אוסטיאופטרוזיס Targeted Disruption of the C-SIC Pmto-Oncogene Leads to Osteopetrosis in Mice

שיבוש ממוקד של הפרוטו-אונקוגן c-src גורם לאוסטיאופורוזיס אצל עכברים

איור 1: ווקטורי המטרה ורה-קומבינציה באתר (לוקוס) ה-c-src. A) מפת התחום של אתר ה-c-src. הבוקסות השחורות מייצגות אקסונים 2 עד 4. אקסונים 3′ ו-3” עוברים שחבור חליפי (alternative splicing) בנוירונים. E, N ו-S מייצגים אתרי ביקוע (cleavage) עבור EcoRl, Ncol ו- Sacll, בהתאמה. החצים מצביעים על רצפי אוליגונוקלאוטידים מקומיים המשמשים לניתוח ה-PCR. גשושים A ו-B ואורך המקטעים הצפוי המזוהה על ידי גשושים אלו מסומנים גם הם. B) מפת ווקטור המטרה src 4. קסטת ה- MC1neopA הוחדרה באותה אוריינטציית תעתוק כמו גן ה-c-src באתר ה- Ncol החופף עם ה- ATG המאתחל. הקווים הגליים מסמלים רצפי פלזמיד. C) המפה הצפויה של אלל ה-c-src שעבר מוטציה בעקבות הרה-קומבינציה ההומולוגית עם ווקטור ה-src 4. D) מפת ווקטור המטרה src 22. קסטת ה- Pol2sneobpA הוחדרה בין שני אתרי ה-Sacll הממוקמים באקסון 2. E) המפה הצפויה של האלל שעבר מוטציה בעקבות רה-קומבינציה הומולוגית עם ווקטור src 22.

ווקטור חלופי, src 4, מוצג באיור 1B. רצפי ה-c-src הכלולים במבנה זה מתארכים 1.7 kb במעלה הזרם (upstream) של הקודון המאתחל באקסון 2 (מספור האקסונים מתבצע לפי המחקר של טאקייה ואנאפוסה, 1983( ועד 1.3 kb במורד הזרם (downstream) של אקסון 4. קסטת ה-neo, pMC1neopA, הוחדרה באתר Ncol החופף את ה- ATG המאתחל של גן ה-c-src באקסון 2. הווקטור עבר אלקטרופורציה לתוך תאי CCE ES שלאחר מכן עברו סלקציה ב-G418 במשך 10 ימים. למרות ש- pMC1neopA הוא באופן כללי בעל יעילות טרנספקציה של 10-6  בלבד, ההחדרה של קסטת neo זו בהקשר של גן c-src הובילה להגדלה פי 10 של היעילות (טבלה 1). תוצאה זו הינה עקבית לממצאים המראים כי pMC1neopA הוא רגיש ביותר להשפעות פוזיציה. קולוניות G418r סוקרו באמצעות PCR במאגרים של 25, תוך שימוש בחמישית מכל קולוניה. פריימרי ה-PCR, שנגזרו מגן ה-neo ומרצף ה-c-src הגנומי במעלה הזרם שלא נכלל בווקטור המטרה, שימשו לזיהוי מקטע צומת של בערך 2 kb. מתוך מכלול של 30 מאגרים, 6 מאגרים הראו בנד (band) דיאגנוסטי חזק של הגודל הצפוי באמצעות הכתמת אתידיום ברומיד של הג’ל; בנדים אלו הפגינו היברידיזציה חזקה עם גשוש ה-c-src הפנימי. בוצע PCR על קולוניות אינדיבידואליות במאגרים חיוביים על מנת לזהות את שיבוטי המטרה. שיבוטים אלו הורחבו לאחר מכן לטובת ניתוח נוסף.

טבלה 1: יעילות הטרנספורמציה של קסטות ביטוי ה-neo. 107 AB2.1 תאים עברו טרנספקציה עם 20 µg של DNA ליניארי וגודלו בנוכחות של G418 במשך 10 ימים. כל קסטות הניאו הן בערך 4.5 kb, מלבד RV4.0 שהיא 8.0 kb. מבני ה-src הם בערך 13 kb. יעילות הטרנספקציות מחושבת ביחס ל- MC1neopA ואינן מתוקנות עבור ההבדלים בגודל המולה (molar) בשל הבדלי הגודל בין המבנים.

ששת שיבוטי ה-PCR החיובי נותחו על ידי היברידיזציית הספג דרומי (southern blot) באמצעות גשוש A, גשוש איגוף בצד ה-5′ של הווקטור (איור 2). בכל הנתיבים, בנוסף למקטעים האנדוגניים, התגלו בנדים בגודל שונה, דבר המצביע על מיקוד של האתר. תדירות המיקוד שהושגה באמצעות מבנה ה-src 4 הייתה לפיכך 1/125 G418r קולוניות (טבלה 2). עם זאת, הגודל והאינטנסיביות של בנדי ההיברידיזציה היו בלתי עקביים עם אירוע הרה-קומבינציה ההומולוגית הצפוי, על ידי שימוש במגוון של עיכולי אנזימי הגבלה. הרה-קומבינציה ההומולוגית באתר אמורה לגרום לאלל מוטנטי עם גודל צפוי והפחתה של 50% באינטנסיביות של האלל הנורמאלי. הדפוס הצפוי נצפה רק בשיבוט 1. בשיבוטים האחרים, הגשוש עבר היברידיזציה עם מקטעים בגודל הנכון אך באינטנסיביות גבוהה מהצפוי (השוואה בין עיכולי ה-Ncol בנתיבים 3 ו-4 עם נתיב 1 באיור 2), או שהוא עבר היברידיזציה עם מקטע או מספר מקטעים שלא היו בגודל הצפוי (איור 2, קווים 2-6). היברידיזציה עם גשוש neo חשפה החדרות מורכבות מרובות בקווי תאים אלו. ייתכן ועובדה זו מצביעה, בהקשר של גן ה-c-src, על כך שעותקים מרובים של קלטת ה-neo MC1 תלוית-הפוזיציה דרושים עבור סלקציית G418. בשל כך, ייתכן כי ערכנו סלקציה בלתי מכוונת עבור אירועי מטרה מורכבים.

איור 2: ניתוח הספג דרומי של שיבוטי ES שמוקדו באמצעות ווקטור ה- src 4. 5 µg של DNA מתאי ES (-) שלא עברו טרנספקציה ומשיבוטי המטרה 1-6 עבר עיכול עם EcoRl או Ncol ועבר ניתוח הספג דרומי באמצעות גשוש A. הבנדים הנמוכים (EcoRl) או הגבוהים (Ncol) מייצגים את אללי המטרה. ההחדרה (inset) מראה רה-היברידיזציה של גשוש β2 מיקרו-גלובולין ל- stripped filter, על מנת להדגים עומסים דומים בכל נתיב.

איור 3: ניתוח הספג דרומי של שיבוטי ES שמוקדו באמצעות ווקטור ה-src 22. 5 µg של DNA מתאי Es (-) שלא עברו טרנספקציה, שיבוטים שעברו מיקוד אינדיבידואלי (10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18), או שיבוט שאינו נושא אלל מטרה (15), עברו עיכול עם EcoRl ונותחו באמצעות הספג דרומי בעזרת גשוש A או גשוש B. הבנדים הנמוכים מייצגים את אלל המטרה.

יצרנו ווקטור שני באמצעות קסטת neo שונה על מנת ליצור אירועי מטרה עם המבנה הצפוי. המבחנים הקודמים הראו כי RV4.0, מבנה ניאו MC1 המשתמש ברצף הפוליאדנילציה של גן ההיפוקסנטין פוזפוריבאוסילטרנספראז (HPRT) במקום בגן HSV TK, בא לביטוי ביעילות רבה הרבה יותר מאשר pMC1neopA. מכיוון ש- RV4.0 הוא גדול למדי, בחנו רצף פוליאדנילציה נוסף. כפי שניתן לראות בטבלה 1, השימוש ברצף פוליאדנילציה המגיע מגן הורמון הגדילה bovine (bpA) הוביל לגדילה פי 36 במספר קולניות ה-G418r, ביחס ל-pMC1neopA. שני פרומוטורים נוספים נבחנו בעזרת אותו גן neo ואותו רצף פוליאדנילציה. גם פרומוטור ה- RNA פולימראז 2 (pol2) וגם פרומוטור הפוספוגליצראט קינאז 1 (PGK1) הובילו למספר קולוניות גבוה יותר מאשר פרומוטור ה-MC1. על מנת להגביל את גודל קסטת ה-neo עבור השימוש ברה-קומבינציה ההומולוגית, בחנו בנוסף גרסא קצרה יותר של פרומוטור ה-Pol2 (Pol2s). מבנה זה, Pol2sneobpA, הוביל למספר קולוניות זהה בערך כמו מבנה ה- MC1neobpA המשופר.

ווקטור מחליף, src 22, נוצר באמצעות קסטת ה- Pol2sneobpA. קסטה זו נבחרה מפני ששימוש בפרומוטור חלש יותר עלול להפחית את מספר קולוניות ה- G418r בגלל אירועי אינטגרציה רנדומאליים, בעוד שהביטוי של גן neo המוטבע באתר המתועתק באופן אקטיבי בתאי ES, כמו גן ה-c-src, יכול להתגבר. קסטת ה-neo הוחדרה בין שני אתרי ה-Sacll באקסון הקידוד הראשון של הגן (איור 1D). החדרה זו ממוקמת 47 חומצות אמינו במורד הזרם של קודון האתחול ומסירה 10 חומצות אמינו מגן ה-c-src. כתוצאה מכך, החדרת ה-neo מפרידה את תחום הקינאז מטרמינוס האמינו של החלבון, היכן שמתרחשת הצמדות הממברנה. מבנה זה אמור ליצור אלל null באופן כמעט ודאי, מכיוון שביטוי פעילות הקינאז יכול לנבוע רק מאתחול מחדש ב-ATG שני, ולא קיימים רצפי הסכמה (קונצנזוס) in-frame של ATG האתחול הקודמים לתחום הקינאז. ל- src 22 יש בדיוק את אותם רצפי c-src הומולוגיים כמו src 4, חוץ מההשמטה (deletion) הקטנה.

ה- src 22 עבר אלקטרופורציה בתאי ה-ES CCE ו- AB2.1. השיבוטים נאגרו ועברו ניתוח PCR. שיבוטים אינדיבידואליים זוהו במאגרים חיוביים באמצעות סיבוב נוסף של PCR. תדירות המיקוד של קולוניות ה-G418r הייתה דומה ביותר לתדירות שאובחנה אצל src 4, למרות שתדירות המיקוד האבסולוטית הייתה גבוהה יותר (טבלה 1). ניתוח הספג דרומי עם גשושים A ו-B, המאגפים את רצפי המיקוד בצידי ה-5′ וה- 3′ בהתאמה, הראו את הדפוס ההיברידיזציה הצפוי עבור הרה-קומבינציה ההומולוגית (איור 3). היברידיזציה עם איגוף או גשושים פנימיים על עיכול עם אנזימים שלא ביצעו חיתוך במבנה המיקוד הראתה אלל מטרה עם עלייה צפויה בגודל, בשל החדרת קסטת ה-neo, וגשוש neo שעבר היברידיזציה למקטע בודד של הגודל הצפוי. 11 שיבוטים, התואמים את אירוע הרה-קומבינציה ההומולוגית הצפוי הושגו באמצעות סיקור של 1750 קולוניות.

טבלה 3: הצגת אלל  ה- c-src שעבר מוטציה לתוך קו הגזע (germline). התרומה הממוצעת של תאי ה-ES לרקמות הסומאטיות של הכימרות נאמדה באמצעות הוספת שיערות אגוטיות (agouti) לצבע הפרווה. העברת קו הגזע נוטרה על ידי נוכחות של צאצאים אגוטיים מזיווגים עם נקבות C57BL/6j לא-אגוטיות. שיבוט 15 שימש כבקרה ולא נשא אלל מטרה. שיבוטים 12, 16, 17 ו-18 נשאו אלל מטרה c-src.

הצגת אלל המוטציה לתוך קו הגזע

בחרנו 4 שיבוטי AB.2.1 שמוקדו עם מבנה ה-src 22 על מנת ליצור עכברי כימרה. ניסויי בקרה שבוצעו קודם לכן הראו כי תאי AB2.1 יכולים להקים קולוניות בקו הגזע של עכברי כימרה ביעילות גבוהה, בדומה לקו התאים AB1. תוצאות המיקרו-הזרקות של תאים משיבוטי src הממוקדים לתוך הבלסטוציסטים מוצגות בטבלה 3. בערך 90% מהעכברים שנולדו היו כימרות והראו תרומות נרחבות לרקמות הסומאטיות, כפי שניתן לראות מכמות השיער האגוטי בפרווה. בנוסף, בערך 90% מהכימרות היו זכרים. הטיה מינית גדולה מסוג זה הינה צפויה, מכיוון שהזרקה של כמות מספיקה של תאי XY ES לתוך עוברי XX מובילה להמרת מין אצל העובר.

הכימרות הזכריות עברו רבייה על מנת לקבוע את תרומת תאי ה-ES לקו הגזע, באמצעות בדיקת נוכחות של צאצאים אגוטיים שנולדו כתוצאה מזיווגים עם נקבות לא-אגוטיות. כפי שניתן לראות בטבלה 3, 3 שיבוטים (15, 16 ו-18) יצרו קולוניות בקו הגזע באופן נרחב. אחד מהשיבוטים האלו (15), הוא בקרה שעברה בידוד במקביל לשיבוטי המיקוד אך אינו נושא את אלל המטרה. מתוך שני שיבוטי מיקוד קו הגזע, 16 ו-18, שהובילו ליצירת קווי העכברים src1 ו-src2 בהתאמה, 14 מתוך 15 זכרים העבירו את האלל המוטנטי לצאצאים שלהם. הזכר ה-15 היה בעל שגר אחד בלבד, שמת לפני שניתן היה לבדוק את צבע הפרווה. מתוך 14 הזכרים האלו, 6 הולידו צאצאים אגוטיים בלבד. כימרות “מושלמות” אלו ככל הנראה נובעות מבלסטוציסטים XX, מכיוון שתאי הגזע (germ cells) היחידים בעכברים אלו חייבים לנבוע מתאי ה-ES. בקווי התאים האחרים נוצרו כימרות זכריות מועטות. בקו 12, 2 זכרים פוריים לא הולידו צאצאים אגוטיים בשלושת השגרים הראשונים שלהם (צאצאים 22 ו-23 בהתאמה) ולא עברו ניתוח נוסף. בקו 17, נוצרה רק כימרה זכרית אחת, ועכבר זה היה בלתי פורה. כימרות קווי גזע עברו רבייה בנוסף עם עכברי 129Sv, מהם נגזרו תאי ה-ES, על מנת לשמר את המוטציה במסגרת של רביית-קרובים (inbred). עכברים הטרוזיגוטים לא הראו כל פנוטיפ בהשוואה לשותפי ה-wild-type שלהם בשגר, כפי שניתן לראות בהתבוננות חיצונית או באמצעות בדיקה היסטופאתולוגית.

התפתחות אוסטיאופטרוזיס אצל הומוזיגוטים src–

הטרוזיגוטים עבור המוטציה בגן c-src עברו הצלבה (intercross) על מנת לאמוד את השפעת אובדן ה-src בצאצאים ההומוזיגוטים. הגנוטיפים נקבעו באמצעות ניתוח הספג דרומי, על ידי גשוש איגוף. בתחילה, ניתוח זה בוצע על DNA שבודד מגורים בני 8 ימים (איור 4). 8 מתוך 25 הצאצאים שנותחו בגיל זה היו הומוזיגוטים עבור המוטציה. תוצאה זו מלמדת כי השיבוש בגן src אינו מוביל לתמותת עוברים.

על מנת לאמת כי המוטציה בגן c-src הייתה מוטציית Null, נבדקה פעילות mRNA ו- src בעכברי-wild-type, הטרוזיגוטים והומוזיגוטים. ניתוח הספג צפוני של RNA מוח באמצעות גשוש src cDNA הראה הפחתה במספר התעתוקים אצל הטרוזיגוטים בהשוואה לעכברי wild-type ולא הראה את שדר (message) ה-src הנורמאלי אצל ההומוזיגוטים; היברידיזציה עם גשוש ניאו הראתה תעתוקים הנובעים מפרומוטור ה- Pol2s בלבד. פעילות ה-src נמדדה בתמציות מוח באמצעות ניתוח אוטופוספורילציה קינאזי, לאחר אימונופרסיפיטציה עם נוגדנים מונוקלונליים (חד-שבטיים) נוגדי-src. הנוגדנים המונוקלונליים ששימשו לבדיקה זו הם ספציפיים ל-N טרמינוס של החלבון (Mab 2-17) או לתחום ה-src הומולוגיה 3 (Mab 327). נוגדנים אלו מזהים בשל כך אפיטופים המקודדים על ידי רצפים בשני צידי החדרת ה-neo. כפי שניתן לראות באיור 5, הטרוזיגוטים מפגינים פעילות קינאזית מועטה יותר מאשר עכברי ה-wild-type, ולא נראית כל פעילות בשני ההומוזיגוטים. תוצאה זו שוחזרה כאשר הוכנו תמציות מעכברים אחרים. דבר זה מצביע על כך כי המוטציה שנוצרה בגן c-src באמצעות רה-קומבינציה הומולוגית הינה מוטציית null, כפי שצפינו.

איור 4: זיהוי גנוטיפי של צאצאים שנולדו מהטרוזיגוטים. 5 µg של DNA עוכלו באמצעות EcoRl ועברו ניתוח הספג באמצעות גשוש A. צאצאי מוטציה wild-type (+/-), הטרוזיגוטים (+/-) והומוזיגוטים (-/-) הינם מסומנים.

איור 5: בדיקת אוטופוספורילציה קינאזית של תמציות המוח. תמציות הכוללות כל 250 µg חלבון מעכברי wild type (+/+), הטרוזיגוטים (+/-( ושני מוטציות הומוזיגוטים (-/-) עברו אימונופרסיפיטציה עם נוגדנים מונוקלונליים המזהים את תחום ה-src הומולוגיה 3 (Mab327) או האמינו טרמינוס (Mab 2-17) באמצעות סטפילוקוקוס אאוראוס בלתי פעיל. החלבון שעבר אימונופרסיפיטציה תויג בבדיקת פרוטאין קינאזי, הורץ על ג’ל SDS- פוליאקרילמיד 7.5%, ועבר אוטורדיוגרפיה. נכללות בנוסף תמציות בקרה שהשתמשו בחוצץ (c) בלבד.

טבלה 4: גנוטיפים של צאצאים שנולדו להורים הטרוזיגוטים. Wild-type (wt/wt), הטרוזיגוטים (wt/src-) והומוזיגוטים (src-/src-) עברו גנוטיפיה באמצעות ניתוח הספג דרומי על ידי גשוש c-src. גנוטיפים אלו ניתנים בנוסף להבחנה באופן פנוטיפי בהצלבה בין הטרוזיגוטים 129Sv/C57BL6J F1, מכיוון ש-c-src הוא קרוב במיוחד לאגוטים בכרומוזום 2. בהצלבות אלו, עכברי wild-type אמורים להיות שחורים, בעוד שהטרוזיגוטים והומוזיגוטים אמורים להיות אגוטיים, כשהעכברים ההומוזיגוטים מאופיינים על ידי העדר פנוטיפ שינים חותכות (incisor). ב-95 הצאצאים שנותחו באמצעות הספג, זיהינו שתי רה-קומביננטות בין src וצבע הפרווה, באופן עקבי למחקרים קודמים.

בחינה נוספת של ההומוזיגוטים חשפה פנוטיפ הקשור במוטציה. אותו פנוטיפ התגלה בקווי המוטציה שנבעו מכל אחד משיבוטי המטרה. בגיל 10-12 יום, ניתן היה לזהות הומוזיגוטים בשל גודלם הקטן יותר ובשל העובדה שהם פקחו את עיניהם מספר ימים לאחר שאר השגר. בגילאים מאוחרים יותר, העיניים שלהם נשארו מעורפלות בגלל הפרשות. העכבר ההיברידי C57BL/6J x 129Sv היה בעל צבע פרווה בהיר יותר, למרות שממצא זה לא התגלה אצל עכברי 129Sv בעלי רקע של רביית קרובים. הפגם החמור ביותר אצל עכברים אלו היה בכך ששיניהם החותכות לא התפתחו. ההומוזיגוטים התפתחו לאט יותר משאר השגר הנורמאלי ושקלו בערך שליש עד חצי פחות משאר השגר. למרות שרוב ההומוזיגוטים מתו בגיל 3-4 שבועות אם נגמלו מיניקה, ניתן לשמר כשליש מהעכברים לאחר 5 שבועות אם המשיכו לינוק וקיבלו מזון רך. לא נמצאו הבדלים ביכולת ההישרדות בין זכרים לנקבות, אך עכברים היברידיים שרדו יותר זמן מאשר עכברי רביית הקרובים 129Sv. לעכברים המבוגרים יותר היו פנים רחבות וראש מעוגל במקצת. עד עתה, העכברים ההומוזיגוטים המבוגרים ביותר הם בני 5 חודשים, ושוקלים 14-19 גרם.

ניתוח גנוטיפי של 95 צאצאים שנותחו בגיל 3 שבועות חשפו את היחס הצפוי של 2:1 בין עכברים הטרוזיגוטים לעכברי wild-type. עם זאת, רק 19% מהעכברים היו הומוזיגוטים (טבלה 4). כל העכברים ההומוזיגוטים התאפיינו בהעדר שיניים חותכות. ניתוח פנוטיפי של 271 צאצאים בגיל 3 שבועות אישר כי מספר ההומוזיגוטים היה נמוך מהמצופה. לפיכך, סביר להניח כי חלק מהעכברים ההומוזיגוטים מתו בשלב מוקדם, ייתכן שבעודם ברחם.

בחינה גולמית של הרקמות בהומוזיגוטים הייתה נטולת ממצאים חשובים, למעט עצמות ושיניים. העצמות הארוכות היו קצרות יותר, והגפיים היו גדולות ובעלות מבנה של אלה (club). ניתוח אורכי של עצמות הירך הראה מחסור חלקי של מח עצם, והעצמות היו לבנות ודחוסות באזור החיתוך. בחינה היסטופאתולוגית הראתה אוסטיאופטרוזיס קלאסי בכיפת הגולגולת, קונכיות האף, עצמות הפנים, הלסת התחתונה, עצם השוקה ועצמות הירך. פנוטיפ זה היה בולט במיוחד בעצמות הארוכות החל מגיל 10 ימים, וניתן היה לזהותו בעצמות הגולגולת כבר בלידה. חתכי העצמות הארוכות התאפיינו במרכזי צמיחה מעובים ודיאפיזה קצרה יותר עם קליפה בלתי מפותחת (איורים 6A ו-6B). נרשמה התפתחות עקבית של ספונגיוזה אנדוכונדריאלית עם התרחבות והתארכות של עצם טרבקולארית עמוק לתוך המטאפיזה והדיאפיזה הדיסטאליות. הטרבקולאר המרכזי הורכב בעיקר מסחוס מסויד. ספיגת העצם הייתה מזערית עד לא קיימת, והעדר הבנייה מחדש (remodeling) הוביל למילוי חלל מח העצם עם מרווח מועט ביותר ליסודות המאטופוייטים. העצם הקליפתית (cortical) הייתה רזה ובלתי מאורגנת (איורים 6C ו-6D). אוסטיאוקלסטים זוהו באמצעות הכתמה למציאת פעילות חומצת פוספטאז עמידה לטרטרט. אינטנסיביות ההכתמה נעה מהשחרה מוחלטת של הציטופלזמה להכתמה שלילית בחלק מהאוסטיאוקלסטים הניתנים לזיהוי מורפולוגי. עצמות הפנים התעבו בשל פרוליפרציה של רקמת פיברוס ורקמה גרמית, והעדר ספיגת עצם. הגדילה הבלתי נשלטת באזור זה גרמה להתפתחות דרכי נשימה קטנות יותר (איורים 6E ו-6F). חלק מהשיניים הטוחנות הראו סימני צמיחה אך נדחקו החוצה בשל הגדילה הגרמית, מה שהוביל להתפתחות דנטאלית בלתי מלאה ויצירת פסאודו-אודונטומות. השיניים החותכות התפתחו באופן מלא אך לא הצליחו לחדור מבעד לחניכיים. אצל חלק מהעכברים נמצאה דלקת פריודונטאלית סופורטיבית חריפה. שברים נקרוטיים ותאים דלקתיים חריפים נראו לעתים בתוך חלל הצינור הנאזו-לקרימאלי.

בדיקות המטולוגיות הראו פרמטרים נורמאליים של תאים אדומים ולבנים (נויטרופיל, לימפוציט, מונוציט ואאוזינופיל) וספירה נורמאלית של טסיות בהומוזיגוטים, בהשוואה לעכברי wild-type והטרוזיגוטים. הנקרופסיה לא הראתה כל סימנים לדימום או ליקויים בטסיות, והעכברים הראו יכולת החלמה בפצעים שנגרמו מהסרת זנב או אצבע. הכבד והטחול היו בגודל נורמאלי והפגינו המאטופויזיס אקסטרה-מדולרי, שנחשב נורמאלי בעכברים בגיל זה.

התאים הפרה-פוליקיולרים של בלוטת התריס היו נורמאליים. תאי הקופפר בכבד היו בכמות ומורפולוגיה נורמאליות. מכיוון שגן c-src מתבטא באופן גבוה במערכת העצבים המרכזית, חתכים רבים של המוח נבחנו היסטולוגית גם בשיטות קונבנציונאליות וגם באמצעות הכתמת אקסון. חתכים אלו התבצעו לאורך הטוברקל האולפקטורי, תצלובת הראייה, ה- tuber cinereum, הגשרון (pons), המוח הקטן, והמוח המוארך. לא נמצאו פציעות מיקרוסקופיות, וארכיטקטורת המוח הכללית ופסיקולציית והתארכות האקסונים נראו נורמאליות.

דיון

באמצעות רה-קומבינציה הומולוגית בתאי ES, יצרנו עכברים הנושאים מוטציית null בגן c-src. ווקטורים הכוללים 8.8 kb של רצפי c-src וקסטת neo ביטוי באקסון הקידוד הראשון נבנו על מנת לבצע מיקוד בגן. שני ווקטורים הניבו תדרי מטרה של בערך 1 מ-150 קולוניות G418r. תדירות זו הייתה גבוהה מספיק כך שסיקור PCR היה ניתן לביצוע באופן ישיר ללא צורך בסלקציה שלילית. באחד הווקטורים, src 22, האלל המוטנטי היה בעל מבנה שנצפה על ידי הרה-קומבינציה ההומולוגית. שיבוטי ES שעברו מיקוד על ידי מבנה זה שימשו להולדת עכברים בעלי חוסר ב- src.

באופן מפתיע, מיקוד האתר באמצעות הווקטור האחר, src 4, לווה בהכפלה ושילוש של רצפי c-src מאגפים, קרוב לודאי תוצאה של הסתעפות מווקטור המטרה לרצפים גנומיים מאגפים. ייתכן כי הרה-קומבינציה גרמה להחדרה גדולה באתר. עיכול מגביל באמצעות אנזימים שאינם חותכים את מבנה המטרה תומך בהסבר זה. באופן חלופי, ייתכן והתוצרים של ריאקצית המטרה עברו אינטגרציה במקום אחר בגנום. אירועי רה-קומבינציה דומים נצפו במחקרים קודמים. האבחנה המשמעותית ביותר הינה ההבדל באירועי המטרה המשתמשים בשני מבנים דומים ביותר, שמובדלים זה מזה בעיקר בגלל קסטת ה-neo ביטוי. מכיוון שעותקים רבים של גן ה-neo היו נוכחים בשיבוטים ממוקדי src-4, ייתכן וגן ה-neo מתבטא באופן דל כאשר הוא מוקף ברצפים גנומיים של c-src, וכי עובדה זו מובילה לסלקציית תאים המכילה עותקים מרובים של מבנה המיקוד. באופן מנוגד, החדרת neo ממוקדת בודדת הייתה נוכחת בכל שיבוטי המטרה שנוצרו עם ווקטור src 22. תדירות המיקוד האבסולוטית הייתה גבוהה פי 5-4 כאשר משתמשים בווקטור src 22. קסטות ה- Pol2neobpA או ה-PGKneobpA שתוארו כאן שימשו בעבר בניסויי מיקוד מוצלחים אחרים, ולכן ייתכן והם בעלי תועלת כללית.

ארבע שיבוטים שמוקדו באמצעות מבנה src 22 שימשו כדי להוליד עכברי כימרה. שיבוטים אלו נוצרו בקו תאים AB2.1 שהראה תרומה משמעותית לקו הגזע. ארבעת השיבוטים תרמו באופן משמעותי לרקמות הסומאטיות של הכימרות, ושני שיבוטים תרמו לקו הגזע. אחד הקשיים עם תאי ES שנובעים מניסויי מיקוד גנים היה אמינות הביסוס של האלל המוטנטי בקו הגזע. העברה מוצלחת של קו הגזע הושגה בעזרת קו AB2.1, הדומה מבחינה זו לקו AB1 ממחקרים קודמים. עד היום, 25 מתוך 29 שיבוטים עצמאיים מקווים אלו תרמו לקו הגזע. ייתכן ועובדה זו נובעת מתכונות מולדות של התאים או תנאי התרבית. התדירות הגבוהה של העברת קו הגזע גרמה לבידוד שני קווי עכברי ה- src- שנולדו משני שיבוטים עצמאיים.

ניתן היה לצפות את מותם המוקדם של עכברי ה- src- מכיוון שייתכן ו-src ממלא תפקיד במחזור התא. אם תפקיד זה הינו חיוני, המוטציה בגן c-src אמורה להוביל לפנוטיפ ממית תאים. העובדה כי הומוזיגוטים שורדים כלל מצביעה על כך ש- src לבדו אינו בעל תפקיד חיוני במחזור התא, אם כי ייתכן והוא ממלא תפקיד כזה בסוגי תא מסוימים. הומוזיגוטים יהיו יעילים ביצירת מגוון תאי src- בהם ניתן להיעזר במחקרים עתידיים ללא הנוכחות הבעייתית של פעילות src אנדוגנית.

הפנוטיפ העיקרי הקשור במוטציה של גן c-src הינו צורה רצסיבית של אוסטיאופטרוזיס. ההטרוזיגוטים לא הראו כל הבדלים מורפולוגיים בהשוואה לעכברי wild-type. הכלאה של הטרוזיגוטים הובילה להומוזיגוטים שכולם הפגינו את אותו פנוטיפ. תוצאה זו הושגה אצל שני קווי המוטציה src אך לא אצל קווים אחרים שנגזרו מתאי AB2.1, עובדה המצביעה באופן משמעותי על כך כי הפנוטיפ הנצפה הוא תוצאה של המוטציה בגן c-src, ואינו תוצאה של מוטציה קודמת בתאי ES. בנוסף, שתי מוטציות אחרות עם החדרות גדולות בין אקסונים 3 ו-4 של הגן c-src נוצרו בקו תאים AB1 באמצעות רה-קומבינציה הומולוגית והולידו עכברים מוטנטים שמפגינים גם הם את אותו פנוטיפ. בשלב זה, איננו יודעים מדוע ההומוזיגוטים מתים. ייתכן וגודלם הקטן והמוות הם תוצאה של תזונה בלתי מספקת, מכיוון שלעיסה אצל ההומוזיגוטים הינה בעייתית בשל צמיחה חלקית של השיניים והתעבות הלסת ועצמות הפנים. הסבר אחר, המגיע ממחקר שנערך על בני אדם הסובלים מאוסטיאופטרוזיס, הוא כי דרכי הנשימה ואיברים חיוניים אחרים מושפעים מהפגמים בעצמות, דבר המוביל למוות בגילאים שונים. ייתכן והסבר זה עונה גם על השאלה מדוע רק 20% מהעכברים שסוקרו בגיל 3 שבועות הם הומוזיגוטים, במקום ה-25% הצפויים.

אוסטיאופטרוזיס מאופיינת על ידי הפחתה בולטת בקצב ספיגת העצמות, ללא שינוי בקצב יצירת העצמות. עובדה זו מובילה לפגם במילוי, תחילה באזור המטאפיזיאלי ולאחר מכן בחלל מח העצם של הדיאפיזה. הפחתה זו בספיגת העצם נגרמת בשל ירידה בתפקוד האוסטאוקלסט. מחלה זו אובחנה בארבע זני עכברים, אצל בני אדם, ואצל בעלי חיים אחרים. האוסטאוקלסטים אצל מוטציות הסובלות מאוסטיאופטרוזיס הם רבים יותר או פחותים יותר מאשר אצל אחיהם הנורמאליים לשגר, ללא השפעה על המחלה כאשר הם פגומים. מספר האוסטאוקלסטים מייצג ככל הנראה רק את יכולת הפרוליפרציה של קודמיהם בתגובה להפחתה בספיגת העצם. האבנורמאליות בשיניים של עכברי אוסטיאופטרוזיס יכולה לנבוע מבעיה מכאנית מקומית הנגרמת בשל אספקה לא נאותה של חומרים מזינים לגזע השן המתפתחת ודחיסות גוברת של העצמות הסובבות, ובשל כישלון ספיגת העצם למלא את דרישות החלל של השיניים המתפתחות.

מכיוון שאוסטאוקלסטים עדיין היו נוכחים במוטציות src- ההומוזיגוטיות, ייתכן והפגם הוא באוסטאוקלסטים או במיקרו-סביבה המשפיעה על תפקוד האוסטאוקלסטים. מספר ראיות מצביעות על כך שאוסטאוקלסטים נובעים ממונוציטים מחזוריים ברקמות המאטופוייטיות, וכי מיקרו-סביבה מתאימה המסופקת על ידי תאים סטרומליים של מח העצם תאפשר התמיינות ממאקרופאגים בוגרים. יהיה זה מעניין לבדוק האם מוטציית ה-src הינה אוטונומית לתא באמצעות בדיקה האם השתלות מח עצם או כבד עוברי יכולות לחלץ את פנוטיפ האוסטיאופטרוזיס בעכברי src- או להעביר אותו לעכברי wild-type. אחת ממוטציות האוסטיאופטרוזיס בעכברים, מוטציית op, נגרמת בשל מוטציית התמרה (point mutation) בגן הפקטור המעורר-קולניות מאקרופאג (M-CSF או CSF-1). יש לציין כי מוטציית ה-op מערבת בנוסף טירוזין קינאזי, c-fms, מכיוון שזהו הרצפטור של CSF-1. לא ברור בשלב זה אם מוטציות ה-op וה- src הן קשורות זו לזו, ייתכן ועל ידי השפעה על מצע (substrate) אפשרי במורד הזרם בקסקייד (cascade) טרנסדוקציית האות, המשותף ל-c-src ול-c-fms.

הפנוטיפ בו הבחנו עבור עכברים החסרים את גן c-src הינו בלתי צפוי. למרות שמונוציטים מתמיינים מראים פעילות src גבוהה, src מתבטא באופן הגבוה ביותר במערכת העצבים המרכזית ובטסיות. למרות רמות ביטוי גבוהות אלו, ייתכן ו-src אינו ממלא תפקיד חיוני ביצירת קווי תורשה אלו, מכיוון שלא נמצאה כלל אבנורמאליות. עם זאת, לא ביצענו ניתוח התנהגותי מפורט של ההומוזיגוטים src, שיצביע על תפקיד פיזיולוגי של c-src במערכת העצבים המרכזית. בזבוב הדרוזופילה, גן טירוזין קינאזי נוסף, abl, נמצא כמעורב בפסיקולציות אקסון במערכת העצבים המרכזית, למרות שמוטציות בגנים אחרים נדרשות להראות תפקיד זה. הכתמת אקסונים בעכברי src- הראתה התארכות וצרורות (bundling) נורמאליים.

Src הוא בן למשפחה של קינאזות דומות, כולל yes, fyn, hck, ick, fgr, lyn, blk. קינאזות אלו חולקות מידה גדולה של דמיון. חלק מקינאזות אלו הן בעלות ביטוי מוגבל, בעיקר בתאים המאטופוייטים, אך שתי קינאזות, yes ו-fyn, מתבטאות באופן נרחב וחולקות את הדמיון הרב ביותר עם src. בדומה ל- src, קינאזות אלו מתבטאות באופן גבוה במוח, ושלושתן הראו יכולת ליצור קומפלקסים עם הרצפטור PDGF. בשל כך, ייתכן וחלבונים אלו ממלאים תפקידים דומים בתאים רבים. התפקידים החופפים של חברים שונים בקבוצת גנים זו עשויים להסביר מדוע הפנוטיפ הנצפה אצל עכברים בעלי חוסר ב- src אינו חמור יותר ברקמות בהן src מתבטא באופן גבוה. יהיה זה מעניין ליצור מוטציות null במשפחת הגנים של src אצל עכברים ולבדוק את ההשפעה שלהם in vivo. בנוסף, הכלאות בין זני עכברים הנושאים מוטציות בכל אחד מהגנים האלו עשויות לחשוף את הקשרים בין קינאזות הטירוזין הקרובות ל-src.