מיקרו-ביוריאקטורים Microbioreactors for Bioprocess Development

מיקרו-ביוריאקטורים עבור פיתוחי עיבוד ביולוגי

כצעד קדימה לקראת פיתוח הליכי עיבוד ביולוגי בתפוקה גבוהה, אנו מציגים תכנון, ייצור, ואפיון של מיקרו-ביוריאקטורים מבוססי-פולימר, משולבים עם חיישנים ואקטואטורים אוטומטיים. ההתקנים מתממשים, ברמות הולכות וגוברות של מורכבות, בפולי(דימתיל סילוקסן- dimethylsiloxane) ופולי(מתיל מתקרילאט-  methyl methacrylate ) באמצעות מיקרו-מכאניקה והליכי התקשרות של דחיסה תרמית רב-שכבתית. תהליכי מדידה אופטיים מקוונים עבור צפיפות אופטית, רמת PH, ורמות חמצן מומס, משולבים בהתקנים. בחישה פעילה מתאפשרת על ידי מוט בחישה מגנטי מיניאטורי. מחברים מיקרו-פלואידיים מסוג “חבר-וזרום”, ומחברים/עדשות פולימר מיקרו-אופטיות, משולבים במיקרו-ריאקטור עבור פעולה מהירה וקלה. דוגמאות של דרכי היישום מראות את ההיתכנות של תרביות תאים מיקרוביאלים, במיוחד Escherichia Coli, בביוריאקטורים בנפח μL 150, בתפעולי אצווה (קבוצה), באופן מתמשך, ובהזנת אצווה (fed-batch).

מבוא

השיטות הקונבנציונאליות לתירבות תאים מיקרוביאלים מפגרות מאחורי כלים אוטומטים מבוססי-מערך, עבור גילוי ומניפולציה גנטית של מערכות ביולוגיות. פיתוחי עיבוד ביולוגי עבור קולטיבציה ואופטימיזציה מיקרוביאלית לרוב מבוצעים בביוריאקטורים הכוללים מיכלי בחישה יקרים, מורכבים מכאנית, ותובעניים מבחינת עבודה. מיכלי ערבוב ביוריאקטורים מדידים, עם נפח בין 0.5-10 L, כוללים שליטה אפקטיבית ברמות הטמפרטורה, pH וחמצן מומס (DO), ומניבים נתונים פיזיולוגיים ומטבוליים רבי-ערך. עם זאת, המספר המועט של ניסויים אותם ניתן לבצע מגביל את האופטימיזציה של תנאי הגדילה והמחקרים המטבוליים. הטכנולוגיה של ריאקטורי מיכל-בחישה הגיבה לאתגרים אלה על ידי הפחתת הנפח והגדלת מספר הכורים הפועלים במקביל. אך התפוקה נותרה מוגבלת בשל המורכבות המכאנית של הכנת הניסויים ועריכתם – תהליכים כמו ההרכבה, הניקוי והכיול של החיישנים בהתאם למספר הביוריאקטורים. לפיכך, קיים צורך במערכות המאפשרות מבחנים מהירים, אופטימיזציה ופיתוח עיבודים ביולוגיים בנפח נמוך, וניסויים מקבילים עם התקנים וזמני הרצה הנשארים בלתי-תלויים ככל האפשר במספר הריאקטורים. מכשיר המעבדה SIXFORS של Infors AG  (שוויץ) הוא בעל שישה פרמנטורים (מתסיסים) הפועלים במקביל. פיתוח עדכני נוסף, ביוריאקטורים מסוג Cellstation   של Fluorometrix Corp., מאפשרים ל- 12 ביוריאקטורי מיכל-בחישה מיניאטוריים לפעול במקביל. עם זאת, התפוקה של מיכלים אלה עדיין מוגבלת.

ביוריאקטורים חד-פעמיים המופעלים במקביל, עם כמויות קטנות של תרביות ואמצעי מדידה משולבים בזמן-אמת, הוצעו כפתרון מבטיח עבור עיבוד ביולוגי בתפוקה גבוהה. אחד המיקרו-ביוריאקטורים המוקדמים פותח על ידי וולטר ועמיתיו כביוריאקטור 3 mL רציף המשלב חיישנים מיקרו-אלקטרוניים למדידת  ביו-מאסה, pH, וטמפרטורה עבור קולטיבציה של תאי שמרים במרחב. זו הייתה מערכת בעלת שימור-עצמי עם קצב זרימה בינוני הנמדד על ידי מיקרו-חיישן הנשלטת על ידי משאבת ממבראנה פייזואלקטרית מסיליקון. רמת ה-pH  נוטרה על ידי חיישן טרנזיסטור תוצא-שדה (FET) יון-סלקטיבי ותומרנה על ידי יצירה קולומטרית של יונים הידרוקסיליים באלקטרודת טיטניום. המערכת אווררה בעזרת צינורות סיליקון גליליים חדירים לגז, והערבוב התבצע בעזרת מוט בחישה מגנטי. מהרביץ ועמיתיו שילבו צלחות מיקרוטיטר עם טכנולוגיית ניטור סיליקון כדי לממש מערכי מיקרו-ביוריאקטורים של μL 250 עם חיישני ISFET על גבי מעגל מודפס מסחרי.  עבור האוורור, חמצן נוצר בריאקטור על ידי הידרוליזה של מים. מכשיר המיקרו המדווח על ידי למפינג ועמיתיו היה גרסא מוקטנת של ביוריאקטורי מיכל-בחישה קונבנציונאליים הפועלים ב- Plexiglas ומצוידים במזרקי אוויר ווסתי בחישה.

חיישנים אופטיים הם לרוב לא-פולשניים וניתן לשלבם בתכנון. חיישנים אלקטרו-כימיים עבור חמצן, המשמשים במאקרו, לרוב אינם מתאימים למערכות מיקרו, מאחר והם צורכים חמצן שאמור להיות זמין לתרביות התאים. ראו ועמיתיו פיתחו חיישן אופטי למדידת צפיפות אופטית (OD , הקשורה לצפיפות תאית), pH, ו-DO  עבור תרביות אצווה מיקרוביאליות בקובטים של 2 mL, מה שהדגים את ההיתכנות של שימוש בחיישנים אופטיים בביוריאקטורים על מנת להפחית את המורכבות המכאנית ולהגדיל את התפוקה. פוסקיילר ועמיתיו דיווחו על תפעול מקביל של 48 ביוריאקטורי בחישה-מגנטית בקנה מידה של מיליליטר עם מדידות משולבות שלOD  ו- pH בזמן אמת ואוטומטיזציה של תפעול הזנת האצוות ובקרתpH . מחקרים אלה לגבי מזעור ועבודה במקביל של מיקרו-ביוריאקטורים, לצד פלטפורמות הביוריאקטורים מסוג Cellstation ו- Simcell, מסמלות את הפוטנציאל של טכנולוגיה זו בכל הנוגע לפיתוח של עיבוד ביולוגי.

המיקרו-ביוריאקטורים שלנו מבוססים על המיקרו-ביוריאקטור מאוורר-הממבראנה אשר דווח בעבר על ידי זנאזוטו ועמיתיו. במיקרו-ביוריאקטור זה ממבראנה דקה של פולי(דימתיל-סילוקסן) (PDMS), חומר פולימרי חודר-גז, פועלת בתור ממבראנת האוורור עבור מטבוליזם תאים. הממבראנה מגדירה בנוסף את ממשק הגז-נוזל על מנת לאפשר ביוריאקטור חד-פאזה סטרילי. בעזרת שילוב של טכנולוגיית תוצרים פולימרים, ערבוב מגנטי אקטיבי, בקרת טמפרטורה, מודיפיקציה של פני השטח ומערכות זרימה רציפות, מיקרו-ביוריאקטורים אינדיבידואליים הוכחו כיעילים עבור תסיסת אצווה ותירבות רציף של Escherichia coli במיקרו-ביוריאקטורים בקנה מידה μL עם בקרת זמן-אמת ו- in situ של OD, pH ו- DO. פיתוחים אלה בתחום המיקרו-ביוריאקטורים מאפשרים מעקב מתמשך ושליטה בזמן תהליכי תרביות מיקרוביאליות, וכך מפשטים באופן משמעותי את המאמץ בכל ניסוי תסיסה. בנוסף, תסיסות מיקרוביאליות מקבילות במערכת מרובבת מדגימות את הפוטנציאל של מיקרו-ביוריאקטורים עבור ניסויים בתפוקה גבוהה. לי ועמיתיו פיתחו לאחרונה מערך משולב של מיקרו-ביוריאקטורים ב- PDMS עם נפח עבודה של 100 μL, הכוללים מערבבי חמצן פריסטלטיים ומזרקי מיקרו-נוזלים. המערכת תמכה בהתססות E. coli סימולטניות לצפיפויות תאים העולות או זהות לאלו של ביוריאקטור מיכל-בחישה מעבדתי של 4 L.

אחת הסוגיות החשובות במחקרי תפוקה גבוהה של עיבוד ביולוגי היא התפעול המקביל של תסיסות מיקרוביאליות במיקרו-ביוריאקטורים חד-פעמיים. החלפת הריאקטורים דורשת ממשק מוגדר היטב של המיקרו-ביוריאקטור לטיפול חיצוני בנוזלים, מדידות אופטיות, ומכשירים אלקטרוניים. במחקר זה, מחברים מיקרו-פלואידיים מסוג “חבר-וזרום” ועדשות פולימר אופטיות בייצור-מיקרו ומחברי סיבים משולבים בתוך המיקרו-ביוריאקטור. המיקרו-ביוריאקטור החד-פעמי, הממומש בפולי(מתיל-מתקרילאט) (PMMA) ו- PDMS באמצעות הליך התקשרות תרמית רב-שכבתי, מתיישר באופן אוטומטי עם רכיבי הזרימה והאופטיקה החיצוניים, וכך עונה על הצורך בהכנה מהירה ותפעול פשוט וקל.

תצורות המיקרו-ביוריאקטור

הדור המוקדם של מיקרו-ביוריאקטורים (איור 1A) תוכנן עבור קולטיבציית אצוות של תאים מיקרוביאליים. הריאקטור הורכב משתי שכבות PDMS (L2 ו- L3) שמוקמו בין שתי שכבות PMMA (איור 1A, L1 ו- L4). שכבת ה- PMMA התחתונה, המיוצרת על ידי מכונת כרסום עם בקרת מחשב נומרית (CNC) עם דיוק ממדי של 12 μm, כללה את תא המיקרו-ביוריאקטור (נפח 150 μL) ו- 3 ערוצי חיבור (M) המשמשים לאינוקולוציה וחידוש המים.

שתי גומחות (S, קוטר 2mm, עומק 250 μm) בתחתית תא הביוריאקטור הכילו חיישני משך-חיים פלורוסנטיים למדידת DO ו- pH (חיישן DO PSt3, ותמיסת חיישן pH HP2A, חברת PreSens). מדידות משך-החיים הפלורוסנטיות מפורטות במחקרים אחרים. במרכז המכשיר, תא הריאקטור הוכן בשכבות L1 בגיאומטריה גלילית עם קוטר של 10 mm ועומק של 1 mm. מוט בחישה מגנטי בצורת טבעת (K) עם זרוע באורך 6 mm ועובי של 0.5 mm (Engineered Concepts, ארה”ב) הוחזק על ידי עמוד PMMA (T) ושימש לערבוב אקטיבי בתא הריאקטור. יעילות הערבוב בתא המיקרו-ביוריאקטור נאמדה באמצעות ניסויים וסימולציות ממוחשבות של דינאמיקת הזרימה.

שכבה דקה (עובי ~100 μm) של PDMS בציפוי סיבובי (L2; יחס הערבוב של הסיליקון עם סוכן ההתקשות היה 10:1) כיסתה את תא הריאקטור ותפקדה בתור ממבראנת האוורור. שכבת ה- PDMS עברה ציפוי סיבובי במהירות של 1200 rpm במשך 25 שניות ולאחר מכן נאפתה בטמפ’ של 70oC במשך שעתיים עד ההתקשות. ממבראנת ה- PDMS בלטה כלפי מעלה כתוצאה מלחץ חיובי בתא המיקרו-ביוריאקטור כדי להגיע לנפח ריאקטור של 150 μL. בכדי לאפשר את הרכבת המכשיר, איטום הרמטי, וחיבור הערוצים המיקרו-פלואידיים (M) שכבת PDMS זו הוחזקה על ידי שכבת אטם בעובי 5-mm (L3). שכבת PDMS עליונה סיפקה תמיכה קשיחה עבור ההרכבה המכאנית. שלושה פתחים מחברים את תא המיקרו-ביוריאקטור למערכת החיצונית באמצעות מיקרו-ערוצים (M) המשמשים לאינוקולציה (P1), חידוש הפסולת (P2) והזרמת פסולת החוצה (P3; בזמן האינוקולציה).

איור 1: A) מכשיר מיקרו-ביוריאקטור המשמש לקולטיבציה של אצוות תאים. B) מכשיר המשמש לבקרת pH וקולטיבציית תאים בהזנת אצווה. מיקרו-ערוצים משמשים להזנת מים (P1), בסיס (P2) חומצה (P3), אינוקולוציה (P4), ויציאת פסולת (P5), בהתאמה. C) מכשיר PMMA בהתקשרות תרמית משמש לקולטיבציית תאים רציפה. ערוצים מיקרו-פלואידיים מאפשרים חידוש מים (P1), אינוקולציה (P2), יציאת פסולת (P3) וזרימת תאים החוצה (D) לפני ובזמן ניסויי כימוסטאט. D) חתך-רוחב של מיקרו-ביוריאקטור משולב. L1-L5, שכבות PMMA קשורות תרמית; F- פקק PMMA המשמש להרכבה מכאנית של ממבראנת האוורור; H – אורינג סיליקון לאיטום; I – סיב אופטי המקובע על ידי F; J- רשת המחזיקה את ממבראנת ה- PDMS מעל תא הריאקטור; K – מערבב מגנטי באמצע תא הריאקטור; L – גומחות ב- PMMA עבור פיני היישור P; M – ערוצים מיקרו-פלואידיים; N – אורינגים קטנים מסיליקון עבור חיבורים פלואידיים; O – חיישני pH ו- DO פלורוסנטיים; P – פיני יישור PDMS על פלאגים אופטיים; S – חיישנים אופטיים.

​המיקרו-ביוריאקטורים הותאמו לתהליכי התססה מורכבים, כמו כימוסטאט והזנת אצווה, על ידי הוספת תכונות אחרות. המכשיר באיור 1B שימש לבקרת pH ופעולות הזנת אצווה. תא הריאקטור הורכב משתי שכבות PMMA (L1 ו- L2 איור 1B) שהתקשרו תרמית בטמפ’ של 140oC במשך 90 דקות במלחציים ביתיים. זוג קפיצי דיסק בלוויל (קוטר 119.0 mm; עובי 1.25 mm; גובה 2.80 mm; תעשיות MSC ארה”ב) שמרו על עומס קבוע של 0.12 MPa.

התכונה העיקרית של מיקרו-ביוריאקטור זה היא היכולת להוסיף בסיסים, חומצות וגלוקוזה במהלך התסיסה, עם בקרת מעגל סגור על ידי מיקרו-שסתומים (Lee Co., ארה”ב) ומעגלי בקרה חיצוניים. הערוצים המיקרו-פלואידיים, שמוכנו בשכבה L1 ונאטמו על ידי שכבה L2, שימשו להזנת מים (P1), בסיס (P2) וחומצה (P3), אינוקולציה (P4) והזרמת פסולת החוצה (P5, בזמן האינוקולוציה), בהתאמה.

איור 1C שימש לתירבות רציף של תאים בקטריאליים בכדי להשיג נתוני כימוסטאט (איור 1B). תא המיקרו-ביוריאקטור (קוטר 10 mm ועומק 2 mm, נפח כולל של 150 μL) ו- 4 ערוצי חיבור יוצרו ב- 3 שכבות PDMA תחתונות קשורות-תרמית (שכבות L1 עד L3; תאגיד Goodfellow). ממבראנת אוורור ה- PDMS הדקה כוסתה עם שכבה נוספת של רשת מפלדת אל-חלד (Small Parts Inc., ארה”ב) שקובעה באמצעות אורינג PDMS ביתי בכדי ליצור מבנה ממבראנה מנוקב וכדי למנוע בליטה של הממבראנה. הערוצים המיקרו-פלואידיים מוכנו בשני הצדדים של שכבה L2 ונאטמו על ידי שכבות L1 ו- L3. ערוצים מיקרו-פלואידיים אלו מאפשרים הוספת תווך (P1), אינוקולציה (P2), הוצאת פסולת (P3, בזמן האינוקולציה) וזרימה החוצה של תאים (P4) לפני ובמהלך ניסויי כימוסטאט. משאבת הזרקה חיצונית (Harvard Apparatus, ארה”ב) המחוברת ל- P1 סיפקה הזנת תווך יציבה במהלך ניסויי תרבית רצופים.

המיקרו-ביוריאקטורים העדכניים (איורים 1D ו- 2) משפרים את ממשק המיקרו-ביוריאקטור לכלים החיצוניים (טיפול בנוזלים, בקרה אופטית, אלקטרוניקה ובקרה ממוחשבת) ללא מודיפיקציה של הפונקציות הביולוגיות של תכנונים קודמים. המכשירים מורכבים מ- 5 שכבות PMMA קשורות תרמית. ההתקשרות התרמית של שכבות ה- PMMA עם טמפרטורות מעבר זכוכיתי (TG) שונות בוצעה במלחציים מכאניים בשני שלבים: ראשית, שלושת השכבות התחתונות (L1-L3) נקשרו בטמפ’ של 140oC במשך 90 דקות. שנית, התרכבות הנוצרת נקשרה עם שתי השכבות העליונות (A ו- B) בטמפ’ נמוכה יותר של 120oC במשך 60 דקות. תא הריאקטור, שנוצר בשכבות L2 ו- L3, היה בעל אותה צורה ואותו גודל כמו בתכנונים קודמים. על החלק העליון של תא הריאקטור, שכבת אוורור ה- PDMS הדקה הוחזקה על ידי שכבת אטם PDMS בעובי 3-mm (חלק G באיור 2, קוטר פנימי 20 mm, קוטר חיצוני 25 mm, יוצר בתבנית פוליקרבונאט) כדי לאפשר את הרכבת המכשיר ואטימתו.

איור 2: A) סקירה של חלקים אינדיבידואליים עבור המיקרו-ביוריאקטור המוצג באיור 1D. B) מבט מלמעלה של מיקרו-ביוריאקטור מורכב וקשור.

“פקק” PMMA (איור 1D) (F) עם קוטר חיצוני גדול יותר במקצת (גדול יותר ב-  13 μm בקוטר) מהקוטר הפנימי של מסגרת ה- PMMA (שמוכנה ב- A ו- B) יצר איטום על ידי דחיסת ה- PDMS (G) ואורינג אלסטומר סיליקון של Sylastic RTV (H, קוטר פנימי 10 mm, קוטר חיצוני 20 mm, גובה 3 mm, תבנית פוליקרבונאט) חור קטן שנוקב בפקק הביא ליישור הסיב האופטי (I) עבור מדידות העברת ה- OD. פקק זה אפשר את הניקוי והשימוש מחדש במיקרו-ביוריאקטור על ידי החלפת ממבראנות ה- PDMS לאחר הניסויים, תכונה מועילה ביותר במחקרים ניסויים, אך כזו הדורשת עבודה רבה בעת עריכת ניסויים מקבילים. לפיכך, בגרסת הביוריאקטור החד-פעמית ממבראנת ה- PDMS הותקנה באופן קבוע בין שכבות ה- PMMA לאחר ההתקשרות התרמית ומבנה הרשת המייצב עבר יציקה בשכבה B של ה- PMMA. בדומה למיקרו-ביוריאקטורים קודמים (איורים 1A-C) חיישני משך-החיים הפלורוסנטים משולבים בתחתית תא המכשיר (איור 1D) לצורך מדידות מקוונות של pH ו- DO. חריצים הנמצאים מתחת חיישנים אלו (L1 ו- L2) מצמידים עתה סיבים אופטיים (O) לגלאים פלורוסנטיים חיצוניים ומדידות משך-חיים לצורך התיישרות טובה יותר.

הממשק הפלואידי בין המיקרו-ביוריאקטור לבין יחידות נוזל חיצוניות הורכב מאורינגים אלסטומריים (N) ששולבו במכשיר ה- PMMA (איור 1D). אלו אפשרו איטום-עצמי אספטי, פונקציונאליות “חיבור והרצה”, בין הטיפול החיצוני בנוזלים וערוצים מיקרו-פלואידיים פנימיים לצורך אינוקולציה, הזנת ריאגנט, דגימות והזרמת פסולת החוצה. האורינגים נוצקו באלסטומר סיליקון מתבניות פלדת אל-חלד עם קוטר חיצוני של 4.2 mm, קוטר פנימי 0.2 mm, ועומק של 4.6 mm. תבניות הפלדה יוצרו על ידי שימוש במכונת כרסום בעלת ראש כדורי בקוטר 2 mm (MSC Industrial Supply) במהירות סיבוב גבוהה של 8000 rpm ולאחריה אלקטרו-פוליש בכדי לקבל משטח חלק. האורינגים התקשחו בטמפרטורת החדר למעלה מ- 12 שעות בכדי לקבל מודול יאנג של 4.5 MPa. לאחר מכן הן הוטמעו בתושבות שמוקמו בשכבת PMMA עבה (A) כאשר שתי השכבות נקשרו תרמית. התושבות של האורינגים היו בעלות קוטר (4.1 mm) ועומק (4.45 mm) מעט קטנים יותר כך שהאורינג הייתה דחוסה והחור הפנימי אטום; חורי-מעבר בקוטר 1.5-mm בשכבת ה- PMMA המכסה תאמו את פוזיציות המרכז של האורינגים. לאחר שהוחדרו צינורות פלדת אל-חלד (אורך 12 mm, קוטר 23), האורינג התרחב ויצר חיבור פלואידי. התהליך היה הפיך, והנזילות נאטמו בלחצים של ~0.6 MPa.

הכנת הניסוי והממשק האופטי

רמות ה- DO, pH ו- OD600 nm נמדדו על ידי שיטות אופטיות שתוארו בעבר על ידי זאנזוטו ועמיתיו, כך שנושא זה יסוכם כאן בקצרה. מערך הניסוי עבור הרצת תסיסה בודדת מוצג באיור 3. התסיסות בוצעו על ידי הנחת המיקרו-ביוריאקטור בתא אלומיניום שנשמר בטמפ’ של 37oC על ידי הזרמת מים חמים דרך בסיס התא. סיבים אופטיים מפוצלים (RoMack Fiber Optics, ארה”ב) הובילו לתוך התא מלמעלה ומלמטה והתחברו ל- LEDs וגלאי אור (Thorlabs, ארה”ב) על מנת לערוך את המדידות האופטיות. לאחר הביו-מאסה נאספו נתוני OD600 nm ממדידת מעבר באמצעות LED כתום (יפן). הענף המפוצל סיפק אות-רפרנס בכדי לפצות על תנודות אפשריות באינטנסיביות של ה- LED הכתום. ה- DO וה- pH נמדדו באמצעות מודולציית פאזה של פלורומטריית משך-חיים. חיישני ה- DO ו- pH עברו עירור באמצעות LED כחול-ירוק ( Nichia America Corporation, ארה”ב) ו- LED כחול, בהתאמה. מסננים מעבירי פס של העירור ומסננים מעבירי ארוכים של הפליטה הפרידו בין אותות העירור והפליטה על מנת לצמצם עירור-צולב. מתגי נתונים (מעבדות Electro Standard) יצרו ריבוב של אות הפלט והאות הקלט של מחולל הפונקציה (טכנולוגיות Agilent) ומגבר ה- lock-in. תוכנת LabVIEW אפשרה מדידות אוטומטיות של הפרמטרים בזמן-אמת.

איור 3: מערך המדידה של המיקרו-ביוריאקטור. קווים מקוטעים מסמנים סיבים אופטיים, קווים רצופים מסמנים חוטים אלקטרוניים וצינורות נוזלים.

על בסיס תוכנית זו, מערכת מרובבת עבור תפעול מקביל של 4 מיקרו-ביוריאקטורים דווחה על ידי זיטה ועמיתיו. במערכת זו, מנוע צעד נשא סוגר אופטי בסריקה על פני המיקרו-ביוריאקטורים בסדרות stop-and-go שבוצעו על ידי אלגוריתמים בשליטת מחשב. פרמטרי התהליך נמדדו ותועדו עבור כל ריאקטור באמצעות פלורוסנטיות משך-חיים ושיטות ספיגה בצורה סדרתית. מספר הניסויים עלה עבור אותם כלים חיצוניים, כמו מגבר ה- lock-in ומחולל הפונקציה. עם זאת, מהירות הסריקה/קריאה עבור המיקרו-ביוריאקטור האינדיבידואלי בסופו של דבר הגבילה את המספר האפשרי של ניסויים מקבילים.

כחלופה, פותחה אסטרטגיית יישור-עצמי עבור הממשק האופטי בין מערכת המדידות החיצונית והחיישנים הפלורוסנטיים החד-פעמיים בתוך המיקרו-ביוריאקטור. מיקרו-עדשה ומחברים אופטיים משולבים (איור 4A) נוצרו מ- PDMS בתבנית אלומיניום שיוצרה בכרסום קונבנציונאלי בעזרת מכונת כרסום בעלת ראש כדורי בקוטר 2-mm ועברה ליטוש מכאני באמצעות ערכת shaft grinder, מקלוני כותנה, ומשחת ליטוש. תבנית האלומיניום הורכבה משני חלקים. החלק התחתון הבטיח את השכפול של הצורה השלילית של המיקרו-עדשה ו- 4 עמודים המיישרים את הפלאג למיקרו-ביוריאקטור. החלק העליון כלל עמודות באורך 10-mm המיושרות באופן קונצנטרי עם העדשות על ידי יציקת תושבת פלאג ה- PDMS, ההכוונה, וקיבוע הסיבים האופטיים.

עבור מדידות ה- DO או ה- pH, שני סיבים אופטיים (סיבי פלסטיק בקוטר 1 mm ו- 0.6 mm, Thorlabs ו- Polymicro Technology, בהתאמה) הותקנו בחור התואם בתוך פלאג ה- PDMS (איור 4A). הסיבים יוצבו באמצעות PDMS שנוסף לאחר החדרת הסיבים והחוזק במקומו בעזרת תמיכות. ה- PDMS עבר התקשות, ולבסוף בוצעה יציקה של אפוקסי על החלק העליון על מנת לספק יציבות מכאנית לפלאג. סיבים אלו החליפו את הסיבים האופטיים המפוצלים היקרים ששימשו במחקרים קודמים. באותו תהליך ייצור, אחד הסיבים (קוטר 0.6 mm) קובע במרכז הפלאג עבור קריאת ה- OD. הסיבים האופטיים מוקמו במרחקי ציר ספציפיים מהמיספרת צורת השטח החיצוני על מנת להתמקד בחיישנים האופטיים בביוריאקטור. נקודות מיקוד שונות תוכננו בפלאג האופטי עבור מדידות ה- DO, pH ו- OD השונות. הכיול והאופטימיזציה של הפוזיציות עבור קריאות ה- pH ו- DO מיקסמו את אינטנסיביות האור מהחיישן הפלורוסנטי בכדי לשפר את יחס האות-רעש של המדידות. עבור מדידות ה- OD, התכנון שאף להשיג מעבר אור מקביל דרך הריאקטור וגילוי מוצלח בצד השני של המכשיר. בכדי להכווין את התוכנית, פותח מודל דו-ממדי באמצעות תיאוריית אופטיקת קרניים. דימות התפלגות האור הראה הסכמה טובה עם המודל (איור 4B). המדידות מראות אינטנסיביות אור מקסימאלית מהפלאגים, 50% גבוהה יותר בהשוואה לסיבים האופטיים המבוקעים וממוקדת יותר באופן מובהק בנוגע להתפלגות הלטראלית של האור. אפילו בנוכחות של אי-התאמות קלות הרחק מהמרכז, התמקדות באמצעות המיקרו-עדשות גרם לצימוד אור אפקטיבי יותר בהשוואה לשיטות צימוד מסוג butt-end.

איור 4: A) מיקרו-עדשה וטבעת התאמה מסביב למיקרו-עדשה (למעלה). חתך-רוחב המראה 3 מיקרו-עדשות שהורכבו עם סיבים אופטיים. P – פיני יישור PDMS. B) מיקוד באמצעות מיקרו-עדשה PDMS. אינטנסיביות אור במיקום לטראלי שונה מהסיב המבוקע (קו ירוק) ומיקרו-עדשה אופטית (קו כחול). קימורים חלקים ממודל מעקב קרן דו-ממדי. C) מיקרו-עדשות אופטיות שהורכבו עם תושבות סיבים אופטיים. הסיבים המוצגים הם בקוטר של 0.25 mm. אפוקסי ותמיכה מכאנית חיצונית אינם מוצגים.

תכונה חשובה נוספת של המחבר, טבעת ההתאמה מסביב למיקרו-עדשה (איור 4A), יוצרה בגודל השווה לגודל החור הנמצא מתחת למיקרו-ביוריאקטור (1.6 mm הרחק מהמרכז, גובה 1 mm, רוחב 0.4 mm). התבנית נוצרה באמצעות מכונת כרסום בעלת ראש כדורי בקוטר 0.4-mm (Performance Micro Tool, ארה”ב). טבעת ההתאמה סייעה למיקום הסיבים האופטיים אל החיישנים האופטיים, הגנה על המיקרו-עדשה, והפכה את תהליכי ההכנה לקלים ומהירים יותר באופן משמעותי (איור 4C).

ניסויים ביולוגיים במיקרו-ביוריאקטורים

יישומי המיקרו-ביוריאקטורים בפעולות אצווה, קולטיבציה רציפה והזנת אצווה, הודגמו ומסוכמים כאן בקצרה. בניסויים המוצגים באיורים 5-7, E. coli FB21591 שימש בתור אורגניזם המודל.

איור 5 מציג תרבית אצווה ברת-שחזור של E. coli בתווך Luria-Bertani (LB) המכיל 8 g/L גלוקוזה, 100 g/L קנמיצין, ו- 0.1 mol/L חומצה 2-(N-מורפולינו)אתנסולפונית (MES) (Sigma-Aldrich). בתחילה, תאי ה- E. coli התחילו לגדול מיידית ללא פאזת שיהוי ניכרת. בהתאם לקצב הגדילה הגבוה של התאים במהלך שלב הגדילה האקספוננציאלית, הביקוש הגבוה לחמצן השתקף בירידה המהירה של רמות ה- DO בתווך התרבית. ה- DO במיקרו-ביוריאקטור התכלה לחלוטין לאחר 1.5 שעות מהתסיסה והתאושש רק לאחר 5 שעות, כאשר התאים נכנסים לפאזה הנייחת והחומרים המזינים הופכים מוגבלים. בשלב זה, כתוצאה מתסיסה אנאירובית, רמת ה- pH בתווך צונחת במידה משמעותית עד שהתאים מגיעים לפאזה הנייחת.

איור 5: תרבית אצווה של E. coli FB21591 בתווך LB המכיל 8 g/L 100 μg/L קנמיצין, ו- 0.1 mol/L MES (מיקרו-ריאקטורים איור 1A).

איור 6: הזנת גלוקוזה של קולטיבציית הזנת אצווה של E. coli בתווך LB המכיל 8 g/L 100 μg/L קנמיצין, ו- 0.1 mol/L MES (מיקרו-ריאקטורים איור 1B). תווך ההזנה הכיל 40 g/L גלוקוזה והערך שנקבע עבור ה- DO היה 37% מרמת רווית האוויר.

איור 7: קולטיבציה רציפה של E. coli במיקרו-ביוריאקטורים (מיקרו-ביוריאקטורים איור 1C). תווך הזנת  MOPS הכיל 2 g/L 100 μg/L קנמיצין, ו- 0.1 mol/L MES.

באיור 6, ניסוי הזנת אצווה התחיל בתרכובת של E. coli בתווך LB המכיל 2 g/L גלוקוזה ו- 0.1 mol/L של MES. שליחת תמיסות 40-g/L גלוקוזה ו- 1-mol/L NaOH בוקרה בפידבק על בסיס קריאות ה- DO וה- pH, בהתאמה. עבור הוספת הגלוקוזה, כאשר ערך ה- DO במיקרו-ביוריאקטור, המיוצג על ידי קריאת תזוזת פאזה, היה גבוה יותר מרוויה של 37%, נפח קבוע של 1.34 μL תמיסת גלוקוזה הוזן לתוך המיקרו-ביוריאקטור. בשלב מוקדם של הניסוי, התאים השתמשו בגלוקוזה וב- LB באופן סדרתי בתור מקור הפחמן עבור הגדילה, מה שגרם לערך ה- pH בתחילה לרדת (בפיצוי של הזנת בסיס) ולאחר מכן לעלות. תהליך התסיסה נמשך כ- 10 שעות לפני התאוששות ה- DO. לאחר 10 שעות ניסוי, דפוס מחזורי של דלדול-התאוששות ב- DO הצביע על האפקט באמצעות הזנת גלוקוזה על מטבוליזם התא במיקרו-ביוריאקטור. בכל מחזור, ה- DO התאושש כאשר מקורות הפחמן בתווך התרבית התכלו וירד במהירות ל- 0 לאחר ששסתום הזנת הגלוקוזה הופעל והגלוקוזה הוזנה לתוך המיקרו-ביוריאקטור.

איור 7 מציג את התרבית הרציפה של E. coli בתווך MOPS מינימאלי (Teknova inc., ארה”ב) המכיל 2 g/L גלוקוזה, 100 mg/L קנמיצין, ו- 0.1 mol/L MES. ההתייצבות הושגה כאשר קצב הזנות התווך עלו מ- 0.5 μL/min ל- 1 μL/min ול- 1.5 μl/min, באופן סדרתי. תנאי ההתייצבות נשמרו במשך 8 תחלופות לפחות בכל קצב דילול. רמות ה- DO היציבות היו 94%, 77% ו- 56% בקירוב, בהתאמה. רמות DO נמוכות יותר בקצב דילול גבוה יותר מהוות אינדיקאציה ישירה לקצב גדילה ומטבוליזם מהיר יותר. מטבוליזם אירובי במיקרו-כימוסטאט הופך את רמת ה- pH בתווך התרבית ליציבה יחסית בקצבי דילול שונים תודות לקטבוליזם מחמצן מספק ויכולת חוצץ ה- pH מפוספטים בתווך ה- MOPS. בתור מדידה של ריכוז הביו-מאסה, רמת ה- OD נשארה ברמה יציבה של ~1 (ריכוז ביו-מאסה של ~0.46 g cell  משקל יבש לליטר).

איור 8: סכמה של מערכת ביוריאקטור מרובבת עבור פיתוחי עיבוד ביולוגי בתפוקה גבוהה. המיקרו-ביוריאקטורים מחוברים לפלטפורמה בתא האמצעי. קווים רצופים מסמנים סיבים אופטיים וקווים מקוטעים עבים מסמנים חיווט אלקטרוני. אלקטרוניקת ויסות האותות, יחידות הבקרה ואספקת הכוח נמצאים בחלק התחתון.

מסקנות

מטרת מחקר זה הייתה לפתח מערכת מעבדה פרקטית וידידותית-למשתמש העונה על הצרכים של פיתוחי עיבוד ביולוגי בתפוקה גבוהה. פלטפורמת המיקרו-ביוריאקטור תוכננה כשני רכיבים: מיקרו-ביוריאקטורים חד-פעמיים ומכשיר תושבת קבועה, הכוללים רכיבים אופטיים ומכשירים יקרים. לאחר שהדגמנו בעבר פלטפורמת מיקרו-ביוריאקטור מרובבת עבור קולטיבציה של תאים מיקרוביאליים, המאמצים הנוכחיים מתמקדים באריזה, אינטגרציה ואופטימיזציה של המיקרו-ביוריאקטור לשם התאמתו לגישת תפוקה גבוהה.

מחברים מיקרו-פלואידיים ומחברי מיקרו-עדשות PDMS אופטיים תוכננו ושולבו בתור ממשקי “חיבור והרצה” עם מכשירים פלואידיים ואופטיים חיצוניים, בהתאמה. מחברים אלו לא רק מפשטים ומקלים על תהליכי ההכנה עבור מיקרו-ביוריאקטורים מרובים, אלא מסייעים בנוסף לדיוק ויכולת השחזור של המדידות. שבבי המיקרו-ביוריאקטור כוללים שכבות PMMA מרובות קשורות תרמית עם ממבראנת אוורור PDMS מוטמעת. תכנון המיקרו-ביוריאקטור, עם ממבארנת האוורור, הבחישה המגנטית, בקרת הטמפרטורה המקומית והחיישנים הפלורוסנטיים, מאפשר גמישות עבור יישומי עיבוד ביולוגי שונים , כולל אצוות, הזנת אצוות ותפעול רציף. בעזרת ממשק ה”חיבור והרצה”, ניתן ליישם את הביוריאקטור החד-פעמי בפלטפורמת ריאקטור מרובבת של הדור הבא שאינה כוללת את הרכיבים הנעים שאפיינו את המערכות הקודמות. מערכת מקבילה כזו עשויה להיות מורכבת מפלטפורמה המכילה טיפול בנוזלים, מדידות אופטיות, רכישת נתונים ואספקת כוח (איור 8). המיקרו-ביוריאקטור החד-פעמי יתחבר לפלטפורמה זו בתור הרכיב המחלף היחיד. הניסיון הקודם עם מיקרו-ביוריאקטורים בודדים או מרובבים הראה כי ניסויים עם נפחים של ~100 μL משחזרים את קינטיקת הגדילה לצד פרופילי ביטוי הגנים שנצפו במערכות מעבדה של 0.5 L. לפיכך, טכנולוגיית המיקרו-ריאקטור מבטיחה לאפשר פיתוחי עיבוד ביולוגי מהירים יותר ללא דרישות עבודה גבוהות, עם פחות פסולת ושימוש מועט יותר בריאגנט.