(13/04/2024) עלו היום לאתר 9 סמינריונים 2 תזות 2 מאמרים

לרכישה גלול למטה לסוף הדוגמית

סולפסלזין A yeast-based screen reveals that sulfasalazine inhibits tetrahydrobiopterin biosynthesis

סריקה מבוססת-שמרים מראה כי סולפסלזין מעכב ביו-סינתזה של טטרהידרוביופטרין

אנו מציגים גישה לזיהוי אינטראקציות תרופה-חלבון המשלבת סריקת שמרים תלת-היברידית חדשה לזיהוי אינטראקציות עם כרומטוגרפיית זיקה עבור תיקוף חד משמעי. יישמנו מתודולוגיה זו עבור יצירת פרופיל של תרופות מאושרות קלינית, שהוביל לזיהוי של אינטראקציות תרופה-חלבון מוכרות ובלתי מוכרות. בפרט, הצלחנו לזהות off-targets עבור ארלוטיניב ואטורבסטטין, בנוסף למטרת אנזים עבור התרופה האנטי-דלקתית סולפסלזין. אנו נראים כי סולפסלזין והמטבוליטים שלו, סולפאפירידין ומזלמין, הינם מעכבים של האנזים המאפשר את השלב האחרון בביו-סינתזה של הקופקטור טטרהידרוביופטרין. הפרעה למטבוליזם של טטרהידרוביופטרין מספקת הסבר עבור חלק מהתכונות המועילות והמזיקות של סולפסלזין, ומציעה אפשרויות טיפוליות חדשות ומשופרות לתרופה. מאמר זה מספק גישה חזקה ליצירת פרופילים של תרופות ותובנות חדשות לגבי מנגנון הפעולה של תרופות מאושרות קלינית.

רוב התרופות המכילות מולקולות קטנות מעוררות את הפעילות התרפויטית שלהן על ידי הפרעה לתפקוד של חלבונים, באמצעות התקשרות אליהם. זיהוי כל מטרות החלבון של תרופה מסוימת מספק בסיס להבנת פעולותיה המועילות והמזיקות. עם זאת, זיהוי אינטראקציות תרופה-חלבון הינה מטלה מאתגרת, כפי שניתן ללמוד מהעובדה כי המטרות העיקריות של תרופות מאושרות שונות עדיין אינן ידועות. מספר אסטרטגיות הוצעו עבור הזיהוי הישיר והעקיף של המטרות של מולקולות קטנות ביו-אקטיביות. הגישה הפופולארית ביותר לזיהוי ישיר של אינטראקציות תרופה-חלבון מבוססת על כרומטוגרפיית זיקה באמצעות תרופה בלתי פעילה. פרוטאומיקה כימית, המקשרת בין כרומטוגרפיית זיקה לזיהוי ספקטרומטריית מאסה, משמשת באופן נרחב לקביעת פרופילים של תרופות. למרות ההתקדמות הטכנולוגית, השימוש בפרוטאומיקה כימית נותר מסובך עבור זיהוי חלבוני מטרה בכמות נמוכה או חלבונים עם מסיסות או יציבות נמוכה בתמציות תאים. לפיכך, קיים צורך בגישות חלופיות לזיהוי אינטראקציות תרופה-חלבון.

תוצאות

מערכת Y3H המבוססת על תיוג SNAP-tag

מערכת Y3H הינה גרסא משופרת של מערכת שמרים דו-היברידית (Y2H) המותאמת לזיהוי אינטראקציות תרופה-חלבון. היא דורשת דרווטיזציה של התרופה עם ליגנד אותו ניתן לעגן לחלבון קושר-DNA בתוך תאי שמרים; האינטראקציה של התרופה המעוגנת עם חלבון המטרה מזוהה על ידי חיבור האסוציאציה שלהם לאקטיבציית התעתוק של גן מדווח. היתרונות של גישת אפיון תרופות זו כוללים: (i) הזמינות של ספריות cDNA מגוונות מרקמות ואורגניזמים שונים; (ii) האפשרות לזהות את תחומי התקשרות התרופות של חלבונים באופן ישיר; (iii) האפשרות לזהות חלבונים בכמות נמוכה; (iv) פשטות ניסויית. אך למרות תוצאות ראשוניות חיוביות, מערכת Y3H משמשת לפרופילי תרופות לעתים נדירות בלבד. חלק מהסיבות לכך הן (i) הצורך בצימוד של התרופה עם ליגנד ספציפי; (ii) הספיגה הנמוכה של מולקולות סינתטיות בשמרים והרגישות הנמוכה של מערכת Y3H; (iii) מספר גבוה של תוצאות חיוביות כוזבות הנובעות מהסריקה והקושי בזיהוי אינטראקציות אמיתיות בין התוצאות הכוזבות.

מערכת Y3H מבוססת על התיוג הקובאלנטי של חלבונים כימריים SNAP-tag בתוך תאי שמרים באמצעות נגזרות O6-בנזילגואנין (BG) (איור 1a). ניתן לבצע צימוד ישיר של נגזרות BG למגוון קבוצות פונקציונאליות, ובכך לאפשר את הדריווטיזציה של התרופה (נספחים, שיטות). בכדי לבסס סריקות Y3H מבוססות-SNAP-tag בתור כלי איתן ופשוט לקביעת פרופילי תרופות, ראשית פיתחנו ואפיינו מערכת המטפלת בחסרונות של אסטרטגיות קודמות.

פיתוח מערכת Y3H מבוססת- SNAP-tag רגישה

מידת תיוג ה- SNAP-tag עם התרופה הנבחנת תלוי בריכוז התוך-תאי של נגזרת התרופה. שיערנו כי הגדלת הריכוז התוך-תאי יגרום לעלייה דומה ברגישות מערכת ה- Y3H מבוססת-SNAP-tag. ההצטברות התוך-תאית של תרופות בשמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae) נפגעת לעתים קרובות על ידי מנגנון נשא רב-תרופתי יעיל. תאי שמרים מבטאים מגוון נשאי קסטות קושרי-ATP המקנים עמידות לתרופות כאשר הם בביטוי-יתר או היפר-רגישות כאשר הם נמחקים. לפיכך, מחקנו שלושה גנים (PDR5, SNQ2 ו- YOR1) המקדדים נשאי תרופות רחבי-ספקטרום מהגנום של זן שמרים Y3H מדווח (תוצאות נספחות ושיטות נספחות). הוכח בעבר כי מחיקה משולשת של PDR5, SNQ2 ו- YOR1 מגבירה את הרגישות של שמרים למגוון רחב ביותר של תרכובות. בנוסף, התיוג של חלבונים כימריים SNAP-tag בתאי שמרים עם נגזרות BG פלורוסנטיות הינו יעיל בזן שמרים עם אותן שלוש מחיקות. כימתנו את תיוג ה- SNAP-tag בזן המדווח של שלושת המחיקות (1A2) והשוונו אותו לזה של הזן המדווח הלא-נגזר (NMY51). מצאנו כי המחיקה המשולשת של PDR5, SNQ2 ו- YOR1 משפרת את יעילות התיוג של נגזרות BG שונות פי ארבע (איור נספח 2a-d).

בכדי לאפיין את הרגישות של מערכת Y3H בזן 1A2, ערכנו מחקרי מודלים המבוססים על קשירה של מתוטרקסאט לדיהידרופולרט רדוקטאז של E. coli (eDHFR). בחרנו באינטראקציה זו מכיוון שהוכח כי דריוויטיזציה של מתוטרקסאט בקבוצת הגלוטמיל γ-קרבוקסיל שלו אינה משפיעה על ההתקשרות ל- eDHFR וכי נגזרת BG של מתוטרקסאט (BG-Mtx) יוצרת דימר של SNAP-tag ו- eDHFR בשמרים. בנוסף, כוח הקשירה של מתוטרקסאט ל- eDHFR ניתן לאפנון באמצעות מוטציות נקודתיות. בנוסף לזן בר של eDHFR, הכנו שלוש מוטציות המכסות טווח רחב של זיקות התקשרות (KD מ- 20 pM עד 9 μm). לאחר מכן בחנו את צמיחת ה- Y3H שנגרמה על ידי הביטוי המשותף של חלבונים כימריים של SNAP-tag ו- eDHFR בריכוזים שונים של BG-Mtx (איור 1b). הצלחנו לזהות אינטראקציה של מתוטרקסאט עם eDHFRF31V,L54G (KD = 9 μm), המלמדת כי הרגישות של מערכת Y3H מבוססת-SNAP-tag המוצגת כאן נמצאת בטווח המיקרו-מולארי הנמוך. בשלב הבא השוונו את הביצועים של 1A2 לאלו של NMY51 ומצאנו כי המחיקה של PDR5, SQN2 ו- YOR1 משפרת באופן מובהק את הרגישות של מערכת Y3H מבוססת-SNAP-tag (איור נספח 3).

image1 80

איור 1: מערכת Y3H המבוססת על תיוג SNAP-tag. (a) איור של מערכת Y3H מבוססת-SNAP-tag שפותחה עבור זיהוי אינטראקציות תרופה-חלבון. נגזרת BG של התרופה הנבחנת (D) מתייגת באופן קובלאנטי SNAP-tag בתאי שמרים חיים. האינטראקציה של התרופה המעוגנת קובאלנטית עם חלבון המטרה (X) מזוהה על ידי חיבור האסוציאציה שלהן לאקטיבציית התעתוק של גן מדווח. (b) אפיון הרגישות של המערכת על ידי ניתוח גדילת ה- Y3H הנגרמת מאינטראקציות תרופה-חלבון של זיקה מוגדרת. ההתקשרות של מתוטרקסאט (Mtx) ל- E. coli DHFR (eDHFR) ניתנת לשינוי על ידי הצגת מוטציות נקודתיות בכדי לכסות טווח רחב של זיקות התקשרות. זיקות ההתקשרות המוזכרות הינן ערכים מפורסמים עבור ההתקשרות של מתוטרקסאט לא-נגזר ל- eDHFR או מוטציית eDHFR. תאי שמרים המבטאים במשותף LexA-SNAP ו- GAL4AD-eDFHR (או מוטציית GAL4AD-eDHFR) זוהו בתווך גדילה סלקטיבי עבור אקטיבציית גן מדווח בריכוזים שונים של נגזרת BG-מתוטרקאסט (BG-Mtx). קנ”מ, 5 mm.

הסרת תוצאות חיוביות כוזבות

השימוש בספריות cDNA בסריקות Y2H ו- Y3H מוביל לעתים קרובות לבידוד של תוצאות חיוביות כוזבות, בעיקר בשל הנוכחות של חלבונים היברידיים המתבטאים במסגרת קריאה שגויה או מאזורים לא מתורגמים של mRNA. פותחו מספר שיטות לצמצום ההיארעות של תוצאות כוזבות, על ידי החמרת הסינון של המערכת או באמצעות דרכים יעילות לסינון אינטראקציות לא-ספציפיות. עם זאת, החמרת הסינון באה לעתים קרובות על חשבון הרגישות. במערכת Y3H מבוססת- SNAP-tag אנו משתמשים בשתי אסטרטגיות עוקבות להסרת תוצאות חיוביות כוזבות.

ראשית, ניתן להפחית את מספר הקולוניות החיוביות הכוזבות הנוכחות בסריקות של ספריות cDNA באמצעות סלקציה שלילית מול אינטראקציות לא-ספציפיות בהיעדר נגזרות תרופה. בפרט, האנטי-מטאבוליט 5-FOA יכול להועיל לסלקציה מול אינטראקציות לא-ספציפיות המפעילות את הגן המדווח URA3 בזן 1A2 בהיעדר נגזרת תרופה, מכיוון שהתוצר של גן URA3 גורם לטרנספורמציה של 5-FOA לתרכובת טוקסית (איור נספח 4a-c). בחנו את היעילות של סלקציה שלילית זו בסריקות מודל ומצאנו הפחתה במספר האינטראקציות הלא-ספציפיות בפקטור של 30-70, כלומר צעד סלקציה שלילי אמור להפחית ביעילות את המספר של קולוניות חיוביות כוזבות בסריקות של ספריות cDNA (איור נספח 5a-c).

שנית, ניתן להסיר תוצאות חיוביות כוזבות לאחר סלקציה חיובית באמצעות ניסוי איכון פשוט שבו גדילת השמרים נמדדת בנוכחות ובהיעדר התרופה הנגזרת, מכיוון שרק הגדילה של תאי שמרים המכילים אינטראקציות אמיתיות תלויה בנוכחות של הנגזרת (איור 2a).

אימות האינטראקציות

אימות האינטראקציות בסריקות Y2H ו- Y3H הינו מורכב. יצרנו אסטרטגיה לניסוי pulldown יעיל המיישם את אותה נגזרת BG המשמשת לסריקות Y3H (איור 2b). בפרט, נגזרת ה- BG עוברת צימוד לחלבון כימרי גלוטטיון S-טרנספראז (GST)-SNAP ולחלבון המטרה המתבטא עם תיוג אפיטופ בתאי יונקים. הליכי pulldown המיישמים חרוזי גלוטטיון בנוכחות ובהיעדר התרופה הלא-נגזרת ולאחר מכן זיהוי של החלבון מתויג-אפיטופ באמצעות תספיג חלבון מאפשרים תיקוף מהיר של ההתקשרות של התרופה הלא-נגזרת לחלבון המטרה. בנוסף, ניתן להשתמש באותן נגזרות BG בכדי לאמת אינטראקציות באמצעות כרומוטוגרפיית זיקה של חלבונים אנדוגניים.

image3 46

איור 2: פלטפורמה מבוססת שמרים עבור קביעת פרופילי תרופות. (a) מערכת Y3H מבוסס- SNAP-tag מאפשרת סריקה של ספריות cDNA אנושיות לזיהוי מטרות של תרופות מולקולות-קטנות (D). תאי שמרים המבטאים במשותף LexA-SNAP ו- GAL4AD-X (X: שיבוט ספריית cDNA) מפוזרים על תווך גדילה סלקטיבי עבור אקטיבציית גן מדווח ובנוכחות של נגזרת BG של התרופה הנבחנת (BG-D). פגיעות Y3H ספציפיות מזוהות על ידי בחינת כל הקולוניות הגדלות על צלוחיות הסלקציה עבור תלות בנוכחות של BG-D לגדילה בתווך סלקטיבי. הזהות של פגיעות ה- Y3H נקבעות על ידי ריצוף מחדרי ה- cDNA וניתוח BLAST עוקב. (b) תיקוף בלתי תלוי של התקשרות התרופה הנבחנת לחלבון מטרה באמצעות כרומטוגרפיית זיקה תוך שימוש באותה נגזרת. מטריקס זיקה מוכן על ידי אימוביליזציה של חלבון כימרי GST-SNAP על חרוזי גלוטטיון והתגובה העוקבת של SNAP-tag עם BG-D. חלבון מטרה מתויג-אפיטופ (*) מציג ביטוי-יתר בתאי יונקים. ההתקשרות הספציפית של חלבון המטרה מתמצית תאים לתרופה הבלתי פעילה ניתנת לזיהוי באמצעות תספיג חלבון. ההתקשרות של התרופה הלא-נגזרת לחלבון המטרה ניתנת לזיהוי באמצעות ניסויי תחרות כפי שמוצג בתרשים.

קביעת פרופילים של תרופות מאושרות קלינית

תרופות מאושרות קלינית המכסות תחומים תרפויטיים שונים נבחנו על ידי מערכת הסריקה YH3 לאחר דריווטיזציה עם BG (טבלה 1 ואיור נספח 6a). תרופות מאושרות אלו כוללות תרופות שעברו פרופיל קפדני, כמו מעכבי הקינאז דסטיניב וארלוטיניב, ותרופות עם מנגנוני פעולה לא ידועים, כמו הסוכן האנטי-דלקתי סולפסלזין. למרות שבמקרים מסוימים (אטורוסטטין, ארלוטיניב ואינדומתצין) הדריווטיזציה הייתה צפויה להפריע לקשירה אל המטרה העיקרית של התרופה, השתמשנו בנגזרות אלו לחפש אחר מטרות נוספות. יש לציין שלשם הדה-קונבולציה, חשבנו לבחון את נגזרות ה- BG בניסוי מתאים כדי להבטיח שהפעילות מושבת או בכדי להכין נגזרות המותאמות בפוזיציות שונות. כללנו בנוסף שתי בקרות שליליות בסריקות ה- Y3H, BG ו- BG-(PEG)4, המתייגות SNAP-tag עם קבוצת בנזיל ועם מקשר בנזיל-פוליאתילן גליקול (PEG), בהתאמה. כל נגזרות ה- BG ושתי הבקרות השליליות תייגו בהצלחה SNAP-tag in vitro (איור נספח 6b).

מספר ספריות cDNA שהוכנו מרקמות אנושיות הינן זמינות מסחרית. עם זאת, חלבונים מסוימים עלולים לסבול מתת-ייצוג בספריות ספציפיות-לרקמה. בכדי לצמצם את התת-ייצוג של חלבונים, ערכנו טרנספורמציה של ספריות cDNA אנושיות מרקמות מגוונות בזן השמרים 1A2, כהכנה לסריקות Y3H. בנוסף, הפחתנו את שיעור החיוביים הכוזבים מספריות cDNA מסוימות על ידי סלקציה שלילית עם 5-FOA לפני הסלקציה החיובית (איור נספח 7a, b)

סרקנו כל נגזרת תרופה ואת שתי הבקרות מול 8 תכשירי ספריות cDNA אנושיות עבור 80 סריקות Y3H בסך הכול; 3069 קולוניות גדלו על צלוחיות הסלקציה ו- 849 מתוכן הציגו תלות גדילה בנוכחות של הנגזרת (איור נספח 7c, d). שתי הבקרות השליליות לא הניבו קולוניה אחת שהציגה תלות גדילה באף אחת משמונת הספריות. תוצאה זו מראה כי סריקות ה- Y3H מבוססות-SNAP-tag שלנו מחוללות מספק קטן של תוצאות חיוביות כוזבות (איור נספח 8a, b). ריצפנו את מחדרי ספריות ה- cDNA של כל 849 פגיעות ה- Y3H וקבענו 33 אינטראקציות תרופה-חלבון שכל אחת מהן יוצגה בין 1 ל- 237 פעמים (טבלה 1 ואיור נספח 8c, d).

מתוטרקסאט

מתוטרקסאט הינו אנטי-מטאבוליט אנטי-נאופלסטי עם תכונות מדכאות חיסון, הפועל על ידי עיכוב פוטנציה של DHFR אנושי (hDFHR) (ki = 5 pM). השתמשנו באינטראקציה זו כבקרה חיובית כדי לבחון את היעילות של מערכת YH3 מבוססת-SSNAP-tag. זיהינו 173 פגיעות התלויות בנוכחות של נגזרת המתוטרקסאט עבור הגדילה; כל 173 הפגיעות קידדו hDFHR או מקטע שלו, תוצאה המדגימה את היעילות של מערכת ה- Y3H. באופן בלתי צפוי, מצאנו כי אף מחדר cDNA לא הכיל hDFHR במסגרת עם GAL4AD (איור נספח 9a). למרות שהוכח בעבר כי חלבונים כימריים מחוץ-למסגרת ניתנים לזיהוי בסריקות Y2H, ניתחנו את היעילות של הסטות מסגרת תרגומיות במערכת ה- Y3H מבוססת-SNAP-tag על ידי בחינת היכולת של hDFHR ו- eDFHR המחוברים בכל 3 מסגרות הקריאה האפשריות ל- GAL4AD בכדי להפעיל תעתוק של הגן המדווח בניסוי גדילת מתוטרקסאט-DHFR Y3H. כל הקונסטרוקטים (חוץ מ- eDHFR במסגרת הקריאה +1) הציגו ביצועים דומים בניסוי הגדילה של Y3H (איור נספח 9b).

בנוסף, מצאנו שיעור גדילה מופחת בשני הקונסטרוקטים בתוך-המסגרת בהשוואה לקונסטרוקטים מחוץ-למסגרת על צלוחיות לא-סלקטיביות. כשירות מופחתת זו יכולה לכלות את שיבוט התוך-מסגרת מהספריות. באופן כללי, תוצאות אלו מראות כי מחדרי cDNA בכל שלושת מסגרו הקריאה מסוגלים לקודד אינטראקטורים אמיתיים וכי ניתן לדלל את החומציות של מחדרי ה- cDNA על ידי הפחתת רמת הביטוי בהסטות המסגרת (איור נספח 9c).

image4 50

טבלה 1: מבנים כימיים של התרכובות המשמשות במחקר זה ומטרות החלבון התואמות שזוהו באמצעות הפלטפורמה מבוססת-השמרים עבור קביעת פרופילי תרופות.

a התרופות חוברו ל- O6-בנזילגואנין בקבוצה הפונקציונאלית המסומנת באדום. b מספר הפגיעות המוצגות עבור כל מטרת חלבון מייצג את המספר הכולל של קולוניות שמרים עצמאיות שזוהו במהלך סריקות ספריות ה- cDNA. מטרות חלבון מודגשות הינן מטרות מוכרות. c מטרות תרופה שאומתו במחקר זה באמצעות כרומטוגרפיית זיקה. d מטרות תרופה שאומתו במחקר זה בניסוי פעילות.

מעכבי הקינאז דסטיניב, פורבלנול B וארלוטיניב

דסטיניב הינו מעכב טירוזין קינאז מתחרה-ATP המשמש לטיפול בלוקמיה מיילוגנית כרונית. הסריקות שלנו זיהו 16 חלבוני קינאז ותחומי קינאז כמטרות של דסטיניב (טבלה 1). הדסטיניב עבר קביעת פרופיל נרחבת באמצעות מגוון שיטות, כולל ניסויי התקשרות ישירים עם 287 קינאזים רה-קומביננטיים. התרופה נקשרת ל- 86 קינאזים בסך הכול (KD < 10 μM), 40 מתוכם עם זיקה גבוהה (KD < 30 nM). כל 16 הקינאזים שזוהו בסריקות כללו דיווח של KD עבור דסטיניב מתחת ל- 30 nM. לדעתנו הסיבה לכך היא כי רק אינטראקציות זיקה-גבוהה זוהו בסריקות שלנו, מכיוון שהתרופה צריכה להתחרות בתוך התא עם ריכוזים מילי-מולאריים של ATP. לאחר שזיהינו 40% מתת-הקבוצה של קינאזים עם קשירה הדוקה, השוונו את התוצאות שלנו לשני מחקרים קיימים לזיהוי מטרות של דסטיניב (טבלה נספחת 1). אחד המחקרים השתמש במתודולוגיה של פרוטאומיקה כימית כמותית המנתחת את התחרות בין התרופה לבין שרף זיקת קינאז-מעכב (Kinobeads) באמצעות ספקטרומטריית מאסה כמותית, עבור זיהוי של 17 מתוך 40 המקשרים בעלי הזיקה הגבוהה. המחקר השני השתמש בדסטיניב עם אימובליזציה קובלנטית בניסויי פרוטאומיקה כימית לזיהוי 20 מתוך 40 מקשרי זיקה גבוהה כמטרות עבור דאסאטיניב. שתי גישות הפרוטאומיקה הכימית הצליחו יותר בזיהוי אינטראקציות דאסאטיניב-קינאז חלשות, כנראה בשל יחס טוב יותר של נגזרות מול ATP בליזטים. השוואה זוגית של שלושת מערכי הנתונים מראה כי שני מחקרי הפרוטאומיקה חולקים את מידת הדמיון הגבוהה ביותר (טבלה נספחת 1). ממצא זה משקף את העובדה כי סריקת Y3H של ספריות cDNA מאפשרת זיהוי של מקטעים המקדדים את תחום הקינאז המסיס של מספר טירוזין קינאזים של רצפטורי טרנס-ממבראנות. חלבוני ממבראנה אינטגראליים שלמים הינם קשים לזיהוי גם בניסויי פרוטאומיקה כימית וגם בניסויי Y3H.

חמש מספריות ה- cDNA ששימשו לסריקות ה- Y3H של הדאסאטיניב סיפקו פגיעות ייחודיות (טבלה נספחת 2), ובכך הדגישו את החשיבות של השימוש בספריות cDNA מרקמות שונות. כיוון שמספר משמעותי של פגיעות דאסאטיניב היו מחוץ למסגרת (טבלה נספחת 2), אנו מאמינים כי רמת הביטוי המדוללת של מחדרי cDNA אנושי בעלי טוקסיות פוטנציאלית כמו קינאזים מעדיפה את הבידוד של מחדרי חוץ-מסגרת.

לבסוף, זיהינו מחדר חוץ-מסגרת המקדד הידרוקסיאציל-קואנזים A דהידרוגנאז (HADH) מ-4 ספריות cDNA שונות, אך לא זיהינו אינטראקציה בין HADH לבין דאסאטיניב בניסויי האימות (איור נספח 10a, b). אנו משערים כי קומפלקס משולש בין דאסאטיניב, פפטיד התוך-מסגרת וקינאז שמרים אחראי לסלקציה של מחדר ה- HADH החוץ-מסגרתי איור נספח 10a-c).

פורבלנול B פותח עבור עיכוב של קינאזים תלויי-ציקלין (CDKs); עם זאת, הוא נקשר גם לקינאזים אחרים. בודדנו מספר קינאזים שכבר בודדו בעבר (טבלה 1, איור 3a). באופן ראוי לציון, זיהינו אינטראקציה עקיפה בין פורבלנול B ו- CDK5 וסובסרט 1 של אנזים ABL1 (CABLES1) בתאי שמרים. פורבלנול B בלתי פעיל בודד ביעילות CABLES1 מתמצית תאי יונקים אך לא הצליח לבודד אותו מתמצית בקטריות (איור נספח 10d). ממצא זה מלמד כי אינטראקציות ה- Y3H מגושרת דרך קינאז חלבון שמרים, כמו CDK2 או CDK5, וכי סריקת Y3H מסוגלת ללכוד קושרים עקיפים.

ארלוטיניב הינו תרופה המשמשת לטיפול בסרטן ריאות של תאים-לא קטנים וסרטן הלבלב; זהו מעכב מתחרה-ATP הפיך של רצפטור גורם גדילה אפידרמלית (EGFR). ביצענו דרוויטיזציה של הארלוטיניב במחצית האלקין הטרמינלי, למרות שהמידע המבני הראה כי פעולה זו תפריע לקשירה שלו ל- EGFR ולקינאזים אחרים. בהתאם לכך, לא הצלחנו לבודד קינאזים מסלקציות Y3H באמצעות נגזרת ארלוטיניב זו, אך זיהינו חלבון 7 קושר-אוקסיסטרול הקשור בחלבון (ORP7) בתור המטרה הלא-קינאזית הראשונה, למיטב ידיעתנו, של התרופה. אימתנו את הקשירה של ארלוטיניב נגזר-BG ולא-נגזר ל- ORP7 באמצעות ניסוי pulldown (איור 3b). באופן מנוגד, מצאנו כי גם גפיטיניב וגם לפטיניב, שני מעכבי EGFR ספציפיים אחרים, אינם מסוגלים להתקשר ל- ORP7 (איור 3c). לאחר מכן הכנו נגזרת פלורוסנטית של ארלוטיניב (ארלוטיניב-TMR) והשתמשנו בה בניסויי קולוקאליזציה פלורוסנטית. בתאי U2OS אנושיים מקובעים וחדירים, מצאנו קולוקאליזציה של ארלוטיניב-TMR עם ORP7 מתוייג-אפיטופ (איור 3d, איור נספח 11a, b). לבסוף, ניתחנו את ההתקשרות של ארלוטיניב-TMR ל- ORP7 רה-קומביננטי בניסויי פולריזציה פלורוסנטית (KD = 230 nM, איור נספח 11c, d). בנוסף, מצאנו ארלוטיניב לא-נגזר מתחרה באופן יעיל עבור קשירה ל- ORP7 (IC50 = 100 nM, איור נספח 11e).

ORP7 הוא אחד מ- 12 חברים במשפחת ה- ORP. ה- ORPs קשורים במגוון פונקציות תאיות כמו שליטה בסינתזה, העברה ומטבוליזם של ליפיד, העברה של סטרולים ואפנון של טרנסדוקציית אותות; עם זאת, התפקוד של חברים אינדיבידואליים במשפחת ה- ORP אינו מאופיין היטב. ה- ORP7 הינו חלבון שייר-842 המכיל תחום קושר-סטרול בקצה הטרמינל-C שלו (440-830(. באופן ראוי לציון, פגיעת ה- ORP7 הקצרה ביותר שבודדה בסריקות ה- Y3H הכילה את חומצות אמינו 440-842, ממצא המלמד כי התחום קושר-הסטרול של ORP7 מעורב באינטראקציה עם ארלוטיניב. כיוון ש- ORP7 הינו המטרה הלא-קינאזית הראשונה של ארלוטיניב, אינטראקציה זו ותפקידה הפיזיולוגי דורשים חקר נוסף. בנוסף, מכיוון שהסובסטרט הטבעי והתפקיד הפיזיולוגי של ORP7 אינם ידועים, ארלוטיניב נגזר מייצג תרכובות כלית מעניינת.

image2 59

איור 3: ניתוח הפגיעות שהושגו מקביעת הפרופיל של פורבלנול B וארלוטיניב. (a) מטריקס זיקה של פורבלנול B הוכן על ידי קשירה של GST-SNAP לחרוזי גלוטטיון ותגובה של SNAP-tag עם BG-פורבלנול B. ליזט של תאי U2OS אנושיים המבטאים PTK2B או CABLES1 מתויגי-אפיטופ V5 עבר אינקובציה עם מטריקס הזיקה של פורבלנול B. החלבון שנקשר למטריקס הזיקה נותח באמצעות תספיג חלבון עם נוגדן אנטי-V5 מתויג-פרוקסידאז חזרת גינה (HRP). עבור ניסויי התחרות, הליזט עבר טרום-אינקובציה עם פורבלנול B לא-נגזר (10 μm (+) או 100 μm (++)). (b) מטריקס זיקה של ארלוטיניב הוכן על ידי קשירת GST-SNAP לחרוזי גלוטטיון ותגובה של SNAP-tag עם BG-ארלוטיניב. ניסוי pulldown של V5-ORP7 בוצע באופן אנלוגי לזה המתואר מעלה. (c) ניתוח של התקשרות מעכבי EGFR לא-נגזרים ל- ORP7 בניסוי pulldown תחרותי. ליזט של תאי U2OS אנושיים המבטאים V5-ORP7 עבר טרום-אינקובציה עם ארלוטיניב, לפטיניב או גפיטיניב (10 μm (+) או 100 μm (++)) לפני ביצוע ניסוי pulldown כפי שתואר מעלה. התספיגים המלאים מוצגים באיור נספח 14a. (d) מיקרופגים המראים קולוקאליזציה של נגזרת ארלוטיניב פלורוסנטית עם ORP7 מתויג-אפיטופ. תאי U2OS אנושיים מקובעים וחדירים המבטאים V5-ORP7 הוכתמו עם נגזרת טטראמתילרודמין (TMR) של ארלוטיניב (TMR-ארלוטיניב) ועם זיווג נוגדן אנטי- V5-פלורצין (anti-V5-FITC). התאים עברו דימות באמצעות מיקרוסקופיה פלורוסנטית בשדה רחב. קנ”מ, 10 μm.

אטורבסטטין

אטורבסטטין הינו חבר בסוג התרופות סטטין, המשמש לטיפול בהיפרכולסטרולמיה; זהו מעכב תחרותי של 3-הידרוקסי-3-מתילגלוטריל-CoAרדוקטאז (HMG-CoAreductase). המחצית דמויית-HMG של אטורבסטטין שוכנת באתר האקטיבי של האנזים, בעוד שהחלק ההידרופובי הקשיח של התרופה נמצא בחריץ רדוד לא-פולארי. למרות שדריווטיזציה של אטורבסטטין בקבוצת הקרבוקסיל שלו מפריעה לקשירה ל- HMG-CoA רדוקטאז, שיערנו כי נגזרת זו תאפשר זיהוי של off-targets. במחקר זה, אכן זיהינו מספר off-targets של אטורבסטטין. הפגיעות הרבות ביותר שזוהו בסריקות ה- Y3H היו תת-יחידת הדלתא של פוספודיאסטראז קנה רטינאלי (PDE6D) וקווינון רדוקטאז 2 (NQO2) (איור 4a). האינטראקציה של אטורבסטטין עם PDE6D ו- NQO2 דווחה בעבר ביישום פטנט, אך לא סופקו פרטים לגבי האופן שבו מזוהות אינטראקציות אלו.

אימתנו את הקשירה של אטורבסטטין ל- PDE6D בניסוי pulldown באמצעות חלבון מתוייג-אפיטופ וחלבון אנדוגני (איור 4b, איור נספח 12a). לאחר מכן בחנו את הקשירה של 8 סטטינים אחרים ל- PDE6D, ומצאנו כי רק אטורבסטטין נקשר ל- PDE6D (איור 4c). בנוסף לתפקידו בויסות הפעילות של פוספודיאסטראז קנה רטינאלי, הוצע כי PDE6D ממלא תפקיד גדול יותר באיתות תאים. ה- PDE6D קושר חלבונים ממשפחות ה- Ras, Rap, Rho, ו- Rab על ידי הצבת קבוצות הפרניל שלהם בכיס הידרופובי, באופן דומה למעכבי דיסוציאציה של נוקליאוטיד גואנין. אנו מניחים כי אטורבסטטין נקשר לאותו כיס הידרופובי. האינטראקציה של PDE6D חלבונים פרנילטידיים משפיעה על הלוקאליזציה התוך-תאית שלהם. מכיוון שסטטינים מעכבים את הביוסינתזה של כולסטרול ושל איזופרנואידים, הם מפחיתים את הפרנילציה של חלבונים ומפריעים ללוקאליזציות הממבראנה שלהם. קיימת אפשרות מעניינת כי אטורבסטטין משפיע באופן ישיר על לוקאליזציית החלבון באמצעות התקשרות לאתר קושר-פרניל של PDE6D.

ה- NQO2 הינו פלבופרוטאין הגורם להפחתה של קווינונים וככל הנראה מעורב בהפחתה מטאבולית בדה-טוקסיפיקציה קסנוביוטית. הוכח בעבר כי אימטיניב, תרופה המשמשת לטיפול בלוקמיה מיילוגנית כרונית, נקשר ומעכב NQO2 (ריכוז מעכב חצי-מקסימאלי (IC50) = 80 nM). כאן, מצאנו כי אטורבסטטין נקשר ל- NQO2 ומעכב את הפעילות שלו, אם כי עם פוטנציה חלשה בהרבה (IC50 ~ 50 μm) בהשוואה לאימטיניב (איור 4d, איור נספח 12b). ה- IC50 הגבוה יחסית של אטורבסטטין עבור NQO2 מעלה את השאלה האם אינטראקציה זו הינה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית.

לבסוף, בודדנו פגיעות המקדדות את התחום מפעיל-GTPase של חלבון מצבור breakpoint אקטיבי קשור-אזורית (Abr), שני חברים במשפחת רטינלדהיד דהידרוגנאז (ALDH1A2 ו- ALDH1A3), חלבון ביו-סינתזת יוביקווינון COQ9, ומקטע טרמינל-C של קינאז קושר-TANK 1 (TBK1). למרות שאימתנו פגיעות Y3H אלו בתאי שמרים שעברו רה-טרנספורמציה (איור 4a), לא הצלחנו לאמת את האינטראקציה של אטורבסטטין עם חלבונים אלו באמצעות ניסויי pulldown (איור נספח 12c, d). דרושים ניסויים נוספים כדי לאמוד את החשיבות של ממצאים אלו.

סולפסלזין

סולפסלזין הינו תרופה אנטי דלקתית המשמשת לטיפול בדלקות מעיים (IBDs) כמו קוליטיס כיבית, וגם לטיפול בדלקת פרקים שיגרונית. למרות חשיבותו הרפואית, מנגנון הפעולה של הסולפסלזין נותר בלתי ידוע. סולפסלזין נספג באופן חלקי מהמעי הדק ונישא למעי הגס שם הוא מצומצם באמצעות בקטריות לסולפאפירידין ומזלמין. ההשפעה התרפויטית של סולפסלזין ב- IBDs נגרמת, לפחות חלקית, משחרור המזלמין במעי הגס. הוצע כי הפעילות האנטי דלקתית של המזלמין נגרמת מהקשירה שלו לרצפטור-γ מופעל- פרוליפירטור פרוקסיזום (PPAR-γ). הסולפסלזין והמזלמין שונים זה מזה בתכונותיהם התרפויטיות ב- IBDs, כאשר הסולפסלזין מציג יעילות גבוהה יותר בשימור הרמיסיה של קוליטיס כיבית. חשוב מכך, רק הסולפסלזין מציג יעילות נגד דלקת פרקים שיגרונית. ייתכן וההבדל בין סולפסלזין ומזלימין נובע מהפרמקוקינטיקה שלהם; ייתכן גם כי לאחד מהם יש מטרות נוספות.

בסריקות ה- Y3H זיהינו את האנזים ספיאפטרין רדוקטאז (SPR) כמטרה של סולפסלזין (איור 5a). אישרנו את ההתקשרות של סולפסלזין נגזר-BG ובלתי-נגזר ל- SPR בניסוי pulldown באמצעות SPR מתויג-אפיטופ ואנדוגני (איור 5b, c). ה- SPR גורם לרדוקציה תלוית-NADPH של פירובויל-טטרהידרופטרין לטטרהידרוביופטרין (BH4), כאשר זהו השלב האחרון בביו-סינתזה של הקופקטור BH4. ה- BH4 משמש הידרוקסילאזים המעורבים בביו-סינתזה של טירוזין, דופמין וסרטונין; הוא משמש בנוסף גליצריל אתר מונואוקסיגנאזים המחוללים ליפידים המעורבים בטרנסדוקציית אותות. לבסוף, כל סינתזות החנקן החמצני (NOS) דורשות BH4 קשור היטב עבור פעילותן. לאחר מכן חקרנו את העיכוב של SPR רה-קומביננטי על ידי סולפסלזין בניסוי פעילות, ומצאנו כי סולפסלזין לא-נגזר מעכב SPR עם IC50 של 23 nM (איור 5d). לשם השוואה, מעכב ה- SPR המוכר N-אצטילסרוטונין (Ki = 0.12 μM) מכיל IC50 של 3.1 μm באותם תנאים. המטאבוליטים העיקריים של סולפסלזין גם מעכבים SPR אם כי עם פוטנציה נמוכה יותר; סולפאפירידין ו- N-אצטילסולפאפירידין עיכבו SPR עם IC50 של 480 nM ו- 290 nM, בהתאמה, בעוד שמזלמין מעכב SPR עם IC50 של 370 μm (איור 5d). בהשוואה, ערך ה- IC50 המדווח של מזלמין עבור PPAR-γ בניסוי קשירה מתחרה הינו 15.2 mM. בשלב הבא מדדנו את ההשפעה של סולפסלזין והמטאבוליטים שלו על רמות הביופטרין התוך-תאיות הכוללות בניסוי תאי. בריכוזים סאב-מילימולאריים, סולפסלזין, סולפאפירידין ו- N-אצטילסולפאפירידין הפחיתו ביעילות את רמות הביופטרין התוך-תאיות, ממצא המצביע על עיכוב של ביו-סינתזה של BH4 (איור 5e). הסולפאפירידין ו- N-אצטילסולפאפירידין מציגים פעילות רבה יותר בניסוי התאי בהשוואה לסולפסלזין, ממצא המשקף את העובדה כי סולפסלזין הינו סובסרט מוכר של חלבוני efflux. בהתאם לפעילות המעכבת הנמוכה שלו in vitro, מזלמין משפיע על הביו-סינתזה של BH4 בריכוזים גבוהים יותר (> 1 mM). בסך הכול, נתונים אלו מראים כי סולפסלזין והמטאבוליטים שלו הינם מעכבי SPR in vitro ובתרביות תאים. אנו מציעים כי העיכוב של הביו-סינתזה של BH4 על ידי סולפסלזין והמטאבוליטים שלו מעורב באופן מכריע במנגנון הפעולה של התרופה. הנימוקים שלנו מבוססים על הממצא כי מעכבי הביו-סינתזה של BH4 מפחיתים את התפוקה של NO במגוון מודלים דלקתיים. רמות גבוהות של NO ושל פעילות NOS בר-השראה (iNOS) נמצאו קשורות בדלקת פרקים שיגרונית וב- IBDs, בהתאמה, ומעכבי iNOS סלקטיביים מפחיתים דלקות גם במודלים של דלקת פרקים שיגרונית וגם במודלים של קוליטיס כיבית.

הריכוזים של סולפסלזין והמטאבוליטים שלו הדרושים לעיכוב של ביו-סינתזה של BH4 בניסוי התאי נמצאים בטווח של ריכוזי ה- in vitro שלהם. הריכוז המשולב של סולפאפירידין ו- N-אצטילסולפאפירידין בסרום ובנוזל סינוביאלי במהלך טיפול סולפסלזין סטנדרטי הינו בסביבות 100 μm. הערכים התואמים עבור סולפסלזין ומזלמין הם בסביבות 15 μm. קרוב לוודאי כי סולפאפירידין הינו רכיב אקטיבי של סולפסלזין בדלקת פרקים שיגרונית לאור עיכוב הביו-סינתזה של BH4 היעיל שלו בתרביות תאים והריכוזים שהוזכרו מעלה. אכן, נמצא כי סולפאפירידין לבדו מציג יעילות בטיפול בדלקת פרקים שיגרונית. בנוגע ל- IBDs, ריכוז המעי הגס התוך-לומינאלי של מזלמין במהלך טיפול סולפסלזין מועבר למעי הגס. אפילו ריכוזי מעי גס תוך-לומינאליים גבוהים יותר מושגים עם נוסחות מזלמין עבור נטילה טופיקלית. בהתחשב בריכוזים התוך-לומינאליים ופרופילי עיכוב הביו-סינתזה של BH4 של סולפסלזין והמטאבוליטים שלו, קיימת אפשרות כי כולם תורמים לעיכוב של הביו-סינתזה של BH4 באפיתליום של המעי הגס, ובכך מוסיפים למנגנוני פעולה אחרים של מזלמין ב- IBDs.

image5 38

איור 4: ניתוח הפגיעות שהושגו מקביעת הפרופיל של אטורבסטטין. (a) הקשירה של אטורבסטטין למספר חלבונים אנושיים זוהתה בסריקות Y3H מבוססות- SNAP-tag ואומתו בתאי שמרים לאחר טרנספורמציה חוזרת. תאי שמרים המבטאים במשותף LexA-SNAP ו- GAL4AD-SNAP-X (X = PDE6D, NQO2, ABR, ADLH1A2, ADLH1A3, TBK1 או COQ9) זוהו על תווך סלקטיבי גם בנוכחות וגם בהיעדר BG-אטורבסטטין. קנ”מ, 5 mm. (b) מטריקס זיקה של אטורבסטטין הוכן על ידי קשירת GST-SNAP לחרוזי גלוטטיון ותגובה של SNAP-tag עם BG-אטורבסטטין. PDE6D רה-קומביננטי עבר אינקובציה עם מטריקס הזיקה וחלבון הנקשר למטריקס נותח באמצעות SDS-PAGE והכתמת קומאסי. (c) ההתקשרות של מגוון סטטינים ל- PED6D נבחנה בניסוי התקשרות תחרותי. PDE6D רה-קומביננטי (2.5 μM) עבר טרום-אינקובציה עם סטטין לא-נגזר (100 μM) לפני אינקובציה עם מטריקס הזיקה של אטורבסטטין. החלבון שנקשר למטריקס נותח באמצעות SDS-PAGE והכתמת קומאסי. ההיעדרות של PDE6D שנקשר למטריקס הזיקה מצביעה על התקשרות של הסטטין הלא-נגזר ל- PDE6D. (d) ליזט של תאי U2OS אנושיים המבטאים NQO2 מתויג-אפיטופ V5 עבר אינקובציה עם מטריקס הזיקה של האטורבסטטין. החלבון שנקשר למטריקס הזיקה נותח באמצעות תספיג חלבון עם נוגדן אנטי-V5 מתויג-HRP. ג’לים ותספיגים מלאים מוצגים באיור נספח 14b.

פורוזמיד ואינדומתצין

פורוזמיד הינו דיורטי המשמש לטיפול בהצטברויות נוזלים והתנפחות גופנית על ידי הפחתת הספיגה החוזרת של אלקטרוליטים, בעיקר על ידי עיכוב של הסימפורטר Na+-K+-2Cl−. בנוסף, הוא מעכב חברים במשפחת הקרבוניק אנהידראז. זיהינו את קרבוניק אנהידראז 2 בתור מטרה של פורוזמיד אך לא הצלחנו לזהות את סימפורטר Na+-K+-2Cl− במחקר זה מכיוון שהוא חלבון ממבראנה אינטגראלי ולפיכך אינו מתבטא פונקציונאלית בגרעין של תאי שמרים.

אינדומתצין הינו תרופה אנטי דלקתית לא-סטרואידית שהשפעתה משויכת בעיקר לעיכוב לא-סלקטיבי של ציקלואוקסיגנאז 1 (COX-1, Ki = 0.016 μm) ו- 2 (COX-2, Ki = 5 μM). הדריווטיזציה של אינדומתצין עם BG בקבוצת הקרבוקסיל שלו אמורה להפריע לאינטראקציה עם מטרותיו הראשיות. בהתאם לכך, לא הצלחנו לזהות אינטראקציות אלו בסריקות ה- Y3H. התוצאות שהושגו עם פורוזמיד ואינדומתצין ממחישות שני חסרונות ומגדירות אתגרים עתידיים עבור גישת ה- Y3H: חוסר היכולת לזהות מטרות חלבוני ממבראנה אינטגראליים והצורך בדריווטיזציה של התרופה הנבחנת.

סריקה מבוססת-שמרים מראה כי סולפסלזין מעכב ביו-סינתזה של טטרהידרוביופטרין

אנו מציגים גישה לזיהוי אינטראקציות תרופה-חלבון המשלבת סריקת שמרים תלת-היברידית חדשה לזיהוי אינטראקציות עם כרומטוגרפיית זיקה עבור תיקוף חד משמעי. יישמנו מתודולוגיה זו עבור יצירת פרופיל של תרופות מאושרות קלינית, שהוביל לזיהוי של אינטראקציות תרופה-חלבון מוכרות ובלתי מוכרות. בפרט, הצלחנו לזהות off-targets עבור ארלוטיניב ואטורבסטטין, בנוסף למטרת אנזים עבור התרופה האנטי-דלקתית סולפסלזין. אנו נראים כי סולפסלזין והמטבוליטים שלו, סולפאפירידין ומזלמין, הינם מעכבים של האנזים המאפשר את השלב האחרון בביו-סינתזה של הקופקטור טטרהידרוביופטרין. הפרעה למטבוליזם של טטרהידרוביופטרין מספקת הסבר עבור חלק מהתכונות המועילות והמזיקות של סולפסלזין, ומציעה אפשרויות טיפוליות חדשות ומשופרות לתרופה. מאמר זה מספק גישה חזקה ליצירת פרופילים של תרופות ותובנות חדשות לגבי מנגנון הפעולה של תרופות מאושרות קלינית.

רוב התרופות המכילות מולקולות קטנות מעוררות את הפעילות התרפויטית שלהן על ידי הפרעה לתפקוד של חלבונים, באמצעות התקשרות אליהם. זיהוי כל מטרות החלבון של תרופה מסוימת מספק בסיס להבנת פעולותיה המועילות והמזיקות. עם זאת, זיהוי אינטראקציות תרופה-חלבון הינה מטלה מאתגרת, כפי שניתן ללמוד מהעובדה כי המטרות העיקריות של תרופות מאושרות שונות עדיין אינן ידועות. מספר אסטרטגיות הוצעו עבור הזיהוי הישיר והעקיף של המטרות של מולקולות קטנות ביו-אקטיביות. הגישה הפופולארית ביותר לזיהוי ישיר של אינטראקציות תרופה-חלבון מבוססת על כרומטוגרפיית זיקה באמצעות תרופה בלתי פעילה. פרוטאומיקה כימית, המקשרת בין כרומטוגרפיית זיקה לזיהוי ספקטרומטריית מאסה, משמשת באופן נרחב לקביעת פרופילים של תרופות. למרות ההתקדמות הטכנולוגית, השימוש בפרוטאומיקה כימית נותר מסובך עבור זיהוי חלבוני מטרה בכמות נמוכה או חלבונים עם מסיסות או יציבות נמוכה בתמציות תאים. לפיכך, קיים צורך בגישות חלופיות לזיהוי אינטראקציות תרופה-חלבון.

תוצאות

מערכת Y3H המבוססת על תיוג SNAP-tag

מערכת Y3H הינה גרסא משופרת של מערכת שמרים דו-היברידית (Y2H) המותאמת לזיהוי אינטראקציות תרופה-חלבון. היא דורשת דרווטיזציה של התרופה עם ליגנד אותו ניתן לעגן לחלבון קושר-DNA בתוך תאי שמרים; האינטראקציה של התרופה המעוגנת עם חלבון המטרה מזוהה על ידי חיבור האסוציאציה שלהם לאקטיבציית התעתוק של גן מדווח. היתרונות של גישת אפיון תרופות זו כוללים: (i) הזמינות של ספריות cDNA מגוונות מרקמות ואורגניזמים שונים; (ii) האפשרות לזהות את תחומי התקשרות התרופות של חלבונים באופן ישיר; (iii) האפשרות לזהות חלבונים בכמות נמוכה; (iv) פשטות ניסויית. אך למרות תוצאות ראשוניות חיוביות, מערכת Y3H משמשת לפרופילי...

295.00 

מק"ט 3a5bc410df55 קטגוריה
מק"ט 3a5bc410df55 קטגוריה

295.00 

סיוע בכתיבת עבודה מקורית ללא סיכונים מיותרים!

כנסו עכשיו! הצטרפו לאלפי סטודנטים מרוצים. מצד אחד עבודה מקורית שלכם ללא שום סיכון ומצד שני הקלה משמעותית בנטל.