוחד עבור דימות שטחי. מצב זה הינו תוצאה של אפרטורת הגילוי המוגבלת המסופקת על ידי מערכות ליניאריות מבוססות-מערך. מצב זה נובע בנוסף מכך שהמתמרים המשמשים בסורקי US קליניים בדרך כלל פועלים בטווח תת- 10 MHz, והם רזוננטיים במידה מסוימת. לפיכך, לעתים קרובות הם אינם בעלי פס-רחב מספק לגילוי של גלי PA הנוצרים ממבנים שטחיים, שתוכן התדרים שלהם יכול להתפרש ממגה-הרץ נמוכים לעשרות מגה-הרץ. בכדי לפתור זאת, פותחה מערכת מותאמת הכוללת מערך ליניארי 48 אלמנטים בתדירות-גבוהה שנוצר מאלמנטים פיאזו-מרוכבים 2-2 עם תדירות מרכזית של 30 MHz ורוחב-פס פרקציונאלי 70% עבור דימות PA. בדומה למערכים ליניאריים אחרים המשמשים לדימות PA, היא מספקת קצב פריימים B-scan דו-ממדי בזמן-אמת, במקרה זה 50 fps. באמצעות סריקה מכאנית מהירה, דווח קצב פריימים וולומטרי של 1 fps עבור 166 B-scans והמערכת שימשה בכדי לדמות את כלי הדם התת-עוריים אצל בני אדם ועכברים.

גישה שונה, המבוססת על גישה אופטית של גילוי אולטראסאונד, נחקרה בכדי להתגבר על המגבלות של גילוי מבוסס-פיאזו-חשמל עבור גיאומטריות מישוריות. היא מיישמת פילם פולימר אטלון Fabry-Perot שקוף (FP) הכולל ספייסר פילם פולימר הממוקם בין זוג מראות. שינויים אקוסטיים בעובי האופטי של הספייסר מאפננים את הרפלקטיביות של האטלון אותה ניתן לזהות על ידי מדידה של השינויים בעוצמה המוחזרת של אלומת אור פוגעת. על ידי סריקת רסטר של אלומת לייזר ממוקדת על פני שטח החיישן, ניתן למפות מרחבית חזית גל PA פוגעת ב- 2D (איור 9a). לקונספט זה יש מספר יתרונות. ראשית, ניתן לתכנן את המראות של האטלון כך שיהיו שקופות לאורך הגל של לייזר העירור. לפיכך ניתן למקם את ראש החיישן באופן ישיר על שטח העור, והפולסים של הלייזר משודרים דרכו לרקמה. באופן זה ניתן לעקוף את מגבלות אפרטורת הגילוי הנגרמות מספייסר אקוסטי הדרוש עבור שיטות גילוי פיאז-חשמליות. בנוסף, הוא מספק תגובת פס-רחב מ- DC לכמה עשרות מגה-הרץ ודגימה מרחבית מדויקת של השדה האקוסטי הפוגע. גודל האלמנט האקוסטי האפקטיבי נקבע, עבור אומדן ראשוני, על ידי הממדים מוגבלי הדיפרקציה של אלומת הלייזר הממוקדת המשמשת לחקירה. גודל האלמנטים התיאורטי והמרווח התוך-אלמנטי יכולים לפיכך להיות בסדר גודל של עשרות מיקרומטרים. חשוב מכל, גודל האלמנטים המזערי מושג עם רגישות גילוי גבוהה יותר באופן משמעותי, אותה ניתן להשיג באמצעות רסיברים פיאזו-חשמליים בעלי פס-רחב דומה, באותם ממדים של האלמנטים. השילוב של ראש חיישן שקוף ותכונות אקוסטיות של ביצועי פס-רחב הופך את סוג חיישן זה למתאים במיוחד לדימות של מאפיינים שטחיים הממוקמים בעומק מספר מילימטרים משטח הרקמה. בנסיבות אלו, מרחקי הפרופגציה האקוסטית הקצרים מובילים לכך שאות ה- PA מוגבל באופן חלש על ידי הפס בהחלשה האקוסטית, ולפיכך יכול להתאפיין בפס רחב במיוחד עם תוכן תדרים המגיע לעשרות מגה-הרץ. הדרישה לגלאי נקודה אומני-כיווני בעל פס-רחב עבור שחזור תמונה מדויק הופכת לפיכך למאתגרת במיוחד כאשר משתמשים בגילוי פיאזו-חשמלי קונבנציונאלי, מכיוון שהיא דורשת ממדי אלמנטים של כמה עשרות מיקרומטר. הייצור של אלמנטים פיאזו-חשמליים בגודל כזה עם רגישות גילוי מספקת הינו בעייתי מכיוון שהרגישות שלהם עוברת סילום עם האזור האקטיבי. בניגוד לכך, רגישות החיישן FP ככל הנראה אינה תלויה בגודל האלמנטים.

איור 9a מציג סכמה של המערכת לצד מספר איורים של מערך הנתונים התלת-ממדי, שהתקבל על ידי סריקה של כף יד. לחיישן ששימש להדגמה זו היה שיא של לחץ-שווה-רעש (NEP) של 0.2 kPa (על פני רוחב-פס מדידה של 20 MHz) ורוחב-פס גילוי של -3 dB מ- 100 kHz ל- 22 MHz. גודל הנקודה של אלומת האור ששימשה לחקירה היה 64 μm ,אינטרוול הדגימה המרחבית היה 250 μm וה- FOV היה 20 mm. לא נעשה שימוש במיצוע אותות. אורך גל העירור היה 670 nm וזרימת הפגיעה על שטח העור הייתה 10 mJ cm-2, ולפיכך מתחת ל- MPE של 20 mJ cm-2 עבור עור באורך גל זה. איור 9b מציג MIP לטראלי וחתך אנכי בודד במרכז ה- MIP. חתך אנכי זה מראה את המתאר של שטח העור לצד מספר כלי דם תת-עוריים. איור 9c מציג ייצוג נפח של התמונה המשוחזרת וסדרה של חתכים לטראליים בעומקים שונים. תמונות אלה מראות את כלי הדם התת-עוריים בעומק של 4 mm בקירוב- כלי הדם העמוק ביותר מסומן על ידי החץ A בתמונת הנפח ובחתך הלטראלי העמוק ביותר. הזמן הנדרש בכדי לרכוש את נתוני תמונת התלת-ממד המוצגת באיור 9 היה בערך 10 min, והוגבל על ידי האופי הסדרתי של הגילוי וה- PRF הנמוך של לייזר העירור (10 Hz). קיים לעומת זאת פוטנציאל להגביר את מהירות הרכישה, עם אפשרות להשיג קצב רכישה תלת-ממדי בזמן-אמת, באמצעות מערכות לייזר בעלות קצב חזרה גבוה יותר או הקבלה של סכמת הקריאה של החיישן באמצעות הארת שדה-מלא ומערך פוטו-גלאים כפי שתואר על ידי למונט ובירד. לצד דימות של כלי הדם בעור, המערכת שימשה לדימות של כלי דם בגידולים, מוחות של עכברים, ועוברים.

image20 21

איור 9: a) סכמה של סורק פוטו-אקוסטי מבוסס-FP המשמש לרכישה של תמונה תלת-ממדית של כלי הדם בכף היד. b) תמונת MIP לטראלית (למעלה) ותמונת חתך אנכי (x-y) (למטה) שנלקחה לאורך הקו הצהוב המקווקו האופקי ב- MIP. חצים אפורים מצביעים על המתאר של שטח העור. c) משמאל: תמונה של אזור הדימות, אמצע: תמונת נפח. סרט S6 בנספח מציג המחשה של תמונה זו באנימציה. מימין: חתכים רוחביים בעומקים שונים. החץ A מצביע על כלי הדם הנראה העמוק ביותר, 4 mm מתחת לשטח העור. אורך גל של לייזר העירור: 670 nm.

4.2. מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית

מיקרוסקופיית PA מתייחסת לטכניקות שבהן תמונת PA מושגת באמצעות סריקה מכאנית של גלאי אולטראסאונד ממוקד או אלומת אור ממוקדת. לאחר מכן התמונה נוצרת ישירות מסט של קווי-A, ללא צורך באלגוריתם שחזור כמו ב- PAT. אם נעשה שימוש בגלאי אולטראסאונד ממוקד, תהליך זה נקרא מיקרוסקופיית PA ברזולוציה אקוסטית (AR-PAM) מכיוון שהרזולוציה המרחבית הצירית והלטראלית מוגדרת על ידי הפיזיקה של הפרופגציה והגילוי של האולטראסאונד. אם נעשה שימוש באלומת לייזר ממוקדת, תהליך זה נקרא OR-PAM, מכיוון שהרזולוציה המרחבית במישור אחד לפחות (בדרך כלל הלטראלי) מוגדרת על ידי המאפיינים המרחביים של אלומת לייזר ממוקדת העוברת פרופגציה ברקמה. למרות שמה, מיקרוסקופיית PA, בשונה מהמקבילה האופטית שלה, אינה בהכרח מצביעה על צפייה באנטומיה במידת אורך קטנה – ה- AR-PAM, לדוגמא, יכול לשמש לדימות בעומק של מספר סנטימטרים.

4.2.1. מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אקוסטית

המונח AR-PAM בדרך כלל משמש לתאר שימושים המיישמים מתמר ממוקד בודד מכאני או מסתובב בכדי למפות את אותות ה- PA. איור 10 מציג את אחת הגישות הנפוצות. שיטה זו כוללת רסיבר ממוקד שסביבו משודר אור העירור, בדרך כלל באמצעות עדשה קונית המפיקה חרוט חלול של אור בעל מיקוד חלש שבתוכו ממוקם המתמר. המיקוד האופטי אינו נדרש מכיוון שהוא אינו עוזר ללוקאליזציה של האות ולפיכך אינו משפיע על הרזולוציה המרחבית. הארת שדה-מלא יכולה גם היא להיות מיושמת במידה זהה ל- PAT אך הגבלת אלומת העירור באמצעות מיקוד חלש מפחיתה את דרישות אנרגיית הלייזר. היא מפחיתה בנוסף את אות ה- PA הגדול המתחולל על פני השטח. מצב זה יכול להסתיר אותות מאוחרים הנובעים מצלצול אם נעשה שימוש במתמר רזוננטי כמו זה המיוצר מ- PZT. בכדי לקבל תמונת 3D, המתמר ואלומת העירור נסרקים יחד מכאנית על פני משטח מישורי, וגורמים להתחוללות וזיהוי של גלי PA בכל שלב של הסריקה. הרצף הדו-ממדי של אותות אקוסטיים מזוהים או קווי-A הנוצר בעקבות זאת, שכל אחד מהם מייצג פרופיל עומק אנרגיה נבלעת, עובר תיקון, גילוי מעטפת, רזולוציה מרחבית ומיפוי לגוני אפור בכדי ליצור תמונה תלת-ממדית באופן ישיר. בשונה מ- PAT, אין שימוש באלגוריתם שחזור מפורש, אם כי מדובר בהבדל הנוגע יותר ליישום מאשר לעיקרון פיזי – אם שחזור התמונות ב- PAT נחשב כעיצוב אלומה קולטת נקודה-לנקודה in silico, נובע מכך כי הרסיבר הממוקד עצמו מבצע פונקציה זו עבור כל פוזיציית סריקה x-y. איור 10 מציג תמונה של כלי הדם בעור באזור אמת היד שהושגה באמצעות AR-PAM הממחישה את כלי הדם בעור ובתת-עור. המערכת שימשה בנוסף לדימות של לזיה פיגמנטית שפירה בכדי להדגים את הפוטנציאל לזיהוי מלנומה באמצעות מורפולוגיה וקומפוזיציה. תדירות המתמר הייתה 50 MHz, רוחב הפס הפרקציונאלי 70%, האפרטורה 5.8 mm, עומק המיקוד 0.3 mm ואורך המיקוד 6.7 mm, מה שמוביל לרזולוציה לטראלית במיקוד של 45 μm ורזולוציה אנכית של 15 μm. עבור FOV של 8 x 8 mm וגודל שלב של 20 μm, זמן הרכישה היה 5 min בקירוב. מערכות AR-PAM דומות בעלות רזולוציה גבוהה שימשו במחקרים פרה-קליניים על מוחות עכברים והמערכת המיקרו-וסקולרית של העור. מידת האורך של AR-PAM ניתנת לסילום. על ידי הפחתה של רוחב הפס של המתמר והגברת אורך המיקוד, ניתן ליצור ויזואליזציה של איברים בעומק מספר סנטימטרים אצל עכברים, אם כי עם רזולוציה מרחבית מופחתת של כמה מאות מיקרומטרים.

כפי שניתן לראות באיורים 4-6, 9 ו- 10 גם AR-PAM וגם PAT יכולים לספק תמונות איכותיות על פני טווח של סקאלות מרחביות. עם זאת, קיימים הבדלים משמעותיים ביניהן במונחים של ביצועים, עלות ומורכבות. אחד ההבדלים החשובים נוגע לגורמים המשפיעים על הרזולוציה המרחבית על פני FOV. עבור גיאומטריית גילוי מישורית, הרזולוציה המרחבית הלטראלית של PAT בנקודה ספציפית בנפח המואר מוגדרת בסופו של דבר על ידי החלשה אקוסטית תלוית-תדירות והזווית המרחבית הנוצרת על ידי אפרטורת הגילוי לנקודה זו. לפיכך בכל הנקודות ב- FOV התלת-ממדי, הרזולוציה הלטראלית מוגבלת על ידי הדיפרקציה האקוסטית המייצגת את גבול הרזולוציה הבסיסי. עם זאת, ב- AR-PAM, מצב זה נכון רק בעומק התואם את המיקום של מיקוד המתמר. במקום אחר, הרזולוציה הלטראלית מתדרדרת במהירות. בכדי לקבל רזולוציה מוגבלת-דיפרקציה אקוסטית אמיתית על פני כל ה- FOV התלת-ממדי נדרשת סריקה מכאנית צירית ולטראלית המובילה להארכת זמן הרכישה. ניתן לתקן בעיה זו במידה מסוימת על ידי שימוש במיקוד אפרטורה סינתטי. אפשרות נוספת שנבדקה היא שימוש ברסיבר axicon. על סמך התיאוריה של אלומות בסל אקוסטיות ללא-דיפרקציה, תהליך זה יכול בעיקרון לספק מיקוד קליטה לא-מתבדר שיכול פוטנציאלית לבטל את הצורך בסריקת עומק.

הבדל נוסף בין PAT ל- AR-PAM קשור למורכבות והעלות של ההטמעה. דרישות עוצמת הלייזר של AR-PAM הן צנועות יותר מאלו של PAT. ב- PAT, כל ה- FOV התלת-ממדי חייב לעבור הקרנה בעוד שב- AR-PAM רק האזור התואם את פרופילי אלומת הקליטה של המתמר דורש הארה עבור כל פוזיציית סריקה. על ידי תחימת התפלגות האור הפנימית לאזור זה באמצעות מיקוד חלש, ניתן להשתמש באנרגיית פולס לייזר נמוכה יותר בסדר גודל אחד מזו הדרושה ל- PAT. מצב זה מאפשר שימוש במגוון רחב יותר של מקורות לייזר, בעיקר כאלו המאפשרים PRFs גבוהים יותר ופלט מתכוונן. ניתן בנוסף להטמיע את AR-PAM באופן ישיר וזול בתור מכשיר מחקר מבוסס-מעבדה באמצעות רסיבר סריקה ידנית בודד. עם זאת, קיים היקף קטן בכדי להקביל את הגילוי באמצעות מערך על מנת להתגבר על המגבלות של מהירות הרכישה, הנגרמות בשל הסריקה הידנית. גילוי PAT, לעומת זאת, ניתן להקביל במהירות, אם כי ביוקר, באמצעות מערך של רסיברים, ובאופן עקרוני, לספק רכישת תמונות תלת-ממדיות בזמן-אמת. עבור דימות שטחי ברזולוציה גבוהה בעומקים של מספר מילימטרים, ל- AR-PAM יש יתרון בכך שהיא אינה דורשת רסיברים אקוסטיים קטנים בסקאלה של עשרות מיקרומטרים. כפי שתואר ב- §4.1.1, קשה לייצר רסיברים אלו עם רגישות גילוי מספקת תוך שימוש ברסיברים פיאזו-חשמליים, למרות שגלאי האטלון האופטיים שתוארו מעלה עשויים לספק פתרון לבעיה זו. לסיכום, PAT מציעה ביצועי דימות עדיפים במונחים של רזולוציה מרחבית ומהירות רכישה, אך בצורה המתוחכמת ביותר שלה היא מורכבת ויקרה בהרבה מאשר AR-PAM.

image21 20

איור 10: מערכת מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אקוסטית (AR-PAM) המשמשת לדימות כלי דם בעור. a) סכמה של המערכת. b) אזור סריקת הזרוע. c) תמונת MIP לטראלית x-y (FOV = 8 x 8 mm). d) תמונת חתך אנכי x-z לאורך קו אנכי ב- c. אורך גל לייזר העירור: 584 nm.

image19 20

איור 11: סורק מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אופטית (OR-PAM) המשמשת לדימות in vivo של אוזן עכבר. a) סכמה של המערכת. BS – מפצל אלומה; PD – פוטודיודה; CorL – עדשת תיקון; RAP – פריזמה זווית ימנית; SO – שמן סיליקון; RhP – פריזמה רומבואידית; US – מתמר אולטראסאונד (50 MHz). ה- CCD משמש לצפייה באזור הדימות. הרכיבים הנמצאים בתוך המלבן המקווקו יוצרים את ראש הסריקה, המתורגם מכאנית בכדי לרכוש תמונה. b) תמונת in vivo של המערכת המיקרו-וסקולרית באוזן העכבר. c) אזור מורחב מראה רשת של נימים ותאי דם אדומים (RBC). אורך גל עירור: 570 nm.

4.2.2. מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אופטית

מצב נוסף של מיקרוסקופיית PA הוא מצב רזולוציה אופטית (OR-PAM) שבו התחימה האופטית, להבדיל מהאקוסטית, מנוצלת למטרות לוקאליזציה. מצב זה דומה יותר למיקרוסקופיה אופטית מאשר דימות אקוסטי מכיוון שהרזולוציה הלטראלית מוגדרת על ידי הממדים של אלומת לייזר מוגבלת-דיפרקציה ממוקדת ביותר המשמשת לחולל את גלי ה- PA. דמיון נוסף למיקרוסקופיה אופטית הוא כי מדובר בטכניקת דימות שטחית לחלוטין עם עומק חדירה מקסימאלי של בערך 1 mm ברוב הרקמות, בשל הפיזור האופטי. עם זאת, אחת התכונות המבדילות ביניהן היא כי בשונה מהוריאציות הקיימות של מיקרוסקופיה אופטית, היא מספקת קונטרסט דימות אופטי מבוסס-בליעה.

איור 11 מציג סכמה של סוג אחד של יישום. עדשה אופטית באפרטורה נומרית גבוהה (NA) משמשת למיקוד של אלומת לייזר העירור על שטח הרקמה ורפלקטור אקוסטי שקוף אופטית מכוון את גל ה- PA אל מתמר אולטראסאונד. על ידי סריקה מכאנית של אלומת העירור הממוקדת והמתמר ביחד, ותיעוד של קווי ה- A המזוהים בכל נקודה, ניתן ליצור תמונה תלת-ממדית בדומה ל- AR-PAM. עם זאת, בשונה מ- AR-PAM, הרזולוציה הלטראלית בעומקים של פחות מ- 1 mm בקירוב (מעבר לכך הפיזור האופטי מפחית את מיקוד האלומה ופוגע ברזולוציה) מוגדרת על ידי הממדים מוגבלי-הדיפרקציה של אלומת הלייזר הממוקדת. בהשוואה ל- AR-PAM, ניתן להשיג רזולוציה לטראלית גבוהה בהרבה, בסדר גודל של מספר מיקרונים בטווח עומקים זה. בכדי לקבל רזולוציה אקוסטית מוגבלת-דיפרקציה דומה עם AR-PAM, נדרש תוכן תדרים אקוסטי בפס-רחב בטווח של כמה מאות MHz. למרות שאפשרי לחולל גלי PA עם רוחב פס כזה, ההחלשה האקוסטית בתדירויות גבוהות כאלו היא גבוהה בהרבה מההחלשה האופטית, ותגביל את עומק החדירה ל- 100 μm בקירוב. בניגוד לכך, ב- OR-PAM, עומק החדירה המקסימאלי של 1 mm בקירוב הוא תוצאה לא של החלשה אקוסטית או אופטית, אלא של ההתפרשות והעיוות של אלומת לייזר העירור הנובעות מהפיזור האופטי של הרקמה המונע שימור של מיקוד צר מעבר לעומק זה.

הרזולוציה הלטראלית הגבוהה הקיימת ב- OR-PAM מאפשרת תמונות en face של נימים אינדיבידואליים ואפילו תאי דם אדומים (RBC) אינדיבידואליים באוזן העכבר, כפי שניתן לראות באיור 11. למרות שתמונות אלו ממחישות את הרזולוציה הלטראלית הגבוהה של OR-PAM, הרזולוציה האנכית היא נמוכה יותר בסדר גודל אחד בקירוב (בדרך כלל 10 μm בקירוב), מכיוון שהיא תלויה בפרופגציה וגילוי אקוסטי ולפיכך מוגבלת על ידי החלשה אקוסטית או רוחב הפס של הגלאי כמו ב- PAT או AR-PAM. הפער בין הרזולוציה הלטראלית והאנכית ניתן לתיקון חלקי באמצעות שיטות עירור אופטי לא-ליניאריות המספקות לוקאליזציה מרחבית צירית ולטראלית בהגדרה אופטית. עם זאת, שיטות אלו דורשות סריקה תלת-ממדית בכדי ליצור תמונה וולומטרית. אפילו ב- OR-PAM קונבנציונאלי נדרשת מידה של סריקה צירית עבור דימות תלת-ממדי, מכיוון שהרזולוציה הלטראלית הגבוהה ביותר מתרחשת רק בעומק של המיקוד האופטי. לצד הקונפיגורציה המוצגת באיור 11, דווחו מספר יישומים אחרים. שי ועמיתיו מתארים שיטת סריקה חלופית ששימשה בנוסף לדימות של כלי דם באוזן עכבר ולאחר מכן ברשתית. גישה זו נמנעת ממגבלות קצב הפריימים של שיטות סריקה מכאנית על ידי סריקה אופטית של אלומת עירור PA ממוקדת לרוחב שטח הרקמה באמצעות סורק גלוונומטר x-y וזיהוי אותות ה- PA באמצעות רסיבר אולטראסאונד מישורי נייח בודד המקזז את אזור הסריקה. למרות שניתן להשיג קצב פריימים גבוה יותר באמצעות שיטה זו, קצב זה מושג על חשבון FOV מופחת, המוגבל על ידי התגובה הכיוונית של הרסיבר. התפתחות נוספת ב- OR-PAM כוללת שימוש באופטיקה אדפטיבית. עד היום שיטה זו שימשה כדי לתקן את הסטיות בעדשת הסריקה ואופטיקת שידור אור אך ניתן פוטנציאלית ליישמה בכדי לפצות על עיוותים אופטיים בחזית הגל ברקמות בכדי להגדיל את עומק החדירה. מערכת הגילוי האופטי המתוארת ב- §4.1.1שימשה בנוסף עבור PAT ו- OR-PAM תוך שהיא מאפשרת לטפל בסקאלות המרחביות השונות של כל מודאליות באמצעות אותו מכשור.

למרות ש- OR-PAM in vivo היא בעיקרה שיטת דימות שטחית, המוגבלת בעיקר לדימות של אוזן ומוח העכבר (לאחר הסרת העור), היא מספקת תוספת מועילה למערך הנוכחי של שיטות דימות PA. אחד המאפיינים המרכזיים הוא כי פלומטריית דופלר PA (§5.2) ומדידה ספקטרוסקופית של אוקסיגנציה בדם (§5.1) הן פחות מורכבות ליישום באמצעות OR-PAM מאשר ב- PAT ו- AR-PAM. יכולות פונקציונאליות אלו הופכות את OR-PAM לכלי מחקרי עוצמתי עבור מחקרים פרה-קליניים של אספקה והעברה של חמצן ברמת הנימים. להוציא יישומים ברפואת עיניים, היישומים הקליניים של OR-PAM מוגבלים בסופו של דבר בשל עומק החדירה הקצר.

4.3. מכשירים אנדוסקופיים

קיימים מספר יישומים קליניים פוטנציאלים שבהם ניתן להגיע לרקמת המטרה באמצעות גשוש אנדוסקופי מיניאטורי דרך העור או דרך נקבי הגוף. יישומים אלו כוללים אומדן קליני של מחלות עורקי הלב, סרטן הערמונית ופתולוגיות במעיים והקיבה. מספר אבי-טיפוס של מכשירי PA אנדוסקופיים או תוך-ורידיים, הדומים עקרונית לגשושי US קונבנציונאליים, פותחו עבור יישומים אלו. דימות PA  תוך-ורידי מיישם גשוש sideways מסתובב באופן דומה ל- IVUS. איור 12 מציג אחת מקונפיגורציות אלו. היא כוללת מתמר PZT 30 MHz בקוטר 1 mm הממוקם בקצה של קטטר, קרוב לקצה של סיב אופטי בחיתוך זוויתי (angle polished) המשדר את הפולסים של לייזר עירור ה- PA. הקוטר החיצוני הכולל של המערך הוא 1.25 mm ולפיכך בממדים דומים לאלו הנדרשים לדימות תוך-ורידי בעורקי הלב. לצד אפשרות של תמונות חתך רוחב ב- PA על ידי סיבוב הקטטר ורכישת קווי-A של PA בכל שלב זוויתי, המתמר פעל במצב פולס-הד בכדי לאפשר רכישה סימולטנית של תמונת IVUS משותפת. איור 12 מציג תמונות PA ו- US שהושגו ex vivo בעורקי לב אנושיים. בכדי לזהות אזורים עשירים בליפידים, תמונות ה- PA הושגו בשיא אורך גל הבליעה של הליפידים ב- 1210 nm, ולשם השוואה, ב- 1230 nm שם הבליעה נמוכה. מגוון של עיצובים של גשושי PA תוך-ורידיים המבוססים על מנגנוני העברת אור וגילוי אולטראסאונד הודגמו בנוסף. עד עתה, אף אחד מהם לא נבדק in vivo. מצב זה נובע בחלקו מהאתגרים הטכניים המעורבים באינטגרציה של הסיב האופטי המעביר עם הגלאי הפיאזו-חשמלי הקונבנציונאלי תוך השגת הרמה הדרושה של מזעור לשימוש תוך-ורידי. השימוש בגלאי האולטראסאונד האופטי המוזכר ב- §4.1.1עשוי לתקן מגבלה זו. גשוש דימות PA side-looking בקוטר 250 μm המבוסס על חיישן מסוג זה תואר במחקר. עיצובי גשושים מיניאטוריים אחרים הוצעו או נבדקו עבור יישומים אחרים. אחד מהם משתמש בגשוש אולטראסאונד endocavity קדמי של 128 אלמנטים בכדי לזהות גלי PA, והוצע לדימות של הערמונית. יאנג ועמיתיו מתארים גשוש דימות PA ו- US side-looking מצב-כפול. גשוש זה משתמש במראה אופטית ואקוסטית מסתובבת ב- 45o הממוקמת בקצה המכשיר בכדי לשדר את אות העירור ולקלוט את אות ה- PA ובכך מונעת את הצורך לסובב את מוט הקטטר. הקוטר של הגשוש הוא גדול יחסית ב- 4 mm אך הוא קטן מספיק עבור שימוש בקיבה ובמעיים.

image17 21

איור 12: גשוש דימות US ו- PA מצב-כפול תוך-ורידי המשמש לדימות של עורקי לב אנושיים ex vivo. פאנל שמאלי: (למעלה) סכמה של מערך הניסוי. (למטה) תמונה של קצה הקטטר. פאנל ימני: (a) חתך היסטולוגי המראה פלאק עשיר בליפיד (כוכבית) ואזור של הסתיידות. Lu – לומן; Pf – שומן פרי-אדוונטיציה. (b) תמונת IVUS, (c) תמונת PA תוך-ורידית שהושגה באמצעות אורך גל עירור של 1210 nm (בליעת ליפידים מהירה), (d) תמונת PA תוך-ורידית שהושגה באמצעות אורך גל עירור של 1230 nm (בליעת ליפידים נמוכה).

5. שיטות חישה פוטו-אקוסטיות

5.1. ספקטרוסקופיה פוטו-אקוסטית

אחד היתרונות המרכזיים של דימות PA הוא כי ניתן להגדיל את הקונטרסט של התמונה באופן סלקטיבי עבור רכיבי רקמה ספציפיים, על ידי כוונון אורך הגל של לייזר העירור למאפייני הבליעה של הכרומופורים שלהם. לדוגמא, כפי שתיארנו בחלק הקודם, על ידי עירור באורך גל התואם את שיא הבליעה ב- 1210 nm המאפיין ליפידים, ניתן לזהות נוכחות של פלאקים אתרומטיים עשירים-בליפידים. ניתן בנוסף להרחיב סוג זה של הגדלת קונטרסט. על ידי רכישה של תמונות במגוון אורכי גל ועריכת ניתוח ספקטרוסקופי, ניתן לכמת את הריכוז של כרומופורים ספציפיים באופן דומה לספקטרוסקופיית העברה אופטית קונבנציונאלית, בהנחה כי המאפיינים הספקטראליים של הכרומופורים והמפזרים הם ידועים. לדוגמא, ספקטרום הבליעה של דם באורכי גל נראים ו- NIR תלוי באופן חזק בחמצן הרווי (sO2), כתוצאה מההבדלים הספקטראליים המובהקים בין אוקסיהמוגלובין (HbO2) לדאוקסיהמוגלובין (HHb), כמפורט באיור 1. בעזרת הידע לגבי הבדלים ספקטראליים אלו, ניתן לאחר מכן לכמת את הריכוזים של HbO2 ו- HHb ולאמוד את sO2 , פרמטר פיזיולוגי חשוב הקשור באופן הדוק לטווח נרחב של תהליכים פתופיזיולוגיים כמו אנגיוגנזיס ותהליכי דלקות ברקמות. לצד דימות של ריכוזי כרומופורים אנדוגניים, שיטות ספקטרוסקופיות מאפשרות לזהות ולכמת את ההצטברות של סוכני קונטרסט ממוקדים המשמשים בדימות PA מולקולארי. במקרה זה, בולע מובחן ספקטראלית כמו מולקולת צבע או ננו-חלקיק מתויג לתרכובת ממוקדת הנקשרת לרצפטור ספציפי-למחלה כמו חלבון שטח-תא או אנזים. השימוש בשיטות ספקטרוסקופיות בכדי לכמת את ההצטברות המקומית של סוכן הקונטרסט יכול לספק מידע לגבי תהליכי מחלה ברמה התאית או המולקולארית.

כאמור, ספקטרוסקופיית PA מהווה תוספת חשובה לשיטות דימות PA בכך שהיא מספקת יכולת דימות פונקציונאלית ומולקולארית. עם זאת, השגת כימות אבסולוטי או אפילו יחסי של ריכוזי כרומופורים באמצעות ספקטרוסקופיית PA מהווה אתגר משמעותי. למרות שכמתואר ב- §2קונטרסט PA נחשב כ”מבוסס בליעה”, אין פירוש הדבר כי הוא פרופורציונאלי ישירות למקדם הבליעה – תמונת PA היא ייצוג של התפלגות האנרגיה האופטית הנבלעת, ולא של התפלגות מקדם הבליעה כפי שנהוג לחשוב. האנרגיה האופטית הנבלעת בנקודה מסוימת היא תוצר של מקדם הבליעה המקומי ושל הזרימה, כשזו תלויה בהתפלגות של מקדמי הבליעה והפיזור על פני כל נפח הרקמה המוארת. הספקטרומים של כל הכרומופורים השונים והמפזרים בנפח זה יקודדו, במידה מסוימת, בספקטרום האנרגיה הנבלעת בנקודה ספציפית. דוגמא לכך מתרחשת כאשר שני בולעים מובחנים ספקטראלית ממוקמים כך שאחד מהם מונח מתחת לאחר. מכיוון שהאור עובר דרך הבולע העליון כדי להגיע לזה שמתחתיו, ספקטרום האנרגיה הנבלעת של התחתון יכלול מאפיינים ספקטראליים של שניהם. בהינתן כי ברקמות, הפוטון יכול להתפזר מכל נקודה לנקודה אחרת, הצלבה ספקטרוסקופית כזו יכולה להתרחש אפילו אם שני בולעים ממוקמים זה ליד זה באותו עומק או אם קיים פיזור אחורי מובהק, מבולע הממוקם בעומק לבולע השוכן מעליו. כתוצאה מכך, הבעיה של זיהוי ריכוזי כרומופורים הינה שונה מספקטרוסקופיית העברה אופטית קונבנציונאלית. בשיטה הקונבנציונאלית, האות הינו פרופורציונאלי באופן ישיר למקדם הבליעה מה שמאפשר ניסוח של הבעיה בתור סט של משוואות ליניאריות סימולטניות (אחת לכל אורך-גל), אותן ניתן להפוך בכדי לזהות את ריכוזי הכרומופורים. מכיוון שקונטרסט דימות PA אינו פרופורציונאלי למקדם הבליעה, היישום של היפוך ליניארי פשוט זה פיקסל-לפיקסל על סט של תמונות PA מרובות-אורכי גל ככל הנראה ייכשל. לדוגמא, אם המטרה היא הומוגנית מבחינה אופטית, או אם כרומופור המטרה מוקף בכרומופורים עם מאפיינים ספקטראליים אחידים או בעלי בליעה חלשה, או שניהם. עם זאת, תנאים אלו מתרחשים רק לעתים נדירות ברקמות ביולוגיות in vivo. אחד מהחריגים לכך, שבו היפוך ספקטרוסקופי ליניארי פשוט יכול להיות תקף, מתרחש בעת דימות של מאפיינים שטחיים ביותר בעומק כמה מאות מיקרומטרים מפני השטח, כמו ב- OR-PAM (§4.2.2). תחת תנאים אלו, ניתן להתעלם מהתלות של אורך הגל בהתפלגות האור החיצונית. בעקבות זאת ניתן לקבל את ההנחה כי קונטרסט התמונה הינו פרופורציונאלי ישירות למקדם הבליעה, והכימות של ריכוזי הכרומופורים באמצעות היפוך ליניארי הופך לאפשרי.

ההנחה המקובלת כיום היא כי תיקון ההשפעה המזיקה של תלות אורך הגל בהתפלגות הזרימה הינו חיוני לקבלת מדידות ספקטרוסקופיות כמותיות מדויקות. אחת הגישות היא להתאים את הדה-קומפוזיציה הספקטרוסקופית הליניארית שהוזכרה מעלה באמצעות שילוב של תיקון אמפירי או גורמי כיול המפצים על תלות אורך הגל בהתפלגות האור החיצונית. לדוגמא, נטען כי אפשר לפצות על המאפיינים הספקטראליים של הרקמה המכסה את אזור המטרה באמצעות מדידה של מעבר האור כפונקציה של אורך הגל, דרך דגימה של רקמה מעוררת מאותו סוג. שיטה נוספת להשגת סוג דומה של מידע כוללת מדידה של ספקטרום ה- PA של בולע פלסטיק שחור (בעל מאפיינים ספקטראליים ידועים או אחידים) המושתל מתחת לעור של עכבר חי בעומק המטרה. החיסרון של גורמי תיקון אמפיריים אלו, מלבד השיטות הקליניות החודרניות והבלתי-ישימות הכרוכות בהם, הוא כי הם תלויים במידה משמעותית במבנה, קומפוזיציה ופיזיולוגיה של הרקמה, במיוחד מצב הפרפוזיה והאוקסיגנציה. בהתחשב בכך שגורמים אלו משתנים במידה מובהקת בין סוגי רקמות שונים ובמשך הזמן, נתון זה מגביל את היישומיות שלהם. גישה שונה באופן מהותי, בעלת פוטנציאל להימנע ממגבלות אלו, היא להשתמש בסכמת היפוך לא-ליניארית מבוססת-מודל. בשיטה זו, התפלגות האור תלוית-אורך גל מתוקנת לא על ידי גורמי תיקון אמפיריים, אלא באמצעות ייצוג מתמטי מפורש של מעבר האור במודל קדמי. המודל מספק תמונות מרובות-אורכי גל בדימות או אותות PA כפונקציה של ההתפלגות המרחבית של ריכוזי הכרומופורים. ריכוזים אלו נאמדים לאחר מכן על ידי היפוך המודל, באמצעות שינוי ריכוזי הכרומופורים עד שההבדל בין התמונות הנמדדות לבין אלו שנחזו על ידי המודל מצטמצם. מכיוון שניתן לנסח את המודל בתור פונקציה של התפלגות מרחבית שרירותית של מספר כלשהו של כרומופורים, שיטה זו ישימה באופן עקרוני לכל סוג או גיאומטריה של רקמות, אם כי עם עלות חישובית מסוימת, במיוחד אם מיישמים אותה בשלושה ממדים. שיטה זו הודגמה מחקרית באמצעות נתוני סימולציה בכדי לקבל מפות דו-ממדיות של ריכוזי כרומופורים. היא שימשה בנוסף (בצורה מצומצמת בכדי למזער את זמן החישוב) למדידה כמותית של HbO2 ו- HHb ו- sO2 בדם מאותות PA נקודה-בודדת שהתחוללו ברקמות כחיקוי של פאנטומים, ולאחר מכן לשחזור של תמונות דו-ממדיות של ריכוזי הכרומופורים. אסטרטגיה חלופית היא לנסות להשתמש במודל מעבר אור בכדי לקבל תמונות מקדם בליעה באורכי גל אינדיבידואלים ולאחר מכן ליישם היפוך ליניארי, פיקסל אחרי פיקסל, כדי לזהות את ריכוזי הכרומופורים. עם זאת, בגלל חוסר-הייחודיות של פיזור הבליעה הקשור בתמונות אנרגיה נבלעת, בדרך כלל אין זה אפשרי לקבל תמונות מקדם בליעה באורך-גל בודד מבלי לשלב מידע נוסף כמו התפלגות הפיזור, שבדרך כלל אינה ידועה, או מדידות זרימה שהושגו ממודאליות דימות אחרת (לדוגמא טומוגרפיה אופטית), מה שמוסיף על המורכבות הניסויית. השיטה שתוארה מעלה מתגברת על כך על ידי התאמת המודל הקדמי לכל תמונות ה- PA מרובות-אורכי גל באופן סימולטני – המידע הנוסף המתקבל מהמאפיינים הספקטראליים הידועים של הכרומופורים והמפזרים מתקן את חוסר-הייחודיות. שיאו ועמיתיו מתארים סכמת היפוך מבוססת-מודל שונה, וטוענים כי ניתן לקבל גם את ריכוזי הכרומופורים וגם את מהירות הקול.

שיטות אחרות המנסות לפצות על האפקט המזיק של תלות אורך הגל בהתפלגות הזרימה מבוססות על שימוש במידע נוסף. אחת מהן מסתמכת על הצגת סוכן קונטרסט בעל ספקטרום בליעה ידוע. שיטה אחרת מיישמת ספקטרוסקופיית החזרת דיפוזיה בכדי לאמוד את התכונות האופטיות של הרקמה שלאחר מכן משמשות במודל פרופגציית אור בכדי לתקן את שינויי הזרימה. השימוש בטומוגרפיית דיפוזיה אופטית בכדי לאמוד באופן בלתי תלוי את הזרימה כפי שתואר מעלה נבדק גם הוא במחקר.

5.2. פלומטריית דופלר פוטו-אקוסטית

יכולת פונקציונאלית נוספת היא מדידה של מהירות זרימת הדם באמצעות שיטות פלומטריית דופלר. שיטה זו מועילה לחקר של זרימה בכלי דם בגידולים, שבהם האופי המפותל של המערכת המיקרו-וסקולרית עשוי להוביל לזרימת דם כאוטית ומשתנה העלולה לפגוע בתגובה התרפויטית. לעומת זאת, אם נוכל למדוד את זרימת הדם ואת sO2 סימולטנית (את sO2 כמתואר ב- §5.1), נוכל לאמוד את מעבר החמצן וכך לקבל מדידה של צריכת החמצן – פרמטר פיזיולוגי חשוב הקשור למטבוליזם רקמות אותו קשה למדוד באופן בלתי-חודרני בשיטות אחרות מבלי להשתמש בסוכני קונטרסט. ניתן לבצע מדידת זרימה ב- PA באופן דומה לאולטראסאונד דופלר קונבנציונאלי – כלומר, שחזור התדירות, הפאזה או שינויי הזמן המקודדים בגלי ה- PA הנוצרים על ידי תנועת תאי דם אדומים. בשונה מאולטראסאונד דופלר, לעומת זאת, האות האקוסטי המזוהה נוצר מתאי דם, להבדיל מכך שהוא חוזר מהם באופן חלש. מצב זה מהווה יתרון SNR משמעותי במיוחד כאשר מודדים זרימה בכלי דם זעירים מכיוון שאלו מציגים אקוגניות נמוכה. בנוסף, מדידות אולטראסאונד דופלר של מהירויות זרימה נמוכות יחסית (פחות מ- 50 mm s-1) בכלי דם זעירים יכולות להשתבש על ידי אות הפיזור האחורי הגדול מהרקמה המקיפה, הנע במהירויות דומות כתוצאה מתנועות נשימה או לב. בפלומטריית דופלר PA, מצב זה הינו פחות בעייתי בזכות הבליעה האופטית החזקה של דם בהשוואה לזו של דופן כלי הדם והרקמה המקיפה. בשל כך, PA דופלר משמש בעיקר למדידה של מהירויות זרימה נמוכות במערכת המיקרו-וסקולרית, ולא של דם בעל תנועה מהירה בעורקים הראשיים אותו ניתן למדוד ביעילות באמצעות אולטראסאונד דופלר פולס-גל קונבנציונאלי.

למרות שהעקרונות של פלומטריית דופלר PA תוארו כבר לפני עשור, רק לאחרונה היא הודגמה באופן ניסויי. מדידות PA של מהירות בפאנטום חיקוי-רקמה הושגו על ידי זיהוי שינויי תדירות דופלר באמצעות עירור גל רצוף (CW). עם זאת, בדומה לאולטראסאונד דופלר CW, גישה זו אינה יכולה לספק מדידות רזולוציית עומק מהירות. השימוש בעירור פולס מתגבר על מגבלה זו. ניתוח רזולוציית זמן ספקטראלי של גלי PA בעירור tone burst הצליח לכמת שינויי תדירות דופלר עבור מהירויות בין 3.5 ל- 200 mm s-1 בפאנטומים. שיטה זו כרוכה בפשרה בנוגע לרזולוציית מהירות-מרחב – tone burst ממושך מספק רזולוציה ספקטראלית ורזולוציית מהירות, אך על חשבון הרזולוציה המרחבית. במחקרם של שיינפלד ועמיתיו, יושם משך tone burst של 3 μs. תהליך זה יצר רזולוציית מהירות של 1.5 mm s-1 אך עם רזולוציית עומק נמוכה יחסית של 4.5 mm. למרות שמקור הפולס ב- C-בנד (1530 nm – 1565 nm) שימש בכדי להדגים את הקונספט בפאנטום, הזמינות המוגבלת של מקורות לייזר מאופננים דמויי- CW עם עוצמת פלט מספקת באורכי גל המתאימים ליישום in vivo (< 900 nm) עלולה להוות מגבלה פרקטית. שיטת פלומטריית דופלר חלופית המבוססת על עירור פולס ועיבוד קורלציית זמן נבדקה גם היא במחקר. גישה זו, השאובה מפלומטריית אולטראסאונד בקורלציית זמן, מסתמכת על מדידת השינוי בזמן ההגעה של פולסים פוטו-אקוסטיים עוקבים הנפלטים על ידי אשכול נע של RBCs באמצעות פונקצית קורלציה-צולבת. על ידי שימוש בפולסים קצרים של לייזר (ננו-שנייה) היא מאפשרת רזולוציה מרחבית גבוהה ויכולה ליישם לייזרים בפולס Q-switch זמינים המשמשים באופן נפוץ בדימות PA. טווח המהירות והרזולוציה הם ברי-סילום עם הפרדת פולס העירור: עבור הפרדת פולס של 5 ms וגבול עליון של 180 mm s-1, רזולוציית המהירות נאמדה כ- ±1 mm s-1. עד היום, פלומטריית דופלר PA ברזולוציית עומק המשתמשת במצבי PA מוגדרים-אקוסטית (AR-PAM ו- PAT) טרם הודגמה בדם, אלא רק בפאנטומים מחקי-רקמה. האתגר של עריכת מדידות בדם נובע מההטרוגניות האופטית שלו. אם ההפרדה המרחבית בין RBCs אינדיבידואליים או גושים של RBCs היא קטנה בהשוואה לאורך הגל האקוסטי הגלוי המינימאלי, הדם יופיע כבולע הומוגני מרחבית ויסכן את היכולת של קורלציית הזמן ושיטות תחום-זמן אחרות לבצע מדידות של מהירות. השאלה האם בעיה זו תימצא כמגבלה מהותית דורשת חקר נוסף. ההצלחה של אולטראסאונד דופלר גל-פולס ואולטראסאונד פולס-הד בקורלציה-צולבת עבור מדידה של זרימת הדם מלמדת כי יש סיבה לאופטימיות בהקשר זה.

במצב הגדרה אופטית, OR-PAM, סוגיית ההטרוגניות המרחבית אינה מהווה מגבלה מהותית. זאת מכיוון שגודל נקודת העירור (מספר מיקרומטרים בקירוב) הינו דומה לזה של RBC בודד ומאפשר להטרוגניות המרחבית בבליעה האופטית של הדם לעבור רזולוציה ישירה. כתוצאה מכך, מדידות של זרימת הדם הודגמו בהצלחה in vivo. אחת השיטות מבוססת על זיהוי התרחבות רוחב הפס האקוסטי הנובעת מהבדל התדירות בין הקצוות של חזית הגל הנוצרת מבולע הנע באופן אורתוגונאלי לציר של מתמר ממוקד. שינוי התדירות נאמד על ידי חישוב האוטו-קורלציה של קווי-A סדרתיים הנוצרים מפולסים עוקבים של לייזר. מכיוון שמדובר בסכמה של עירור פולס, ניתן לערוך מדידות זרימה ברזולוציה מרחבית. גישה זו הודגמה in vivo למדידה של מהירויות עד בערך 7.4 mm s-1 עם רזולוציה של 0.1 mm s-1 ולפיכך בתוך טווח המהירות של זרימת הדם בכלי דם זעירים. היא שימשה בנוסף בכדי לזהות מפות דו-ממדיות של זרימה בכלי הדם באוזן העכבר ושולבה עם מדידות ספקטרוסקופיות של sO2 כדי לאמוד שינויים בקצב המטבולי של חמצן, המהווה מדידה של צריכת חמצן ברקמות. האתגר הנוכחי בפלומטריית דופלר PA הוא לתרגם את ההצלחה של פולמטריית OR-PAM למודאליות המוגדרות-אקוסטית של AR-PAM ו- PAT בכדי לערוך מדידות זרימה מעבר לגבול עומק החדירה המוגדר-אופטית של 1 mm ב- OR-PAM.

5.3. תרמומטריה פוטו-אקוסטית

תלות הטמפרטורה של מקדם גרונאייסן, המודדת את היעילות התרמו-מכאנית של תהליך התחוללות PA, מספקת אמצעי זיהוי לא-חודרני של מפות התפלגות טמפרטורה ברקמות. לתהליך זה יש יישום בתרמו-תראפיה שבה חום משמש בכדי להעלים פתולוגיות ברקמות, כמו גידולים. בתרפיית סרטן פוטו-תרמית, לדוגמא, סוכן קונטרסט ממוקד, כמו ננו-חלקיקי זהב בעלי בליעה גבוהה הנקשרים סלקטיבית לתאים ספציפיים-לגידול, מיושם באופן סיסטמטי. הגידול עובר הקרנה עם אור לייזר CW “תרפויטי” באינטנסיביות גבוהה באורך גל שבו סוכן הקונטרסט בולע באופן חזק. רק תאי הגידול בעלי זיקה לסוכן הקונטרסט יתחממו ולפיכך יעברו אבלציה, ובכך יותירו את הרקמה המקיפה ללא פגע. ניתן להשתמש בדימות PA בשתי דרכים בכדי לתכנן ולפקח על הטיפול. ראשית, תמונת PA היא פרופורציונאלית באופן ישיר לאנרגיה האופטית הנבלעת. לפיכך אם נרכשת תמונה לפני התרפיה, היא תספק אומדן של חלקי הגידול שיתחממו כאשר הלייזר CW ה”תרפויטי” יוקרן על הגידול. שנית, על ידי רכישת תמונת PA במהלך פאזת החימום התרפויטי, ניתן לנטר את העלייה בטמפרטורה ולפיכך את ה”מינון” התרמי בזמן-אמת. באופן זה, ניתן יהיה לקבוע אילו אזורים בגידול התחממו לטמפרטורה העולה על הסף של מוות תאים ולשנות את הפרמטרים של הטיפול בהתאם. היכולת למפות טמפרטורה יכולה לשמש באופן דומה לניטור של תרפיית HIFU עבור אופטימיזציה של פרמטרי הטיפול, כמתואר ב- §6.1.5. נערכו מספר מחקרים בכדי לבחון את תלות הטמפרטורה של אותות PA ברזולוציית-זמן הנמדדים בנקודה בודדת בפאנטומים ודגימות רקמה ex vivo. בנוסף, מחקר שהדגים את הפוטנציאל לקבל מפות דו-ממדיות של עליות טמפרטורה בהשראה-אופטית בננו-חלקיקי זהב המושתלים בדגימות רקמה ex vivo המחיש את הפוטנציאל עבור ניטור לא-חודרני של תרפיה פוטו-תרמית. הרזולוציה התרמית שדווחה במחקרים אלו היא בסדר גודל של 0.15oC.

6. יישומים ביו-רפואיים

6.1. יישומים קליניים

6.1.1. דימות שד

דימות של סרטן שד הינו יישום קליני פוטנציאלי חשוב של PAT. הוא מבוסס על ההשערה לפיה הבליעה האופטית המוגברת הנובעת מהוסקולריות הגבוהה של גידולים תזוהה בתור אזור עם קונטרסט גבוה בתמונת PA , בה ניתן להשתמש לאחר מכן לזיהוי גידולים ודיאגנוזה. בנוסף, היכולת של דימות PA למפות אוקסיגנציה בדם, היכולה להוות אינדיקציה של תגובה תרפויטית, יכולה לשמש לתכנון וניטור של טיפולים. הזיהוי של בלוטות לימפה סנטינליות להכוונת ביופסיית מחט באמצעות ההצטברות של סוכן קונטרסט מוזרק בעל בליעה אופטית, הינו יישום נוסף שנבדק במחקרים. ניתן להשתמש בנוסף בפולסים של מיקרו-גל, במקום או יחד עם עירור אופטי. במקרה זה, בליעת RF מוגברת הנובעת מהמוליכות הגבוהה הנגרמת מרמות גבוהות של תכולת מים יוניים, תוצר של ריכוז ההמוגלובין הגבוה וחלבונים אחרים הקשורים לסרטן, מציעה מנגנון דיסקרימינציה פוטנציאלי המשלים את המנגנון של עירור אופטי. השימוש בקרינת מיקרו-גל מציע גם הוא פוטנציאל להשגת עומק חדירה גדול יותר. השילוב של דימות PA עם אולטראסאונד פולס-הד עשוי לספק מקור נוסף של קונטרסט באמצעות ההבדלים באימפדנס האקוסטי. אחד האתגרים המרכזיים בדימות סרטן שד הוא עומקי החדירה הגדולים הנדרשים (6 cm בקירוב), אם כי מספר מחקרים שיישמו עירור NIR או מיקרו-גל מראים כי ניתן לגבור על בעיה זו. מגוון קונפיגורציות מכשירים פותחו, כולל גיאומטריית גילוי PAT חצי-כדורית המוצגת באיור 4, עבור דימות של כלל השד במהירות גבוהה, או גיאומטריות גליליות עבור דימות חתך-רוחב דו-ממדי של השד. נעשה בנוסף שימוש בגיאומטריה מישורית ב- Twente Photoacoustic Mammoscope. בסכמה זו, השד נלחץ בעדינות בין פלטת זכוכית ומערך PVDF דו-ממדי של 590 אלמנטים. מערכת זו נבחנה במחקר פיילוט קליני בקנה מידה קטן. נמצאו אזורים בעלי בליעה מוגברת בתמונות ה- PA ששויכו לוסקולריות של הגידולים. בנוסף פותח גשוש US ידני מסחרי הכולל מערך ליניארי וצרור סיבים בכדי לשדר את אור העירור, אותו ניתן להזיז על פני השד ולהפיק תמונות PA ו- US דו-ממדיות בזמן-אמת. גשוש זה נבדק באמצעות מודל בעלי חיים עבור יישום גילוי בלוטות הלימפה הסניטינליות שהוזכרו מעלה. למרות שהיישומיות הקלינית של דימות שד PA טרם נקבעה ללא מחקרים קליניים גדולים, העמידה בדרישות הבסיסיות במונחים של טווח, רזולוציה וממשק מטופל-מכשיר עבור יישומים מסוימים נראית אפשרית.

6.1.2. עור

דימות של העור הינו יישום פשוט יחסית מכיוון שעומק החדירה הנדרש הוא קטן ובתוך הטווח האפשרי של דימות PA כפי שניתן לראות באיורים 8-10. בנוסף, פותחו מספר מכשירי PAT ו- AR-PAM בצורה כזו או אחרת, בעלי ביצועים מתאימים עבור ויזואליזציה של כלי הדם ומאפיינים אחרים בעור. הפוטנציאל לדימות של המבנה והתפקוד של כלי הדם בעור ובתת-עור וכמו גם תכולת המלנין מלמד כי דימות PA רלוונטי לאומדן הקליני של פתולוגיות עור: לדוגמא, בכדי לספק דיאגנוזה מדויקת יותר וזיהוי שלב הגידול כמו מלנומות ממאירות ולסייע לתכנון של הסרתן בניתוח. יישומים פוטנציאליים אחרים כוללים אומדן של כוויות, החלמה של פצעים, הליכים פלסטיים ונזקים שטחיים ברקמות הרכות כמו פצעי לחץ וכיבים. חלק מיישומים אלו נחקרו במודלים של עכברים, אך טרם נערכו מחקרים קליניים. לדוגמא, מחקרים פרה-קליניים הראו כי ניתן לזהות עומק של כוויות ומלנומות. מרבית המחקרים על בני אדם הדגימו את היכולת של דימות PA לבצע ויזואליזציה של המערכת המיקרו-וסקולרית בעור, להבדיל מאפיון של פתולוגיות ספציפיות. פאבזה ועמיתיו, לעומת זאת, מתארים מחקר שבו הודגם כי המבנה של לזיה פיגמנטית שפירה יכולה לעבור דימות – נובע מכך כי דימות PA יכול לשמש לזיהוי נפח, עומק ועובי של גידולים ככלי מסייע לאומדן הקליני של גידולים בעור.

6.1.3. קרדיו-וסקולרי

כפי שתיארנו קודם, שיא הבליעה של ליפידים ב- 1210 nm יכול פוטנציאלית לשמש לזיהוי פלאקים אתרומטיים עשירים בליפידים בעלי נטייה מוגברת לקרעים. פלאקים פגיעים אלו יכולים לאחר מכן ליצור קריש דם אוקלוסיבי העלול להוביל להתקף לב או שבץ. דופן עורקי הלב יכול פוטנציאלית לעבור דימות באמצעות גשוש תוך-ורידי מיניאטורי side-looking באופן דומה ל- IVUS קונבנציונאלי כמתואר ב- §4.3. עם זאת, היכולת הספקטרוסקופית של דימות PA הוא בעל פוטנציאל לקבלת מידע ספציפי וכמותי יותר לגבי הקומפוזיציה של הפלאקים מאשר אולטראסאונד לבדו. מספר מחקרי ex vivo הראו כי קיים פוטנציאל לחשוף את המיקום של פלאקים עשירים בליפידים באמצעות דימות מרובה-אורכי גל כפי שמוצג באיור 13. בעוד שליפידים מייצגים את המקור המתבקש ביותר לקונטרסט מבדל, פלאקים רלוונטיים-דיאגנוסטית אחרים כמו מצבורי סידן, תכולת מאקרופאגים וחומר סיבי עשויים גם הם להציג ספקטרום בליעה מובחן בכדי לאפשר זיהוי וכימות של התכולה שלהם. בכדי לזהות מאקרופאגים (העשויים להיות מעורבים בהיווצרות של מאגר ליפידים בפלאקים פגיעים), סכמה חדשנית המבוססת על שינויי אורכי הגל בתהודה פלזמונית בהשראת-צימוד בספקטרום הבליעה של ננו-חלקיקי זהב תוארה במחקר. בגישה זו, ננו-חלקיקים מזהב נספגים על ידי המאקרופאגים. הקרבה של הננו-חלקיקים בתוך התא מובילה לשינויים באורכי הגל כתוצאה מצימוד תהודה פלזמונית. הננו-חלקיקים מחוץ לתא אינם קרובים מספיק זה לזה בכדי לגרום לשינוי וכך ניתן לבדל אותם מאלו הנמצאים בתוך התא. יישום נוסף הוא דימות סטנטים במהלך ההחדרה הניתוחית ולאחר מכן במעקב. איור 14 מציג תמונת US ו- PA וולומטרית של סטנט המוחדר לפאנטום. יישומים קרדיו-וסקולריים בלתי-חודרניים אחרים שהוצעו כוללים גילוי של טרומבוזיס עמוק בורידים ואפיון של פלאקים בעורק הקרוטיד.

6.1.4. אופתלמולוגיה

הקונטרסט מבוסס-בליעה של דימות PA מאפשר מיפוי של המבנה והאוקסיגנציה של כלי הדם ברשתית, הרלוונטיים לחקר של מצבים כמו ניוון מקולרי קשור-בגיל ורטינופתיה סוכרתית. בנוסף, יש לו פוטנציאל לדימות תכולת מלנין ב- RPE הרלוונטי לחקר תהליך ההזדקנות. מספק מחקרי בעלי חיים פרה-קליניים נערכו בתחום זה. מכשיר OR-PAM-OCT מצב-כפול פותח ושימש להשגת תמונות in vivo של כלי הדם ברשתית, דיסק אופטי ו- RPE (איור 15 a-c). לצד דימות של כלי דם ברשתית קיימת אפשרות נוספת ליצור ויזואליזציה של המבנה ו- sO2 של המערכת המיקרו-וסקולרית בקשתית ואבונורמליות קשורות כפי שמוצג באיור 15(d). סילברמן ועמיתיו מתארים סכמת OR-PAM בשילוב יכולת דימות אולטראסאונד פולס-הד בתדירות-גבוהה. מחקר אחר השיג תמונות PA ו- US של העין באמצעות סורק AR-PAM-UA מצב-כפול שחשפו מגוון גדול יותר של האנטומיה האוקולרית (הקרנית, קשתית עדשה והרשתית, RPE והדמית), אך עם רזולוציה נמוכה יותר.

image13 27

איור 13: דימות פוטו-אקוסטי של פלאקים אתרומטיים עשירים בליפידים. (a) תמונה של אבי עורקים עם פלאק מורם. הקו האופקי המקווקו מייצג את קו הסריקה הפוטו-אקוסטית. (b) תמונה פוטו-אקוסטית דו-ממדית שהושגה ב- 970 nm (בליעת ליפידים נמוכה, (c) תמונה פוטו-אקוסטית שהושגה ב- 1200 nm (בליעת ליפידים גבוהה) המציגה את הקונטרסט הגבוה הנובע מתכולת הליפידים הגבוהה בתוך הפלאק.

image14 24

איור 14: דימות אולטראסאונד ו- PA משולב של סטנט עורק לב המושתל ברקמת פאנטום. (a) תמונת אולטראסאונד, (b) תמונה פוטו-אקוסטית, (c) תמונה פוטו-אקוסטית ואולטראסאונד משולבת.

6.1.5. ניטור HIFU

הגורמים המרכזיים להצלחת טיפול HIFU בסרטן הם: i) זיהוי מדויק של אזור הגידול בו יש לטפל; ii) וידוא כי אלומת ה- HIFU מועברת עם דיוק מרחבי וסלקטיביות מספקים ל- ROI; iii) ניטור מצב הרקמה במהלך הטיפול באמצעות מסלול זמן הטמפרטורה או מדידת מאפיינים פיזיים תלויי-טמפרטורה של הרקמה; iv) אומדן לאחר הטיפול של מידת האבלציה ברקמה. דימות PA מאפשר הזדמנות לענות על כל 4 הדרישות. ראשית, הוסקולריות המוגברת של הגידול מספקת קונטרסט PA אינטרינזי אותו ניתן לנצל בכדי למקם את הגידול. לאחר המיקום, מיקוד מדויק של אלומת ה- HIFU הינה חיונית בכדי לחסל סלקטיבית את הגידול עם נזק היקפי מינימאלי לרקמה הסובבת. עם זאת, הטרוגניות מרחבית במהירות הקול עלולה לעוות את חזית גל ה- HIFU כך שהוא אינו ממוקד, ובכך לסכן את הדיוק. קיים פוטנציאל למתן זאת על ידי שימוש באותות ה- PA המזוהים יחד עם שיטות היפוך-זמן. תהליך זה מערב שידור של צורות גל ה- PA המזוהות לכל נקודת זיהוי בסדר הפוך טמפוראלית ממערך של מתמרי HIFU, רצוי אותם מתמרים שגילו את אות ה- PA. עיוות חזית הגל הנגרם מוריאציות במהירות הקול ייפתר באמצעות תהליך היפוך הזמן כך ששדה ה- HIFU המשודר יתכנס על הגידול. מכיוון שגלי ה- PA נוצרים מאזור הרקמה בו אנו מבקשים לבצע אבלציה, מתקבלת רמה גבוהה של דיוק. מחקרי פאנטום ראשוניים הדגימו את ההיתכנות של גישה זו. קיימות שתי גישות בהן ניתן להשתמש באופן אינדיבידואלי או ביחד בכדי לעקוב אחר התקדמות הטיפול באופן בלתי-חודרני. הראשונה מנצלת את תלות הטמפרטורה של מקדם גרונאייסן על מנת לדמות באופן לא-חודרני את האבולוציה המרחבית-טמפוראלית של פאזות ההתחממות וההתקררות של הטיפול. הגישה השנייה מבוססת על מעקב אחר שינויים בתכונות האופטיות והתרמו-מכאניות של הרקמה במהלך הטיפול ואחריו, בכדי לאמוד את האבלציה של הרקמה. מספר מחקרים שיישמו דגימות רקמה ex vivo הראו כי התכונות האופטיות של הרקמות הן תלויות-טמפרטורה, במיוחד מעל הטמפרטורה שבה מתרחשת קרישה, כאשר הפיזור האופטי גובר באופן משמעותי. מחקרים אלו מראים כי חשיפה ל- HIFU אמורה להוביל לעלייה מקומית וקבועה בקונטרסט הדימות PA מעבר לטמפרטורה זו. עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה שבו לזיית HIFU עברה אינדוקציה בכליה של עכבר חי הראה קונטרסט PA מופחת ב- 1064 nm. הסבר אפשרי לכך הוא כי למרות שהפיזור גבר, תהליך האבלציה עורר הפחתה רבה יותר בבליעה על ידי מים או דם, שני הכרומופורים העיקריים ב- 1064 nm. האפקט המאזן של HIFU הנראה ויזואלית ברקמות בעלות וסקולריות גבוהה הינו עקבי לכך. עם זאת, מחקר in vivo נוסף שנערך על עכברים דיווח על קונטרסט דימות PA גבוה יותר כתוצאה מחשיפה ל- HIFU למרות שהשימוש בננו-מוטות מזהב בכדי לספק קונטרסט ב- ROI עשוי להיות גורם מסבך השולל השוואות ישירות. הודגם בנוסף כי אפשרי לדמות לזיית HIFU ברקמות ex vivo באמצעות עירור מיקרו-גל, כאשר מקור הקונטרסט הוא שינויים בהשראה-תרמית במוליכות הרקמות, בשל התאדות המים.

image16 21

איור 15: דימות אוקולרי פוטו-אקוסטי in vivo. (a) תמונת B-scan PA אנכית שנרכשה לאורך הקו האדום האופקי ב- (c) המראה כלי דם ברשתית וה- RPE מתחת בעין של עכבר. (b) תמונת OCT שנרכשה סימולטנית המראה מאפיינים תואמים, (c) MIP לטראלי המראה את כלי הדם ברשתית על פני הדיסק האופטי. ה- HA מסמן הצללה הנובעת מעורק היאלואידי. (d) תמונת MIP לטראלית של כלי הדם בקשתית, בעין של עכבר. ספקטרוסקופיית אורך גל כפולה שימשה בכדי למפות חמצן רווי על פני האזור המלבני המסומן בקו צהוב מקווקו. (d) CP, תהליך קיליארי; MIC, מעגל קשתית גדול; RCB, שלוחה קורואידלית חוזרת; RIA, עורק קשתית רדיאלי.

7. פרה-קליניים

דימות PA יכול למלא תפקיד בתור כלי חקירה לא-חודרני לאפיון בעלי חיים קטנים כמו עכברים או חולדות. אלו נפוצים ביותר כפלטפורמה מחקרית לחקר של תהליכי מחלה אצל בני אדם ולפיתוח של תרפיות חדשות. דימות PA הינו מתאים במיוחד ליישום זה. הגודל הקטן של החיה פירושו כי דרישות עומק החדירה אינן מאתגרות במיוחד ומאפשרות SNR גבוה. הסקאלה המרחבית הקטנה מאפשרת תיעוד של אותות PA מסביב לכל הגוף של בעל החיים, ובכך לספק את אפרטורת הגילוי הזוויתית הגדולה הדרושה לשחזור תמונות באיכות גבוהה. גורמים אלו מאפשרים השגת תמונות אנטומיות ברזולוציה גבוהה עם קונטרסט גבוה כפי שניתן לראות באיורים 5 ו- 6.

אחד היישומים העיקריים הוא אפיון במודלי בעלי חיים קטנים של פגיעות מוחיות ותהליכי מחלה, במיוחד אלו הדורשים בחינה של האנטומיה והתפקוד הוסקולרי כמו שבץ, אפילפסיה וטראומות מוחיות. נערכו מספר מחקרים שיישמו את כל שלושת המצבים של דימות PA. ה- PAT  שימש כדי לדמות את האנטומיה הוסקולרית של מוח העכבר, התגובה ההמו-דינאמית הנובעת מגירוי של הזיפים, ואירועים אפילפטיים. ה- AR-PAM שימש בכדי לחקור וריאציות טמפוראליות באוקסיגנציית דם קורטיקלית על ידי שינוי מקטע החמצן הרצוי בכדי לעורר היפוקסיה והיפרוקסיה. שינויים המו-דינאמיים הנובעים מגירוי חשמלי נחקרו גם הם. ה- OR-PAM יכול לשמש לדימות של מוחות בעלי חיים קטנים, אך בשונה מ- PAT ו- AR-PAM הוא דורש הסרה של הקרקפת. הוא יושם בכדי לדמות sO2 ברמת הנימים במוח העכבר. מחקרי OR-PAM אחרים התמקדו בהדגמה כי ניתן לעקוב אחר אירועים המו-דינאמיים טמפוראליים-מרחביים כמו תנועת כלי דם (vasomotion) והתרחבות כלי דם (vasodilation) בעכברים. מפות של sO2 בדם וזרימה על פני כלי הדם נרכשו אף הן עם אפשרות לאמוד MRO2.

מודלי עכברים משמשים באופן נפוץ בכדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של מגוון גידולים בכדי לסייע להתפתחות הפרה-קלינית של תרפיות סרטן חדשות. האפיון של כלי הדם בגידול הינו חיוני ליוזמה זו. דימות PA מאפשר פוטנציאל לכך באמצעות יכולתו למפות באופן לא-חודרני את המבנה, האוקסיגנציה ומצב הזרימה של כלי הדם בגידול, כאשר לכולם יש השפעה משמעותית על התפתחות גידולים והתגובה התרפויטית. מספר מחקרים ראשוניים נערכו במטרה לדמות כלי דם אבנורמאליים בגידולים או את ההתפתחות של כלי הדם בגידולים במשך הזמן, כתוצאה מאנגיוגנזיס. מחקרים אחרים הראו כי ניתן לבצע ויזואליזציה של מלנומות תת-עוריות, על ידי ניצול הקונטרסט האינטרינזי או באמצעות סוכן קונטרסט ממוקד.

מחקרים פרה-קליניים אחרים כוללים דימות של האנטומיה הוסקולרית של עוברי עכברים, חקר של דינאמיקה קרדיו-וסקולרית ופרפוזיה בכליות.

לצד המידע המבני והפונקציונאלי, קיימת אפשרות להשתמש בדימות PA בכדי לזהות תהליכי מחלה ברמה המולקולארית או התאית באמצעות סוכני קונטרסט אקסוגניים וגנים מדווחים – דיווח מפורט לגבי דימות PA מולקולארי מוצג במחקרם של קים ועמיתיו. בקצרה, קיימות שתי גישות מרכזיות. הראשונה כוללת שימוש סיסטמטי בסוכן קונטרסט ממוקד המצטבר סלקטיבית ברצפטור ספציפי-למחלה כמו חלבון שטח-תא או אנזים. רכיב הבליעה של סוכן הקונטרסט יכול להיות צבע אורגני כמו ICG או פלורופור (פס הבליעה של הפלורופור מספק את מקור הקונטרסט). היתרון של פלורופורים הוא כי הם פותחו באופן אקסטנסיבי עבור דימות מולקולארי פלורוסנטי וניתן להשתמש בהם בכדי להתמקד בטווח רחב של רצפטורים תאיים ותוך-תאיים ספציפיים. החיסרון שלהם הוא חתך רוחב בליעה קטן יחסית ונטייה להלבין או להתדרדר כאשר הם מוקרנים עם עוצמות השיא המאפיינות פולסי לייזר עירור של PA. ננו-חלקיקים מטאליים כמו ננו-שלים, ננו-מוטות ומבנים אחרים מהווים חלופה מבטיחה. חתכי רוחב הבליעה של התהודה הפלזמונית יכולים להיות גבוהים יותר במספר סדרי גודל מאשר מולקולות צבע, ובאמצעות שינוי הפרמטרים הגיאומטריים שלהם, אורך הגל של שיא הבליעה שלהם ניתן לכוונון לאורכי גל NIR. בנוסף, בחלק מהמקרים, מבני ננו-חלקיקים (לדוגמא ננו-שפופרות פחמן בעלות דופן בודדת) יכולים להציג פוטו-יציבות גבוהה יותר מאשר צבעים אורגניים. מיקוד ספציפי באמצעות סוכני קונטרסט הודגם in vivo בגידולים באמצעות ננו-שפופרות, ננו-מוטות וכלובי זהב, בכדי לאפשר קונטרסט סלקטיבי. השיטה השנייה כוללת שילוב של גנים מדווחים מהונדסים המבטאים חלבוני בליעה אופטית בעכברים. תהליך זה מאפשר פוטנציאל לחקר של תפקידם של תהליכים גנטיים בנתיבי מחלות. ביטוי גן LacZ זוהה על ידי דימות PA באמצעות השינוי בבליעה האופטית של X-gal לאחר קטליזציה על ידי אנזים β-גלקטוסידאז מקודד- LacZ. עם זאת, תהליך זה דורש הזרקה מקומית של סובסטרט X-gal לתוך ה- ROI. דימות PA של תאים המבטאים חלבונים פלורוסנטיים (פס הבליעה של החלבון מספק את קונטרסט הדימות PA) הודגם באופן לא-התערבותי, אך רק בדג הזברה השקוף יחסית או בזבוב הפירות. מדווחים חדשים הבולעים באורכי גל גדולים יותר ב- NIR דרושים בכדי להשיג עומקי חדירה הדרושים עבור דימות של בעלי חיים קטנים כמו עכברים.

8. סיכום

במונחים של השגת תמונות אנטומיות תלת-ממדיות באיכות גבוהה על פני טווח של סקאלות מרחביות, ההיתכנות של דימות PA הודגמה מעבר לכל ספק. ב- 5 השנים האחרונות נעשתה התקדמות משמעותית בהתפתחות של מכשור, שיטות שחזור תמונות ודימות PA מולקולארי ופונקציונאלי, והתרגום ליישומים קליניים ואחרים כבר החל. עם זאת, קיימים מספר אתגרים בהם יש לטפל אם ברצוננו לממש את מלוא הפוטנציאל של שיטה זו.

אתגרים אלו, במונחים של פיתוח מכשירים, מקורם ברמת הרכיבים וברמה המערכתית. ברמת הרכיבים, קיים צורך ברסיברים רגישים בעלי פס רחב לגילוי PA, צורך עליו ניתן לענות באמצעות מתמרים פיאזו-חשמליים מתקדמים המבוססים על חומרים חד-גבישיים או חומרים פיאזו-מרוכבים המיועדים ספציפית בכדי לענות על דרישות רגישות הגילוי ורוחב הפס של דימות PA, במקום לבצע אדפטציה בלתי-אופטימאלית מיישומי אולטראסאונד אחרים. גישות חדשות המבוססות על חישת אולטראסאונד אופטית כמו חיישן ה- FP המתואר ב- §4.1.1 או שיטות אחרות, עשויות אף הן להיות רלוונטיות מבחינה זו. המחסור במערכות לייזר מתאימות מהווה צוואר בקבוק ידוע עבור התרגום הקליני של השיטה. עבור PAT ו- AR-PAM, Q-switched Nd:YAG pumped OPO, Ti Sapphire או מערכות לייזר בצבע נמצאו כאפקטיביות ביותר להדגמת ההיתכנות בסביבת מעבדה. עם זאת, הגודל שלהן, המחסור ביישומיות פרקטית (לדוגמא הצורך בכוונון מחדש), והצורך במערכות קירור חיצוניות ובתפעול על ידי כוח אדם מיומן מעכב את השימוש הפרקטי שלהן, במיוחד בנוגע לסביבה קלינית. בנוסף, המערכות המסוגלות לספק פולסים של אנרגיה במיליג’ול הדרושים ל- PAT בדרך כלל מאופיינות ב- PRFs נמוכים (פחות מ- 50 Hz). לצד הגבלת קצב הפריימים, בעיה זו מעכבת את ההטמעה של טכניקות עיבוד אותות בתחום-זמן כמו פלומטריית דופלר בפולסים, הדורשות PRFs גבוהים. מהירויות כוונון איטיות או טווח כוונון בלתי מספק גם הם מעכבים את היישום הפרקטי של שיטות ספקטרוסקופיות, ולפיכך את יכולת הדימות המולקולארית והפונקציונאלית של שיטה זו. קיימים מספר סימנים לכך שמתרחשת התקדמות בכיוון זה. נמצאו מספר יישומים עבור מערכות לייזר סיביות קומפקטיות וניידות עם PRF גבוה, אך חוץ מיוצא דופן אחד, רק ב- OR-PAM, מכיוון שאנרגיות הפולס של מרבית המערכות הקיימות אינן מספיקות לשימוש ב- AR-PAM ו- PAT. מערכות לייזר מבוססות-דיודה הודגמו אף הן עבור יישומי דימות שטחיים. למרות שהתקדמות בטכנולוגיית דיודת לייזר בפולסים בעוצמה גבוהה וסכמות עיבוד אותות חדשניות עשויות לשפר את היישומיות שלהן, גבול שיא העוצמה הנגרם בשל סף הנזק ל- facet ככל הנראה יגביל את השימוש בהן עבור דימות PAT ברקמות העמוקות באמצעות עירור פולסים. סכמות עירור חלופיות כמו אלו המבוססות על שיטות תחום התדרים עשויות לספק הזדמנות להתגבר על מגבלה זו.

ברמת המערכות, האתגר ב- PAT הוא להשיג קצב פריימים בזמן-אמת מבלי לפגוע ב- SNR. עבור PAT, קיים גבול מהותי. ללא קשר לזמינות של לייזרים מתאימים, שיקולים בטיחותיים מובילים לכך שבכדי לקבל קצב פריימים בזמן-אמת ואת ה- SNR הגבוה ביותר, נדרשים PRF של מספר עשרות הרץ וגילוי מקביל, מיצוב ורכישת אותות בכל הערוצים. הפעלת PRF גבוה וביצוע multiplexing בכדי להפחית את מספר הערוצים המקבילים הם אפשריים בדומה ל- US קונבנציונאלי. עם זאת, תהליך זה מוביל להפחתת ה- SNR מכיוון שנדרש להפחית את אנרגיית הפולס בכדי להגביל את העוצמה הבסיסית. עבור דימות תלת-ממדי, העשוי לדרוש ספירת ערוצים במערך דו-ממדי בסדר גודל של 104, העלות של מערכת מקבילה תהיה גבוהה מדי. האתגר, לפיכך, הוא למצוא פשרה אופטימאלית בין ה- PRF ל- SNR, multiplexing וקצב פריימים. שיקולים אלו רלוונטיים באופן עקרוני ל- PAT. שיקולים אחרים בנוגע ל- PRF ומהירות הרכישה רלוונטיים למצבי מיקרוסקופיית PA שאינם ברי-הקבלה באופן זמין.

שיטות ספקטרוסקופיות הינן רלוונטיות ביותר למימוש היכולת הפונקציונאלית והמולקולארית של דימות PA. למרות שנעשתה התקדמות רבה בפיתוח של אלגוריתמי היפוך, התיקון של ההשפעה המזיקה של תלות אורך הגל בזרימת האור עדיין מהווה אתגר משמעותי. סכמות היפוך מבוססות-מודל המסבירות באופן מלא את הפיזיקה המעורבת בהתחוללות אותות PA ותהליכי הגילוי הן מבטיחות, אך בצורתן הכללית הן עדיין יקרות מדי מבחינה חישובית עבור יישומים רבים. הגבלת התחום המרחבי, הצבת אילוצים על הפתרון עם מידע נוסף, קודם או אחר, ופיתוח אומדני אד-הוק תקפים עבור יישומים ספציפיים, עשויים להביא להתקדמות בשיטות אלו. כימות מדויק של ריכוזי כרומופורים הינו המטרה העיקרית של ספקטרוסקופיית PA כמותית והוא חיוני עבור מדידת פרמטרים פיזיולוגיים כמו sO2 בדם. עם זאת, שיטות ספקטרוסקופיות הינן חשובות אפילו אם נדרש רק לגלות, להבדיל מלכמת, את הנוכחות של כרומופורים ספציפיים. מצב זה נכון במיוחד בדימות מולקולארי, בהתחשב בריכוזים הנמוכים יחסית בהם מצטברים סוכני קונטרסט דימות ממוקדים או גנים מדווחים. היפוך ספקטרוסקופי מדויק או שיטות unmiximg יהיו חיוניות עבור גילוי רגיש של סוכני דימות מולקולארי, לאור תרומת ה- PA  העצומה של ההמוגלובין.

בדימות PA מולקולארי, הודגם מיקוד ספציפי באמצעות הצגה סיסטמטית של סוכני קונטרסט, וכיום מושקעים מאמצים רבים באופטימיזציה של רכיב התיוג של הסוכן באמצעות מגוון מבני ננו-חלקיקים. השימוש במדווחים גנטיים מהונדסים הינו כיוון מבטיח, לאחר שהודגם תוך שימוש במדווחים פלורוסנטים קיימים בכדי לספק קונטרסט PA. האתגר במקרה זה הוא לפתח חלבונים מבטאים גנטית הבולעים באורכי גל גדולים יותר בכדי לאפשר עומק חדירה רב יותר, יציבים תחת עוצמת השיא הגבוהה של פולסי לייזר העירור ב- PA , ושניתן לבטאם באמצעות תאי יונקים.

במונחים של יישומים ביו-רפואיים, דימות PA פרה-קליני כבר מבוסס בימים אלו ככלי מועיל המתחיל להיות מיושם בפועל, במקום להיות מודגם בניסויים. התרגום ליישומים קליניים הוא פחות מפותח, כתוצאה מכמות קטנה יותר של מחקרים קליניים, באופן חלקי בגלל הדרישות הקפדניות יותר במונחים של מהירות רכישה, ניידות וממשק מטופל-מכשיר. עם זאת, תודות להופעת מערכות קליניות מתאימות, במיוחד אלו המבוססות על סורקי אולטראסאונד דיאגנוסטיים קיימים, קצב ההתקדמות לקראת יישומים קליניים באונקולוגיה, דרמטולוגיה, רפאוה קרדיו-וסקולרית וסוגי התמחות אחרים הולך להתגבר בעתיד הקרוב.

דימות פוטו-אקוסטי ביו-רפואי

דימות פוטו-אקוסטי (PA), הנקרא גם דימות אופטו-אקוסטי, הינו מודאליות דימות ביו-רפואית המבוססת על שימוש באולטראסאונד לייזר, שהתפתחה במהלך העשור האחרון. זוהי מודאליות היברידית, המשלבת את הספציפיות בעלת הקונטרסט הגבוה המבוססת-ספקרטרוסקופ של דימות אופטי, עם הרזולוציה המרחבית הגבוהה של דימות אולטראסאונד. במהותה, תמונת PA יכולה להיחשב כתמונת אולטראסואנד שבה הקונטרסט אינו תלוי בתכונות המכאניות והאלסטיות של הרקמה, אלא בתכונות האופטיות שלה, ובפרט הבליעה האופטית. בשל כך, היא מאפשרת ספציפיות רבה יותר בהשוואה לדימות אולטראסאונד רגיל, עם יכולת לזהות המוגלובין, ליפידים, מים וכרומופורים בולעי-אור אחרים, אך עם עומק חדירה גדול יותר מאשר מודאליות דימות אופטי טהורה המסתמכת על פוטונים בליסטיים. לצד דימות של מבנים אנטומיים כמו המערכת המיקרו-וסקולארית, היא יכולה בנוסף לספק מידע פונקציונאלי בצורת אוקסיגנציה של הדם, זרימת דם וטמפרטורה. ניתן להשיג כל זאת בטווח רחב של סקאלות אורך, ממיקרומטר עד סנטימטר, עם סילום של הרזולוציה המרחבית. מאפיינים אלו מאפשרים שימוש בדימות PA בשלל יישומים ברפואה הקלינית, מחקרים פרה-קליניים וביולוגיה בסיסית עבור חקר הסרטן, מחלות קרדיו-וסקולריות, אבנורמאליות במיקרו-סירקולציה ומצבים אחרים. תודות למגוון תמונות in vivo שהושגו על ידי מספר קבוצות ברחבי העולם ב- 2-3 השנים האחרונות, הטכניקה השתכללה והפוטנציאל של דימות PA מתחיל כיום להתממש. ההישגים הבולטים האחרונים כוללים הדגמה של דימות כלל-גופני של בעלי חיים קטנים, הדגמה ראשונה של דימות מולקולארי, הצגת צורות חדשות של מיקרוסקופיה, והצעדים הראשונים לקראת דימות שד קליני, לצד שלל מחקרי in vivo של דימות פרה-קליני. במאמר זה אנו מציגים סקירה של העקרונות הפיזיים בבסיס השיטה, היישום הפרקטי שלה, ומגוון יישומים קליניים ופרה-קליניים.

1. סקירה כללית

המחקר לגבי הפיזיקה הבסיסית של דימות PA כולל היסטוריה ארוכה וספוראדית שהחלה ב- 1880, כאשר אלכסנדר גראהם בל גילה לראשונה את אפקט ה- PA לאחר שהבחין בהתחוללות קול לאחר בליעה של אור-שמש מאופנן. לאחר מכן נערכו מחקרים מועטים בלבד או התפתחויות טכניות, עד הפיתוח של הלייזר בשנות ה- 60, שסיפק את עוצמת השיא, טוהר ספקטראלי והכיווניות הנדרשים עבור יישומי PA רבים. גל של יישומי חישה תעשייתיים ומדעיים החל לצבור תאוצה בשנות ה- 70 וה- 80. עם זאת, יישומים אלו ניצלו את סוג התא העקיף של פאזת הגז של גילוי PA, שבה גלים אקוסטיים המתחוללים בגז ונגרמים על ידי משטח מחומם בלייזר מתגלים באמצעות מיקרופון. תהליך זה...

295.00 

מק"ט 24332784d506 קטגוריה
מק"ט 24332784d506 קטגוריה

295.00 

סיוע בכתיבת עבודה מקורית ללא סיכונים מיותרים!

כנסו עכשיו! הצטרפו לאלפי סטודנטים מרוצים. מצד אחד עבודה מקורית שלכם ללא שום סיכון ומצד שני הקלה משמעותית בנטל.