ואי. דוידוב ועמיתיו מחקר בתחום המוטציות הגנטיות Y. Davidou et al. – Mutation research1

Y. Davidou et al. / Mutation Researtch 466 (2000) 97-107

ואי. דוידוב ועמיתיו / מחקר בתחום המוטציות הגנטיות 466 (2000) 107-97

זן חיידק האשריכיה קולי DPD1707, מהווה אינטגרציה כרומוזומלית שלמה, לפרומוטר (אתר מקדם) של חלבון Reca מסוג אשריכיה קולי אל הפרומטר המיועד לחיידק המדווח הפתוגני והזוהר lux CDABE בזן המארח JC7623 [17]. הזן הזה נבנה מקודם, בשיטה שכבר תוארה [18], בעזרת הפלסמיד pDEW14; הפלסמיד הזה הורכב באמצעות קשירת קטע זעיר של אנזימי ההגבלה Psti ו- EcoRI, המכיל בתוכו מיזוג של luxCDABE ו- recA, שהופקו מהפלסמיד pDEW65 והוחדרו אל פלסמיד pBRINT.Cm [19]. הפלסמיד pDEW65 נוצר כבר בעזרת קשירת הקטע המכיל אתר קדם-מפעיל של recA, מוחדר אל תוך האנזים BamHI ואל הפלסמיד pJT205 [20] המתעכל במלח. את האתר קדם-מפעיל של recA, הוא הושג כבר בהגברת PCR תוך שימוש בתבנית pRecALux3 [12]. הזן DPD1707 שומש כמסייע במוליכות כללית מתווכת של P1vir [21] עם התמחות לעמידות כלורמפנקול בבניית הזנים הבאים של אשריכיה קולי: DPD1718, DPD1717 ו- DPD1709.

זן האשריכיה קולי DPD1718, נבנה בעזרת הזן DPD1692 (עמידות החיידק Lac- בפני קנמיצין; מבחר מעבדות לגניטיקה של מיקרואורגניזמים – דופנט) בתור הקולט/מקבל את הולכת הפאג’ P1vir (phage – נגיף תוקף חיידקים) הגדל בתוך הזן DPD1707. מיזוג של הל- lux יחד עם recA בתוך הזן DPD1718, מותאם להשתלב במיקומו של האנזים הבין-תאי lacZ של האשריכיה קולי, והוא מכוון בצורה כזאת שהאופרון lacZYA יתפוס כיוון-זוויתי זהה לזה של השעתוק הגנטי. כשמוסיפים 30 µg/l של חומצה נלידקסית, מעקב גירוז DNA יעורר בחוזקה את תגובת ה- SOS [22] אצל קהילת החיידקים הצומחת של DPD1718 הגדל בטמפ’ 37ο במדיום/סביבה פוגל-בונר, בצירוף גלוקוזה המהווה מקור פחמימני [23] שנוצר עקב הארה ביולוגית החזקה פי 60 מהרגיל, למשך 120 דק’ אחרי הוספת החומצה – הדבר נותן תוקף לכך שאכן נעשית בקרה מוצלחת על שעתוק הגנים במיזוג הזה המתרחש ע”י הפרומטור recA. הוספה של 1 מ”מ אנלוג של לקטוז (IPTG), אל קבוצת חיידקי DPD1718 הגדלה באופן מעריכי-לוגרתמי, בטמפ’ של 37ο באותו המדיום, תגרום להגברת ההארה הביולוגית פי 60, למשך 120 דקות אחרי ההוספה, וזה נותן אות לכך ששעתוק הגנים של ה- lux במבנה הזה, גם הוא נשלט באמצעות אתר קדם-מפעיל של הלקטוז. זה בלתי סביר שהכימיקלים שהשתמשו בהם במחקר הזה, הם אלה שעוררו את פעולת השעתוק מהפרומוטר של הלקטוז, זאת בגלל עוצמת ההשראה הגבוהה שנצפתה (עם הכימיקלים שנבדקו) חרגה מהרמה המתקבלת מגורם ההשראה אופרון לקטוז IPTG.

הזן 1714DPD של אשריכיה קולי, והזן 1709DPD, נבנו בעזרת הזנים 800DM {F-, metA28, lacY1 או 4Z, thi-1, xyl-5 או 7-, galK2, tsx-6} [24], ו- 803DM {lexAind של 800DM} [24] בהתאם, כגורמים קולטי הולכה, בעזרת הפאג’ P1vir הצומח בזן 1707DPD. קידוד ה- lexAind הוא בלתי נפרד מה- LexA, המדכא את הצירוף הגנטי מושרה SOS [22].

זן האשריכיה קולי 3063DPD, מכיל מבנה כרומוזומלי החדיר לאתר המקדם של recA ממוזג עם המדווח laxCDABE של ויבריו-פישרי, במקום שבו נמצא האנזים lacZ; הוא כבר נבנה בעזרת הפאג’ P1vir הגדל בזן 3062DPD (בתור המסייע) וגם בעזרת זן האשריכיה קולי 3110W (פרוטוטרוף -F) [25] בתור ‘מקבל’ עם בחירה/התמחות לעמידות בפני קנמיצין. לפני השלב הזה, זן האשריכיה קולי כבר נוצר בעזרת שיטה שתוארה קודם לכן [18], תוך שימוש בפלסמיד pDEW100 שנבנה בעזרת קשירת קטע זעיר של 8.6 קז”ב (קילו-זוגות-בסיסיים) מהקטע ‘BamHI ו- PstI’ של pRecALux3 [12] אל פלסמיד pBRINT.Km [19].

2.2. תנאי מחקר, מדידת דרגת לומינסנציה, ניתוח נתונים

לפני שהתנהל המבדק הזה, הזנים של מבחן החיידקים, צמחו ממש מהר במשך לילה אחד במרק LB [21], בטמפ’ של 26ο (או 37ο) לפי מבחן הזנים (טבלה 1). בכך צנח מספר התאים עד ל- 107 תא/מ”ל בקירוב, וצמחו מחדש מתחת לאותם תנאים, עד שהתא הממוצע קיבל דרגת צפיפות של 2 × 108 מ”ר. גם הקנמיצין במינון של 25 מ”ג/ליטר נכלל בצמיחה הזאת של הזנים במדיום, וזאת כדי לוודא ולאפשר תחזוקת הפלסמיד; אך הקנמיצין נשמט מתהליך הצמיחה החוזרת, וזאת עקב גורם ההגדלה של פעולת לומינסנציה (ס. בלקין – מידע שלא פורסם). הבקרה והשליטה הממושכות – בזנים נושאי פלסמיד – הראו שלא אירעה נסיגה בדרגת העמידות בפני קנצימין, ומשמעות הדבר היא שרמות הפלסמיד לא ירדו במשך התקופה הקצרה של המבדק.

כל הדגימות שנבחנו, הושמו בדרגת 7.0 PH. מספר סדרות הזנים הופחת פי שניים, במרק LB, והוכנו בתוך צלחות מיקרוטיטר בצבע לבן עמום (דיינטק, צ’נטילי ; ורג’יניה, ארה”ב), כדי שבסוף לקבל נפח נפח סופי של 50 µl בכל אחת מה”בארות” (נעשה כאן שימוש במרק LB כאמצעי בקרה ושליטה). בכל אחת מהבארות נוספה השעיה של 50 µl לתאים הראשונים הגדלים באופן מעריכי. והזנים כאן נכנסו לדגירה בתוך הצלחות בטמפרטורה מבוקרת של 26ο (או 37ο – ראה טבלה 1) במכשיר לומינומטר (לוסי ל, אנתוס לבטק, אזברג ; אוסטריה).

הערכים/התוצאות של הלומינסנציה הוצגו ביחידות אור שרירותייות יחסית, או ביחס הלומינסנציה של הדגימה המושרית אל הדגימה שעברה בקרה בלתי מושרית (יחס התגובה) כמו שהזכרנו קודם לכן [8,29]. יחסי התגובה המקסימליים מייצגים את היחסים המקסימליים שהושגו במהלך הקורס של המחקר. 200EC נחשב לריכוז הדגימה המקסימלי בכדי להכפיל פעמיים את יחס התגובה המקסימלי. כמו שתיארנו קודם [לפי הנזכר ב- 8,29,30], השימוש בערכי 200EC היה כך שהוכתבו ע”י ייצוג ערך ידוע כמו גמא (г) כפונקציה של ריכוזי הדגימה. מתמטית, מגדירים את גמא ככה: (Is – I0)/I0, כך ש- Is הוא הלומינסנציה המקסימלית המתקבלת עבור ריכוז נתון S של הדגימה. I0 מייצג את הלומינסנציה של הבדיקה באותו רגע של זמן. כאשר 1 = г, ריכוז הדגימה יהיה שווה לערך של 200EC.

כל ניסויי המחקר התנהלו בעותקים/זוגות וחזרו על עצמם פעמיים לפחות – מקסימום 3 פעמים – בתאריכים שונים, ותוך כדי שימוש בקבוצות שונות של תאים. ערך החלוקה הטיפוסית של העותקים, היתה קטנה מ- 5%.

2.3. אלגינטים מקובעים חסרי-תנועה

את המנות המייצגות מספרים שלמים, של הקהילה הגדלה באופן מעריכי, בערך של 5 מ”ל, השתלבו בעדינות עם סודיום אלגינט (סיגמא) בנפח שווה, והוסיפו טיפה (רמות של 35-40 µl לטיפה) של 0.2 מול CaCl2 אל תוך התמיסה המוקצפת ברציפות. חרוזי הקלציום-אלגינט, שהושגו וקיבלו צורה באופן מיידי, עברו רחיצה במשך שעות, בתוך תמיסת CaCl2 אקזוטית (נפח 0.2 מול), בטמפרטורה של 4ο, ואוחסנו מתחת לאותם תנאים שוב ושוב.

2.4. שפכים תעשייתיים

דגימות מי-שפכים כבר נוטרלו לדרגת 7 = PH; הן סוננו ועברו סטריליזציה (נפח נקבובית = 0.22-µm) והוקפאו עד לרגע תחילת המבדק. הבדיקה כללה צלחות מיקרוטיטר (כמו שנזכר בסעיף 2.2 לעיל), עם הפחתה פי 2 בזני הסדרות שבמרק LB. רמת הרעילות של הדגימות נקבעה על סמך בדיקת פעילות ביולוגית – ביואסיי (Microtox® bioassay) [31,32] תוך שימוש בתכשירים מיובשים בהקפאה מסגנון ויבריו-פישרי שנרכשו מחברת ‘אזור אינווירמנטל’ (קרלסבד, קליפורניה, ארה”ב). טכניקת ה”מיקרוטוקס” כללה תבנית של צלחת מיקרוטיטר במנגנון דומה לזה שהתנהל ע”י בלייס ועמיתיו [33].

2.5. כימיקלים

הכימיקלים שהשתמשו בהם במהלך הבדיקות הללו, היו כולם בסקלה אנליטית. הכימיקלים הבאים, מימן על-חמצני (H2O2), מיתומייסין C (MC) ומיתיל-3-נייטרו-1-נייטרוסוגנידין (MNNG), נרכשו מהחברות מרק, סיגמא ו-פולקה, לפי הסדר.

הערת המתרגם – תרגום של המילים המופיעות בגרפים, מתוך עמוד 2 מקובץ המקור:

לומינסנציה – בעוצמת RLU  LUMINESCENCE (RLU)

הזמן (דקה)  TIME (min)

גורם משרה (µg/l) INDUCER (µg/l)

יחס תגובה RESPONSE RATIO

גמא GAMMA

גרף1: תהליך של דטרמינציה גנוטוקסית תוך כדי שימוש ב- recAˈ: הזן לחיסוי לאקס (3063DPD). גרף A: הקינטיקה של התפתחות האור תוך כדי עליית ריכוזי ה- MC. גרף B: ייצוג של יחסי תגובה מקסימליים כפונקציה של ריכוזי MC, H2O2 ו-MNNG. גרף C: חישוב ערכי 200EC לפי הנתונים בגרף-פאנל (Panel) B. ראה, בסעיף 2, תיאור לאיך מחשבים את ערכי גמא.

3. תוצאות המבדק

3.1. קינטיקה של הפקת אור, וניתוח נתונים

במהלך הקורס של המחקר, נעשה שימוש  בשלוש תרכובת למען השוואה יזומה, בין מבנים שונים של חיידקי אשריכיה קולי: MC, H2O2 ו-MNNG. כדי לפשט את תכונות ומאפייני האור המופק לפי פרומטר תגובת ה- SOS, התיאור הוא כזה שחיידק האשריכיה קולי נושא לאקס מתחת לאיום של תופעות גנוטוקסיות – ראה גרף 1 המבאר את תגובת הזן 3063DPD למודלי השראה. הקינטיקה של התפתחות הלומינסנציה בריכוזי MC שונים, מיוצגת בגרף 1A. ובגרף 1B מיוצגים יחסי התגובה כפונקציה של ריכוזי שלושת התרכובות. אפשר לראות דפוס מאוד דומה לתגלית הזאת במקרה ואם ערכי הלומינסנציה המקסימליים נוצלו במקום להשתמש ביחסי תגובה (לא מוצגים). בתוך הגרף 1C, אפשר לחשב את 200EC לפי ניתוח נתונים בגרף 1B. ערכים אלה – המייצגים את ריכוזי הדגימה – גורמים להגברת אפקט הלומינסנציה כפליים, והם נחשבים למאפיינים טיפוסיים עבור כל מבדק של זוג גנוטוקסים/זנים. כשעושים השוואה בין פעולות זנים שונים החשופים לאותו מקור השראה, ערכי 200EC הנמוכים ביותר מראים רגישות יותר גבוהה,וגבול גילוי (עבור הזן הנבדק) נמוך פי 3. כשמשווים בין תגובות שונות עבור זן יחיד, לתרכובות שונות, הערכים הנמוכים ביותר של 200EC מרמזים על אקטיבציה גנוטוקסית גבוהה יותר, מצד הכימקלים הנבחרים.

3.2. בקרת ה- LexA על התגובה הלומינסנצטית

כדי לוודא שהתגובה הלומינסנצטית שנמדדה תוך כדי נוכחותם של סוכני נזקי DNA, היא באמת נחשבת לתגובת SOS מסודרת ותקינה, יהיה עלינו לבחון את מהלך האינטגרציה הכרומוזומלית של ה- recAˈ: מיזוג  הלאקס בתוך זוג איזוגני של מארחי אשריכיה קולי, DPD1714 (lexA+) ו- DPD1709 (lexAind). קידוד ה- lexAind הוא בלתי נפרד מ- LexA, המדכא את הצירוף הגנטי של פעולת SOS מושרית. קיומה של SOS מושרית, דורש לפצל ולהפריד LexA ע”י פעילות אקטיבית של חלבון RecA [22]. שני הזנים עברו לומינסנציה, אך הרקע של פליטת האור של המוטציה, היה נמוך לפחות פי 10 מהטיפוס הפראי, כפי שרואים בגרף 2, המבאר את תגובת שני המבנים לריכוזי מימן על-חמצני שונים; הלומינסנציה של מוטציית lexAind דוכאה, בעוד זאת של זן lexA+ קיבלה השראה. קיבלנו תוצאות דומות עבור MC וגורמי השראה אחרים שלא הצגנו; זה סימן לכך שהלומינסנציה מגיבה לגנוטוקסים של ה- recAˈ שעבר אינטגרציה: מיזוג הלאקס (lux) במבנים שהזכרנו, מתווָכים ע”י מנגנון SOS של RecA/LexA של אשריכיה קולי.

הערת המתרגם – תרגום של המילים המופיעות בגרפים, מתוך עמוד 3 מקובץ המקור:

יחס תגובה RESPONSE RATIO

רמת ריכוז (µg/l) CONCENTRATION (µg/1)

גרף 2: השראה של recAˈ – קיומו של הלאקס זקוק לנסיגה ברמת LexA: הזן 1709DPD (lexAind, מדכא מוטציית LexA, לא מופחתים אחרי גרימת נזקים ב- DNA) לא מושרה ע”י מימן על-חמצני וזה בניגוד למה שקורה אצל הזן האיזוגני 1714DPD.

גרף 3: מוטציית A tolC מעלה בצורה דרסטית את רמת הרגישות כלפי MC אך לא כלפי H2O2. הזנים 2797DPD ו- 2794DPD, הינם זנים איזוגניים – יוצאת מן הכלל היא מוטציית tolC בזן הראשון.

3.3. דיכוי זרימת שפכים בעזרת מוטציית tolC

אחד הקשיים הגדולים האפשריים בהערכת מידת פוטנציאל הרעילות של אחד מהכימיקלים הידועים, או לדגימות בלתי ידועות, טמון בדרגת החדירות של המחסומים המתהווים באמצעות הקרום הבקטיריילי, מה שמגביל מאוד את הגישה של הרעלן אל מקרו-מולקולת היעד. הבהרנו שהשימוש [14] בזן המארח של אשריכיה קולי, בצירוף מוטציית tolC [34], גרם לירידה בגבול הגילוי/איתור של הזן הסנסורי, מה שנותן מחסה והגנה ל- grpEˈ: מיזוג הלאקס. נעזרנו באותה שיטה/גישה במחקר הזה, כלומר זני אשריכיה קולי איזוגניים: DPD2794 (tolC+) ו- DPD2797 (tolC) שהוא בעל פוטנציאל מוגבל לשאוב ולהשפריץ החוצה מולקולות בלתי רצויות [34]. גרף 3: מייצג את תגובת שני המבנים של התרכובות H2O2 ו- MC; כך שעבור השניה מהם (ולא הראשונה) מוטציית ה- tolC מאוד משפיעה על סף התגובה, ובכך תשפיע על רגישות האיתור.

3.4. העתק עבור מקדם – מיזוג הוקס: פלסמיד רב-העתקי או אינטגרציה כרומוזומלית

הזנים [12] הסנסוריים המקוריים של הגנוטוקסיה בהארה ביולוגית, מייצרים מחסה והגנה עבור מיזוגי הלאקס, בעזרת פלסמיד רב-העתקי. וזאת משום שהם ממקדים ומשפרים את עוצמת/ריכוז התגובה הנצפית, אבל לא משאירים הזדמנות לחוסר איזון בעמידותו של האלמנט הגנטי-כרומוזומלי הנוסף. חסרון נוסף אפשרי, של הבסיס הפלסמידי הרב-העתקי, הוא אובדן התגובתיות כלפי מוטיב רגולטורי עקב פעולת טיטרציה של מאות מספר של מיזוגים המכילים קדם-מפעיל בשלב “מתוקן” של הגורם המדכא. הזן 3063 (גרף 1) משלב באינטגרציה כרומוזומלית שלמה, העתק יחיד של אותו ה- recAˈ: הסגמנט לאקס נמצא בזן הממזג 2974DPD הרב-העתקי של נשא הפלסמיד. האינטגרציה הכרומוזומלית של העתק יחיד, בד”כ הביאה לתקופת פיגור ארוכה יחסית להפחתת רמות הלומינסנציה – בשני המצבים שעברו / לא עברו השראה – ולהגברת יחסי התגובה ושיפור או לתמיכה ברגישות. 2 הנקודות שנזכרו בסוף (שתי התוצאות הישירות לרמות לומינסנצטיית-רקע יורדות), תוארו בגרף 4 שמשווה בין יחסי התגובה של הזן 3063DPD (אינטגרציה כרומוזומלית) לאלה של הזן 2794DPD (פלסמיד רב-העתקי), בצירוף של ריכוזי MC שונים.

3.5. הגדלת טווח הטמפרטורות בעזרת גורם מדווח שונה: חיידקים זוהרים במקום לאקסים ויבריו-פישרי

אחת הבעיות שנתקלים בהן ברוב המקרים, היא לצרף חיידק אשריכיה קולי מאיר בשביל שימוש בטווח “גמיש” של טמפרטורות עבודה: הטמפ’ המקסימלית לפעילות האנזימים המאירים הויברו-פישרי, יותר נמוכה מ- 37ο הדרושה לפעילות “נורמלית” של האשריכיה קולי. אחד הפתרונות שעלולים לעזור, הוא סיפוק מערכת לאקסים של חיידקים זוהרים [35], שממילא פעילים בטמפרטורה שכזאת. החיידק הפתוגני הזוהר luxCDABE של האשריכיה קולי, עבר אינטגרציה כרומוזומלית שלמה בשביל ליצור את הזן 1718DPD. כאשר השוו בין תגובתו של הזן 1718DPD לשלושת מודלי ההשראה בטמפ’ של 37ο, אל פעילותו של הזן 3063DPD בטמפ’ 26ο, התברר שיש כאן יתרון בזמן התגובה שבלט בצורה מובהקת; הדבר תואר בבהירות בגרף 5 לגבי ה- MC. כאשר נעשתה השוואה בין 2 הזנים בטמפרטורה של 26ο, ה- 1718DPD המשיך להגיב בצורה יותר מהירה מאשר 3063DPD למרות שההבדלים ביניהם פחות נזכרים (לא הוצגו). בשתי הטמפרטורות, 1718DPD הראה לומינסנצטיית-רקע גבוהה יותר (לא הוצגה), מה שגרם ליחסי-תגובה יותר נמוכים, ובכך להביא לגבול גילוי יותר גבוה. היתרון ברווחי-זמן של התגובות, טמון בקיזוזם של ערכי הרגישות.

הערת המתרגם – תרגום של המילים המופיעות בגרפים, מתוך עמוד 4 מקובץ המקור:

יחס תגובה RESPONSE RATIO

רמת ריכוז (µg/l) CONCENTRATION (µg/1)

לומינסנציה – בעוצמת RLU  LUMINESCENCE (RLU)

הזמן (דקה)  TIME (min)

גרף 4: אינטגרציה כרומוזומלית של recAˈ: מיזוג הלאקס מפחית מגבול הגילוי. הזן 2794DPD – פלסמיד רב-העתקי מבוסס מיזוג; 3063DPD – מייצג אינטגרציה כרומוזומלית חד-העתקית בתהליך המיזוג.

גרף 5: השימוש בחיידקים זוהרים מסוג לאקס (lux), כגורם מדווח, הביא לתגובה מוגברת/מואצת יותר. הזן 3063DPD – לאקס ויבריו-פישרי בטמפ’ 26ˈ. 1718DPD – של לאקס זוהר, בטמפ’ 37ο. MC (50 µg/l) משומש בתור גורם השראה.

3.6. להחליף את המארח החיידקי אשריכיה קולי בחיידק מסוג טיפימוריום

למרות שהאשריכיה קולי נותן תוצאות מבחן משביעות רצון כאורגניזם, השימוש בטיפימוריום (typhimurium), בתור זן סנסורי, מביא כנראה לפעילות יותר אקטיבית, עקב נטייתו הכללית כאורגניזם לקבל ולעמוד במוטציות גנטיות שונות במבחן איימס (היפוך/אטביזם ההיסטידין) [3], וזה בנוסף לשימושו האקטואלי בבדיקת Vitotox® [10,11]. לשם כך, הזן Sal94 מסוג טיפימוריום, נבנה במבדק הזה, בצורה שהוא מכיל את אותו ה- recAˈ: פלסמיד נושא לאקס, כמו זן אשריכיה קולי 2794DPD. ה- Sal94 – וללא קשר למקור ההשראה – הראה באופן מתמיד תגובה גוברת ברווחי הזמן (גרף 6). הוא גם הראה רגישות עולה כלפי H2O2, אך הראה רגישות יותר נמוכה כלפי MC ו- MNNG (לא הוצג).

3.7. מידת הפוטנציאל לקיבוע פולימרי

ניתן לחזות מספר של אפשרויות למטרת שימושים בזמן אמת ביישומים און-ליין, של תאים סנסוריים מתחת להשגחה/ניטור גנוטוקסית. אחת מהאפשרויות האלה, טומנת בחובה קיבעון בתוך הפולימרים החוץ-תאיים. בנסיון מקדים שנעשה כדי לקבוע אם הזנים הללו המגיבים לרעלנים, יהיו חסינים לטיפול שכזה, קהילות המבדק נארזו באלגינטים והתייצבו מתחת למשטר תחזוקה. כאשר אוחסנו בתמיסת CaCl2 בטמפ’ של 4ο, התאים המשיכו להיות אקטיביים לתקופות ממושכות, אבל זה בא במחיר של השהיה ארוכה של תגובה, ובהפחתת צפיפות הלומינסנציה. גרף 7: סיכומי תוצאות של אחד מניסויי המחקר המצרף בתוכו את הזן 2797DPD (tolC, מיזוג של לאקס ויבריו-פישרי בפלסמיד רב-העתקי). במהלך החודש הראשון, נצפתה ירידה בערכי הלומינסנציה המקסימליים וביחסי התגובה, אבל אלה היו תוצאות שוליות; בעוד שתקופת הפיגור הוכפלה מ- 1 עד 2 שע’. ערכי ה- 200EC לא הושפעו בצורה חזקה, בזמן האיחסון (לא הוצג). במהלך החודש השני, כל שלושת הפרמטרים חוו ירידה משמעותית, ואחרי 60 יום יחס התגובה קיבל עוררות מריכוז של 100 µg/l MC שירד לערך של 1.8 בקירוב. אחרי תום החודש השלישי – ולמרות שהתאים עדיין מתחת להשפעת לומינסנציה – התגובתיות כלפי MC היתה מאוד חלשה, והושעתה ליותר מחמש שעות.

הערת המתרגם – תרגום של המילים המופיעות בגרפים, מתוך עמוד 5 מקובץ המקור:

לומינסנציה – בעוצמת RLU  LUMINESCENCE (RLU)

הזמן (דקה)  TIME (min)

תקופת פיגור (דקה) או יחס תגובה LAG TIME (min) or RESPONSE RATIO

זמן אחסון (יום) STORAGE TIME (day)

גרף 6: השוואה בין מין טיפימוריום Sal94 ובין אשריכיה קולי 2794DPD כמארח עבור recAˈ: פלסמיד לאקס. ה- MC (100µg/l) בא בתור גורם משרה.

גרף 7: תגובתיות כלפי MC (100µg/l) מצד תאים המוטבעים בתוך אלגינטים של הזן 2797DPD, כפונקציה של זמן אחסון בטמפ’ של 4ο.

3.8. גבול גילוי עבור כימיקלים אחרים

הטבלה 2 מראה לנו את 200EC עבור הרבה כימיקלים; רובם ידועים כגנוטוקסנים (או מעלים את החשד שהם כאלה) [36,37], שהושגו באמצעות בחירת זנים מאלה המתוארים בטבלה 1. בנוסף לשלושת מודלי התרכובות ששומשו בדוגמאות המוצגות לעיל, הטבלה 2 מכילה שתי קבוצות מייצגות את הכימיקלים המאפיינים את הסביבה המסויימת: פינול ועוד כמה נגזרים, והלומתאנים. 2 זנים מתפקדים ברמות הכי נמוכות של גילוי מקום (הדבר נכון, לפחות בנוגע לתרכובות המועלאות בטבלה 2): 3063DPD ו- 2797DPD. בעוד שזנים אלה, הראו תגובות חיוביות עבור איימס-שליליות (תוצאות שליליות במבחן איימס) – פרט למקרה בודד בלבד – כל הכימיקלים האלה נשמרו/נקלטו מקודם, כגנים רעילים פוטנציאליים עבור לפחות אחת מבדיקות הביואסיי הקיימות; מצב חריג אחד מוזכר בטבלה 2: אין בנמצא נתונים חד-משמעיים שיכולים להוכיח, או להפריך, שהחומר 2,3-דיכלורופנול איימס-שלילי מהווה פוטנציאל גנוטוקסי. לא קיימות תוצאות שליליות שהן לא נכונות – לא נרשמו כאקטיביות מבחינה גנוטוקסית – שלא עוררו שום השראה בשום recAˈ: מבדק זנים של לאקס (lux). הרשימה כללה סגנונות מגוונים של Na+ ו- K+ אי-אורגניים, מלחי Ca2+, חומצות אורגניות (חומצות אצטיות, סליצליות), ממסים (מתנול, הקסאן, דקאן, פקסילין, ו- 1,1 דיכלורומתאן), שתנן, בנזינים מוכלרים, סוכרים (גלוקוז, סרקוז), חומצות אמיניות (גליצין, אלנין), ועוד.

3.9. שפכים תעשייתיים כימיקליים

אפילו התגובות הנחשבות כאידאליות עבור ממסים מוגדרים וידועים, עד כמה שהן יכולות להיות רגישות, אבל הן לא מבטיחות שלבי ביצוע מספקים מול דגימות מרוכבות (שבד”כ נכללו במסגרת הקורס בתחום ההשגחה הסביבתית). משום כך, כמה מהזנים שנבחרו לבדיקה, נבחנו תוך שימוש בדגימות מרוכבות מהמאגר הגדול של מקורות שפכים תעשייתיים – ניתן לראות דוגמא למידע שהושג, בגרף 8. הסט שנבחן כלל 20 דגימות נפרדות שנאספו ברציפות במשך 10 ימים, החל מחודש פברואר עד מרץ (1994), מן השפכים הנכנסים והשפכים היוצאים, בטיפול ביולוגי (ריאקטור אנאירובי) של צמחים בטיהור מי השפכים של מתקני יצור. השפכים הנכנסים התאפיינו בממוצע טעינה-אורגנית של מומסים, השווה ל- 640 מ”ג C/1; סה”כ המוצקים המומסים עמד על 1050 mg/l. ויש עוד רמה גבוהה יחסית (EC50: 1.5%) של רעילות שנצפתה בבדיקת הפעילות הביולוגית (Microtox®) [31,32]. ולהפך, השפכים היוצאים, לא הראו שום רעילות של Microtox®; ובעוד שקשריהם המינרליים לא הראו שום שינוי, התעוררה הפחתה ברמת הפחמן האורגני המומס, בממוצע של עד 18 mg/l. גרף 8 מראה יחסי השראה של הזן 2794DPD, כתגובה לסדרות הדגימה (כולם השתוו ל- 10% מרמת הריכוז). כל הדגימות הגלמיות של מי השפכים, הציגו פעילויות אקטיביות שונות (אבל ברורות) של השראת SOS, ובכך הן מרמזות על אפשרות למצב גנוטוקסי. בכל מקרה, האקטיביות הזאת כבר נוטרלה לגמרי ע”י פעילות ביולוגית במהלך הטיפול בעזרת צמחים. ובמהלך המבדק (שלנו לפחות), השפכים היוצאים לא הכילו שום סכנה גנוטוקסית נשקפת בזרימת השפכים הנכנסים, כי הם כבר נוטרלו או הופחתו, במהלך הטיפול הזה.

טבלה 2

ערכי 200EC עבור אוסף של כימיקלים נבחרים

התרכובת	מספר CAS	מבחן זנים	ECb200 (mg/l)	מבחן איימס	עוד מבחני עקה גנוטוקסית
MC	50-07-7	DPD3063	10-4 ± 8 × 10-5	+	ND
MNNG	70-25-7	DPD2797	0.05 ± 0.025	+	ND
H2O2	7722-84-1	DPD3063	0.8 ± 0.5	+	ND
פנול	108-95-2	Sal94	16	–	+
טריכלורו-פנול	88-06-2	DPD2822	10 ± 3.5	–	+
ניטרופנול	100-02-7	Sal94	0.25	–	+
דיכלורופנול	576-24-29	DPD3063	50	–	ND
פנטה-כלורו-פנול	87-86-5	DPD3063	0.008	–	+
כלורו-דיברומו-מתאן	124-48-1	DPD3063/DPD2797	20 ± 8	–	+
ברומו-דיכלורו-מתאן	75-24-4	DPD2797	100	+	+
כלורופורם	67-66-3	DPD3063	300	–	+

aהזן המייצג את ערכי ה- 200EC הנמוכים ביותר שהושגו.

ערכי bEC200 עבור הזן שנזכר בעמוד הקודם. הנתונים מייצגים תוצאות עם ממוצע סטיית תקן (±) מסויימת (עבור שלושת ניסויים-מחקריים נפרדים, או יותר), או שהם מייצגים ממוצע בלבד (רק עבור 2 ניסויים). כל ניסוי נפרד, כלל פעילות שכפול.

cנתונים מאת זייגר (Zeigr) [37]. סימן (+) מייצג תגובה חיובית , סימן (-) מייצג תגובה שלילית.

dנתונים מאת זייגר [37]. סימן (+) מייצג תגובה חיובית ,בלפחות באחד מהמבחנים הבאים: קהילות של אוגרים סיניים תוך התייחסות לסטיה כרומוזומלית חוץ-גופנית, התייחסות חוץ-גופנית לחילופי כרומטידות-אחיות של אוגר סיני, מוטציה בתא לימפומתי של עכבר, או ‘גן רצסיבי-קטלני קשור למין (sex) הנמצא בתסיסנית’. אין מידע על ND.

הערת המתרגם – תרגום של המילים המופיעות בגרף, מתוך עמוד 6 מקובץ המקור:

יחס תגובה RESPONSE RATIO

התאריך DAT

פב’ Feb

מרץ Mar

4. דיון בנושא

בעוד שיש צורך מובהק – כאשר מנטרים גנים רעילים בתנאים סביבתיים מסוימים – להתייחס למידת הרגישות, העליה המואצת, וכדאיות כלכלית, זה גם ברור שאין אפילו מבדק אחד היכול לספק לנו תמונה מקיפה וסופית עבור האיומים מצד גנים רעילים הנמצאים בדגימה. כידוע, במקרה של מצבי ביואסיי חמורים, יהיה אולי צורך להתייחס לענין הזה כ- “כלי אוגר” המכסה וסורק את כל הסכנות הפוטנציאליות, למרות שזה יכול להגיע לעלויות כספיות נכבדות. אם נסים בצד שיטות אפשריות עכשיויות של טיפול בעניין, השיטות המבוססות על מיזוגי גנים מדווחים לאתרים-מקדמים של פעולת SOS, כנראה שהן יספקו לנו עלות תועלת באופן עקרוני (לפחות כשמדובר בהעלאת מידע על המסך). למרות שתגובת ה- SOS כשלעצמה, לא מעידה על פעילות מוטגנית, עדיין יש בהחלט קשר בין 2 הפעולות הללו [4]. מבחן כרומוזומים–SOS [4], ומבחן בדיקת umu, שניהם מספקים תועלת מהתופעה הזאת: מקעב אחרי מצבי תקופת הדגירה של אורך מתוקן; בדיקה קולורימטרית תבוצע כאן לצורך קביעת רמות בטא-גלקטוזידאז אקטיביות, הפעילות בהשראת SOS.

התקשורת הזאת מעידה על התפתחויות בכלים ובשיטות, לצורך שימוש בגורם מדווח שונה לעירור פעולת ה- SOS: גני לאקס של חיידקים מאירים. מתוך דיווחים קודמים [12-9], תוארו שני נתיבים שונים בשביל לבחור מתוך 3 מרכיבי מערכת עיקריים: קדם-מפעיל של תגובת SOS, מדווח לאקס, ואורגניזם מארח. בכל מקרה, התוצאה הסופית היתה זהה בכל המצבים: זנים של בקטריה נושאי-פלסמיד, יכולים לשמש כמדווחים בהארה רגישה, תוך כדי נוכחות של סוכני נזקי DNA. הפטנטים מארה”ב ואירופה, הקשורים בטכנולוגיה של מדווחי לאקס (בהקשר הזה), אושרו לאחרונה [38,39], ואחד מהמבחנים שהתבארו (Vitotox®) הפך לאחרונה להיות נגיש כלכלית.

הדווח [12] המקורי שלנו, תיאר איך משתמשים בפרומטר uvrA או recA – בחיידק האשריכיה קולי – בעזרת הלאקס CDABE של פישרי. הזן 2794DPD נושא את recAˈ: מיזוג הלאקס בפלסמיד רב-העתקי, נצפה [40] לאחרונה מבדיל בצורה מובהקת, בין גורמי-נזקים ישירים ובלתי ישירים. במהלך נסיון לשפר את הגורם הקדם-מפעיל של תגובת SOS, נחקרו מיזוגים/שילובים של luxCDABE, ועוד מספר של שינויים ותיאומים.

4.1. החלפת הזן המארח במוטציית tolC של אשריכיה קולי

המוטציה הזאת [14,34], איך שזה נראה, משפיעה על פוטנציאל הזרימה/שפיכה החוצה מצד תאי האשריכיה קולי, ובכך לאפשר ריכוזים יותר גבוהים מהרגיל של תרכובות רעילות, שבמקרים אחרים היו נשמטות מהציטופלזמה. המוטציות האלו, והחשיפה לתרכובות עם מגבלות חדירות (עקב הידרופוביה לדוגמא), היו צפויות להקל על המצב. זה באמת היה המצב לאושרו – כמו שמתואר בגרף 3 – אצל MC, גבול הגילוי לרמות שהונמכו לפחות פי 10 מתחת ל- 1 µg/l. כמו שהיה צפוי, לא נרשמה תגובה כלפי H2O2, וזה מדגיש את הנקודה שרק קבוצה מסויימת של כימיקלים, מאופיינת ביכולתה לעורר תגובה רצויה לשיפור וחיזוק הרגישות. מבנים או מנגנונים שונים של מוטציות חדירות (הבאות בקבוצות או כפרטים בודדים), אפשר שיהיו משומשות בעתיד כדי לתרום בתחום מבחן הזנים, בטווח ספקטרום רחב יותר.

4.2 החלפת הגנים המדווחים: מויבריו-פישרי עד החיידק הזוהר לאקס

המטרה העיקרית מן הצעד הזה, היתה להגדיל את טווח הטמפרטורות של החלבונים המדווחים, בכך שיהוו טמפרטורות אופטימליות עבור האשריכיה קולי. הטמפרטורות הגבוהות גרמו להשראה מהירה יותר מצד מערכת ה- SOS, ומאופרון לאקס, מה שהביא לתגובה לומינסנצטית מהירה יותר. בכל מקרה, היתרון הזה, קוזז באמצעות לומינסנצטיית-רקע יותר גבוהה והדבר בתורו השפיע בצורה נחרצת על רגישות המערכת.

4.3. אינטגרציה של הפרומטר: מיזוג לאקס שהתרחש לאחרונה בפלסמיד רב-העתקי, עם כרומוזום בקטיריילי

בזמן שתקופת פיגור יותר ארוכה, הגדילה את השראת האינטגרציה הכרומוזומלית השלמה כחד-העתקית, יחסי התגובה עלו במקביל, ורמות הרגישות השתפרו (רוב הסיכוי שזה קרה בגלל ירידה דרסטית בלומינסנצטיית-הרקע). בנוסף לזה שסופקה כאן מערכת יציבה ואינהרנטית, קיבלנו כאן כתוצאה מזה, ובאופן כללי, התאמות ושינויים יותר חיוביים בביצועים.

4.4. להשתמש בבקטיריה מארחת אחרת

השינוי הזה השפיע על אופן השימוש בחיידקים מסוג טיפימוריום, האורגנזמים של מבחן איימס, במקום האשריכיה קולי. בעוד שזה מרשים מאוד לקבל תגובה יותר מהירה, ההשפעה המשתנה הנצפית בגבול הגילוי מעמידה בספק את היתרון הזה, במערכת שתוארה.

בהתאם לכך, חלק מהשינויים הביאו לשיפורים מובהקים במערכת, בעוד אחרים הראו הבדלים בהשפעותיהם שהן גם ספציפיות לרעלנים גנטיים מסויימים. האינטגרציה הכרומוזומלית, מוטציית ה- tolC – ובמידת מה גם את אופירון לאקס של חיידקים זוהרים – היוו ומעבר לכל ספק יתרונות בתהליך. הזנים שהכילו קומבינציות עבור המאפיינים האלה, נבחרו למטרת ניהול עוד מחקרים הכוללים טבלה מקיפה יותר של כימיקלים (חלקם ידועים כרעלנים גנטיים). בנינו ובחנו, מתוך המבחר המגוון, 2 מבנים של חיידקי אשריכיה קולי המהווים את פוטנציאל ההתאמה הגבוה ביותר: זן 3063DPD המכיל …