אנדופפטידאזות פעילות וסלקטיביות מאוד עם ספציפיות מתוכננת של סובסטרטים Highly active and selective endopeptidases with programmed substrate specificities

אנדופפטידאזות פעילות וסלקטיביות מאוד עם ספציפיות מתוכננת של סובסטרטים

 תקציר

יצרנו משפחה של אנדופפטידאזות (endopeptidases) מהונדסים שמסוגל לחתוך מגוון רחב של רצפי פפטיד עם

סלקטיביות גבוהה ויעילות קטליטית גבוהה (kcat/KM 4 104 M–1 s–1).על ידי סקירת ספריות עם שיטת סלקציה וסלקציה נגדית של סובסטרטים, תוכננו גרסאות/וריאנטים של פרוטאז לזהוי חומצות אמינו שיש להם מטען, גודל ובתכונות הידרופוביות שונות, כולל Glu-Arg, ספציפיות שלדעתנו לא נצפתה בפרוטאזות טבעיות. בני משפחת פרוטאז מלאכותית זו נבעו ממספר קטן יחסית של החלפת חומצות אמינו אשר (לפחות במקרה אחד) הוכחו כאפיסטטיים.

 מבוא

בסביבות 2% של הגנום של היונקים מקודד עבור אנזימים המעורבים בדגרדציה (פירוק) חלבון. נתון זה מדגיש את התפקיד הבסיסי של פרוטאוליזה באורגניזמים חיים 1 .פרוטאוליזה לא מבוקרת in-vivo הוא קטלני, ולכן יש דרישה קריטית לספציפיות לרצף מדויק כמו גם שליטה בזמן ובמרחב על פעילות הפרוטאז 2,3 .ליכולת להנדס פרוטאז כדי לחתוך רצף פפטיד רצוי באופן סלקטיבי עם יעילות קטליטית גבוהה יש חשיבות רבה עבור יישומים אנליטיים, ביוטכנולוגיים ואפילו טיפוליים 4-7 .למרות שהתועלת של מוטוגנזה מונחת-מבנה להחלפת העדפות סובסטרט בין פרוטאזות הומולוגיות הוכחה בעבר 8,9 , הנדסה מערכתית של ספציפיות של פרוטאז כדי להתאים קבוצה מגוונת של רצפים של סובסטרטים תוך שמירה על הפעילות הקטליטית גבוהה נותר חמקמק. יתר על כן, מאמצי אבולוציה מכוונת טיפוסי לשנות את העדפות הסובסטרט הובילו לעלייה באנזימים המציגים סלקטיביות נמוכה או מחזור נמוך יותר עבור הסובסטרט החדש 10,11 . במאמר זה אנו מדווחים על היכולת הכללית לתכנן משפחה של פרוטאזות סלקטיביות ופעילות עם ספציפיות חדשה של הסובסטרט בשתי עמדות P1 ו- P1, כולל רצפים שאינם מזוהים על ידי האנזים wild-type (WT).באמצעות מבחני סלקציה של שני-סובסטרטים- עבור סלקציה- ועבור סלקציה נגדית, – מבחני זרימה ציטומטרית לסריקת ספריות שהופקו בשיטות שונות של גיוון, גרסאות פרוטאזות שתוכננו כך שיהיו ספציפיות לקשרים המורכבים מחומצות אמינו עם מטען, גודל וההידרופוביות  שונה, כולל Glu-Arg, ספציפיות שאינו מועדף על ידי פרוטאז טבעי כלשהו.

תוצאות

אסטרטגיות סלקציה וסלקציה נגדית

ל endopeptidase OmpT שעל שטח הפנים של Escherichia coli יש ככל הנראה תפקידים מרובים באלימות של החיידק 12 והוא מציג העדפה חזקה של חיתוך בין זוגות של חומצות אמינו בסיסיות ליזין וארגנין (במיוחד זו האחרונה), חיתוך זוגות אלה הוא עם יעילות קטליטית גבוהה 13 .

חשוב לציין, OmpT אינו פעיל עד שהוא משתלב בממברנה החיצונית E. coli, כדי למזער את הלתליות של המארח 14 .מבחן כמותי, מבוסס תא יחיד עושה אופטימיזציה עבור טווח דינמי וספציפיות נמוכה כדי לבודד רק גרסאות OmpT המסוגלות לחתוך selection peptide substrate (SelSub))) הרצוי שהינו פפטיד הסלקציה אבל לא סובסטרט של סלקציה נגדית (counterselection substrate (CtsSub)) (איור 1 א, נ”צ). 15). בקצרה, SelSub מורכב מפלורופור- BODIPY ומקבוצה טעונה חיובית בצד אחד של האתר חיתוך ו quencher על הצד אחרים. חיתוך אנזימים המוצגים על פני שטח התא מביא לשחרור של מחצית quencher, ובכך משפר את הפלורסנטיות של BODIPY.  התוצר פלואורסצנטי, שבו יש  מטען כולל של +3, נתפס אלקטרוסטטית על המשטח שלילי e.coli. ל- CTSSub יש מטען חיובי ופלורופור tetramethylrhodamine (TMR)  בצד אחד של אתר החיתוך ורק מטען שלילי אחד על הצד השני (לא quencher). עם החיתוך, המטען השלילי משתחרר, ומעלה את המטען החיובי הכולל של התוצר הפלורסנטי אשר נתפס שוב על פני E. coli.  זרימת ציטומטרית משמשת לבודד וריאנטים המציגים BODIPY (ירוק) פלואורסצנטי גבוהה ומעט או בכלל לא TMR (אדום) פלואורסצנטי.

השתמשנו בגישה זו כדי להנדס משפחה של גרסאות OmpT עם ספציפויות שונות של ח”א של הסובסטרט ב P1 ו / או P1 ¢. אנו בקשנו לבודד את הגירסאות הפעילות מאוד המציגות

104 M–1 s–1 kcat/KM >

בחיתוך הסובסטרטים- SelSub

וסלקטיביות של לפחות פי 50 ביחס לחיתוך של CtsSub המכיל רצף Arg-Arg המועדף על אנזים WT.

היפוך קוטביות זוג יונים ב P1

באופן בלתי צפוי, ובניגוד לתחזיות תיאורטיות קודמות 16 , בעיית העיצוב/התכנון הכי קשה היתה ההיפוך של זוג יונים. יש לציין שלמרות שהיפוך זוג יון כבר נוסה בהקשר של טריפסין וגרנזים)   (granzyme B, אנזימים מהונדסים לא הפגינו הידרוליזה של המטען המנוגד בסובסטרט 17,18 .שלושה חומצות אמנינו (Glu27, Asp208 ו Ser223) היוו מטרה למוטוגנזה כי הם מהווים את החלק התחתון של כיס S1 המשוער של OmpT (ref 19).

הספרייה שהתקבלה המכילה מיליון  טרנספורמנטים נסרקה באמצעותnM  20 SelSub 1a (איור 1), המכיל גלוטמט ב P1 המשוער וארגנין ב P1 ¢, ובאמצעות – ו 100nM CtsSub 5a, אשר מכיל אתר קישור Arga-Arg .

תאים המציגים רק פלורסנטיות גבוהה של BODIPY בודדו על ידי ארבעה סיבובים של זרימה ציטומטרית, וכתוצאה מכך בוצע זיהוי של הואריאנט/הגרסא ER-OmpT, אשר הכיל שלוש מוטציות שבהן הקוטביות של Subite S1 (איור 2, משלים איור 1 באינטרנט) התהפכה.

 ER-OmpT נקיים עשו הידרוליזה ל- פפטיד ללא תווית

 WCERVGKGRGR (1b)

בין Glu-Arg עם יעילות קטליטית גבוהה (kcat/KM ¼ 3 ± 2 _ 105 M–1 s–1  , טבלה 1, מידע משלים נמצא באיור 2 באינטרנט).WT OmpT לא חותך 1b, ו- ER-OmpT לא חותך את הסובסטרט המועדף על -5b -WT, לכן ER-OmpT עונה על הקריטריונים של סלקטיביות סובסטרט משתנה ויעילות קטליטית גבוהה כפי שהוגדר לעיל. למיטב ידיעתנו לא דווח על אנזים טבעי שחותך באופן סלקטיבי בין Gluל- Arg. לכן ER-OmpT מציג ספציפיות חדשה של פרוטאז. אתר הקישור המוטנטי אחראי למעבר סלקטיבי של הסובסטרט של ER-OmpT אשר נחקרו אינדיבידואלית ונמצאו אפיסטטים. ספציפיות של חומצות אמינו ארומטיות ופולריות ב- P1 והבידוד של גרסאות OmpT שמקבלות באופן ספציפי ח”א ארומטיות (טירוזין) או פולריות (תראונין) ב- S1 דורש את השימוש באסטרטגיות מורכבות יותר לגיוון הרצף. מתוך מטרה לסרוק ספריית מוטנטים שנוצרה בעזרת PCR או ספריית- Glu27, Asp208, Ser223 עם SelSub (2a and 3a,) ו- CtsSub 5a , בהתאמה, נכשל להניב ואריאנטים עם הפעילות הרצויה. לכן הוקמה ספריית מוטנטים בעזרת 21 ח”א המכסה את כל אתר הקישור- OmpT חוץ מהחומצות אמינו קטליטיות – Asp83, Asp85, Asp210 and His212 אשר נבנו דרך אוליגונוקלאוטיד על בסיס ריאקציות של gene assembly ((שבהן יש דגנרציה NNS (N ¼ T,A,G,C; S ¼ G or C) oligonucleotides (90 mol %) were mixed with the WT oligonucleotides (10 mol %))). מתקבלת ספריה של 2*10^8 טרנספורמרים אשר נסרקו נגד SelSub 2a  ונגד- CtsSub 5a . אחרי שש סיבובים של מיונים הואריאנט YROmpT בודד.  גרסה זו הכילה שבע חילופים חומצות אמינו, וחומצות אמינו ארומטיות החליפו את החומצות אמינו החומציות בתחתית של S1 (Glu27Trp and Asp208His, Table 1).

YR-OmpT נקי חתך את הסובסטרט פפטיד

 WCYkRVGKGRGR (2b) 

עם-

kcat/KM=  8 ± 3 * 104 M–1 s–1,

אך לא חתך 5b.

כדי ליצור גרסה ספציפית עבור ,תראונין ב P1, יצרנו ספריית מוטנטים של שבע החומצות אמינו המהווים את כל כיס הקישור S1 (טבלה משלימה 1 באינטרנט) (6*10^8 טרנספורמרים).ארבעה סיבובים של זרימת ציטומטרית עם SelSub 3a ו CtsSub 5a הביאה לבידוד ואריאנט עם פעילות נמוכה של TR1-OmpT (חומר משלים איור 3 באינטרנט). לאחר מכן בוצע מוטגנזה אקראית על ידי PCR נוטה שגיאה של רצף ואחריו שלושה סיבובים של זרימה ציטומטרית אזר הניב את הואריאנט R2-OmpT הפעיל והסלקטיבי ביותר

kcat/KM=  2 ± 1 *104 M–1 s–1 for 3b

אשר מכיל החלפה של תשע חומצות אמינו ביחס ל- WT OmpT  (Table 1) וחמש חומצות אמינו ביחס ל TR1-OmpT

הספציפיות של ואלין ב P1 ¢

על מנת לבודד גרסה עם העדפה P1 ¢ שונה (Valineהעדפת חיתוך של ואלין), הספרייה עם Glu27, Asp208 ו Ser223 נסרקה עם 2a. CtsSub לא שימש במקרה זה כי 5a גם מכיל ברצף החיתוך Arg-Val . הווריאנט הטוב ביותר שנוצר, מכיל החלפה של חומצת אמינו אחת, S223D. הוא היה נתון למוטאגנאזה אקראית (2*810  טרנספורמנטים).לאחר שלושה סיבובים של מיון, התגלה גרסת קונצנזוס, RV-OmpT.  RV-OmpT מכיל שלוש תחליפי חומצות אמינו (טבלה 1) וחיתוך 2b ביעילות גבוהה מאוד:

kcat/KM = 5 ± 2 * 105 M–1 s–1

הנדסה ספציפית ב P1 ו P1 ¢

כדי לשנות בו-זמנית את ההעדפות הן ב- P1 והן ב- ¢P1, באופן ספציפי ל- Glu-Ala, נעשה שימוש ב- ER-OmpT כתבנית לבניית ספריית PCR בעלת נטייה לשגיאה (8 10  טרנספורמרים), שהיתה כפופה לחמישה סיבובים של מיון עם SelSub 4a ו CtsSub 5a.התוצאה הייתה הגרסה הפעילה ביותר EA-OmpT (טבלה 1), אשר הציגה את היעילות הקטליטית הגבוהה ביותר של כל גרסה מבודדת, המציגה

kcat/Km = 1.0 ± 0.3 * 106 M–1 s–1

עבור חיתוך ברצף Glu-Ala 4 ב- 4b.צריך לשים לב לכך שהרצף Glu-Ala די פפטידי המועדף עבור EA-OmpT הוא חומצי וצפוי להיות בעל מטען הכולל -1, בעוד לרצף Arg-Arg המועדף על WT OmtT יש מטען כולל חיובי +2. לפיכך, היעילות הקטליטית הכוללת הגבוהה ביותר שנצפתה במחקר התבצעה עם הואריאנט הספציפי לשינוי הגדול ביותר במאפיינים הכימיים באתר החיתוך של הסובסטרט.

ניתוח של שונות הספציפיות

כדי לחקור את המידה שבה סלקציה נגדית עם 5a הוביל לאי הכללה של חומצות אמינו אחרות מלבד ארגינין באתר החיתוך, הווריאציות הודגרו עם מספר סובסטרטים (שהינם פפטידים) עם טווח של חומצות אמינו ב-P1 (טבלה 2). יש לציין כי האנזים הספציפי של Ala-Arg OmpT S223R שדיווחנו עליו בעבר 15 לא עושה הידרוליזה על אף אחד מהסובסטרטים שנבדקו. הספציפיות של האנזים הזה נותחה עוד יותר על ידי הסובסטרט  Phage. Phage מציג פפטיד עם שמונה חומצות אמינו אקראי המתמזג בין החלבון pIII, לפפטיד epitope והוא היה נתון לחמש סיבובים של 21 .זוהתה העדפה חזקה לאלנין ב P1, כשתראונין היא החומצה אמינו היחידה במיקום זה (הנתונים לא מוצגים).  רצף הקונצנזוס שנקבע על ידי ריצוף של 42 מושבות היה GLEAkRRVG.

בדומה לאנזים S223R, S223R, ER-OmpT עושה הידרוליזה רק לפפטידים המכילים רצף ER.

הואריאנטים YROmpT ו- TR2-OmpT ביצעו חיתוך Ala-Arg and at Ala-Arg and Glu-Arg, (Table 1)

 אבל לא חתכו סובסטרטים אחרים. בגלל שואריאנטים מהונדסים אלו חותכים את הרצף Arg-Arg ב CtsSub, סביר להניח כי סיבובים נוספים של סלקציה נגדית עם סובסטרטים המתאימים תאפשר להשיג ספציפיות מוחלטת או כמעט מוחלטת לתראונין ו טירוזין עם YR-OmpT ו TR2-OmpT, בהתאמה .

פונקציות ביולוגיות רלוונטיות של ואריאנטים

לבסוף, בחנו פונקציות ביולוגיות רלוונטיות של האנזימים המהונדסים. OmpT חשוב עבור הלטנטיות (ארס/אלימות) מיקרוביאלית מכוח היכולת שלו להפעיל פלסמינוגן (plasminogen) וגם היכולת לחתוך פפטידי קטיון אנטימיקרוביאלים 12 . ההפעלה של plasminogen ל- plasmin נעשית באמצעות חיתוך ב Arg561-Val562 (22). בחנו את יכולת ההפעלה של plasminogen של גרסא של RV-OmpT. כצפוי, הגרסא RV-OmpT מציגה פעילות גבוהה במבחנה בהמרת plasminogen ל- plasmin, בהשוואה לזה המוצג על ידי רקמת האדם plasminogen activator (tPA) human tissue plasminogen activator (tPA) (משלים איור 4 באינטרנט) 23 

.

דפסינים (defensins) הם פפטידים קטיונים אנטימיקרוביאלית המורכבים מקומפלקס של בטא- שייט המוחזקים יחד על ידי מספר קשרים דיספלידים, מה שהופך אותם עמידים בפני פרוטואליזה חיידקית 24 . human b-defensin 3 (HBD-3) דפנסין של אדם מכיל אתרי חיתוך אשר ניתן לזהות על ידי RV-OmpT ו TR2-OmpT (חומר משלים איור 5 באינטרנט).  בניסויי בקרה, תאים המבטאים WT OmpT הראו פי 33 כדאיות גבוהה יחסית ל-BL21(DE3) (ompT –ompP –) cells

זה עולה בקנה אחד עם התפקיד המוצע של OmpT  – הגנה מיקרוביאלית פפטיד קטיוני 25 .ביטוי דומה של RV-OmpT או TR2-OmpT הביא להישרדות גדולה אף יותר, עם גידול של פי 42,000 בכדאיות בהשוואה ל- BL21(DE3) ב- HBD-3 assay (טבלה משלימה 2 באינטרנט).   למרות של- RV-OmpT יש פעילות פלסמינוגן גבוהה יותר ופעילות פפטיד אנטימיקרוביאלית במבחנה, צריך לבדוק אם חיידקים המבטאים את האנזים הזה הם אלימים מאוד.

דיון

למרות שמשפחת האנזימים של Omptin, הכוללת OmpT, התפתחה לטובת חומצות אמינו בסיסיות מאוד הן ב- P1 והן ב-¢ P1, אחד או שני סיבובים של גיוון רצף וסריקה בתפוקה גבוהה הניבו בקלות גרסאות של OmpT (איור 3) המתוכנתות לזהות שרשראות צד שונות של P1 המקיף את כל הטווח של תכונות כימיות (ארומטי, חומצי, קוטבי, הידרופובי קטן). תוצאות אלו מראות כי, לפחות עבור OmpT, קבוצה קטנה יחסית () 3% של הרצף) של החלפות חומצת אמינו יכולים לגרום לשינויים משמעותיים בספציפיות של הסובסטרט, אפילו כלפי רצפים שאינם מזוהים על ידי אנזים WT.יש לציין, זה כלל את הדור של גרסה עם העדפת סובסטרט (Glu-Arg) שלא דווח בפרוטאז טבעי כלשהו.

גרסאות האנזים המבודדות כאן אינן מציגות את הספציפיות הנמוכה או הפעילות הנמוכה של אנזימים “הכלליים” ראשוניים, אשר מתקבלים בדרך כלל על ידי אבולוציה סטנדרטית מכוונת במעבדה 11,26 . לעומת זאת, כל הווריאנטים המבודדים הראו פעילות קטליטית גבוהה, והם מייצגים ” מומחים ” 27-29 המציגים סלקטיביות דומה ל- WT OmpT. בהתבסס על אנליזה שלנו של מוטציות האחראיות על הספציפיות ב- ER-OmpT, קפיצות כאלה בחלבון התאמה המוביל ישירות ממצב מומחה אחד למשנהו, מבלי לעבור דרך ביניים כללית, עשוי להיות תלוי במוטציות אפיסטטיות, שלבידודן נדרש מוטאגנזה ממוקדת של קבוצות ספציפיות של חומצות אמינו יחד עם סריקה של ספריות גדולות יחסית.

למרות שמציאת המוטציות האחראיות על מתן סלקטיביות שונה ל- OmpT נראית פשוטה – לדוגמה, שינוי לחומצות אמינו ארומטיות בכיס ה- S1 כדי לסייע בזיהוי P1 של טירוזין – בחירת החומצות אמינו הנכונות לשינוי סלקטיביות יכול להיות מאתגר. יתר על כן, נוכחות של אינטראקציות אפיסטטיות, כפי שהוכח עם ER-OmpT, עושה את הבעיה הרבה יותר מורכבת. לפיכך, אנו מאמינים כי השינוי הכללי של סלקטיביות הסובסטרט בפרוטאזות אחרות יכול להיות מושגת באופן משולב והוא מוגבל כרגע על ידי היכולת לתכנן וליישם מבחני סלקציה בתפוקה גבוהה.

להנדסה של משפחה של פרוטאזות פעילות וסלקטיביות ביותר עם תכונות ספציפיות מתוכנbות שמדווחות כאן , יש השלכות חשובות על יישומים אנליטיים, ביוטכנולוגיים וטיפוליים. לדוגמא, בניגוד לנוגדנים שנקשרים לאפיטופים טרפיוטים באופן סטויכומטרי, פרוטאז מהונדס בצורה מתאימה יכול להציע את היתרונות הניכרים להיות מסוגל להפעיל את האפיטופ באופן קטליטי. התוצאה תהיה יעילה יותר באופן משמעותי ויאפשר העלאה הדרגתית של מינונים נמוכים. לכן יקטין את עלות הטיפול ויקטין שינויים של תופעות לוואי. כדי להשיג את הסלקטיביות הגבוהה הדרושה לחיתוך ספציפי של חלבון טרפויוטי, סביר שיהיה צורך לזהות חומצות אמינו מעבר לעמדות P1 and P1¢, וכמו שנאמר לעיל, יש צורך בהרבה CtsSubs כדי להשיג סלקטיביות אופטימלית. עם זאת, התוצאות שלנו מראות שניתן להנדס מאפיינים של ספצייות וקטליטיות של פרוטאזות.

שיטות

זרימת cytometric מבחני פעילות OmpT

מושבות בודדות שימשו לחיסון

2 מ”ל 2 תרבויות YT בתוספת 200 מ”ג מ”ל -1 של אמפיצילין.התאים נקצרו resuspended ב סוכרוז 1% כפי שתואר לעיל 15 .עבור תיוג, 50 מ”ל של התאים היו מדולל לתוך 949 מ”ל של סוכרוז ו 1 מ”ל של

 בדיקת פעילות  OmpT ע”י זרימה ציטומטרית.

 מושבות בודדות שימשו לחיסון 2 מ”ל XYT 2 תרבויות בתוספת 200 מ”ג מ”ל – 1 של ampicillin. התאים

הועברו לתמיסת סוכרוז 1% כפי שתואר לעיל 15.

לסימון, 50 מיקרוליטר של התאים דוללו לתוך 949 מיקרוליטר של סוכרוז ו 1 מיקרוליטר של

סובסטרט (ריכוז סופי 20 ננומטר מולר עבור 1a–4a ו- 100 ננומולר עבור 5a). 20 מיקרוליטר של תמיסת התגובה המסומנת  דוללה לתוך 0.5 מ”ל של סוכרוז 1% ועברה אנליזה בפקס (Becton Dickinson FACS).

קביעת של הספציפיות היחסית של הסובסטרט.

30 מיקרומולר של הסובסטרט המתאים הודגר עם 1-20 ננומולר של אנזים למשך 45 דקות כך שהאנזים חותך את הסובסטרט המועדף 40-50%. תנאי התגובה היו אופטימיליים עבור כל זוג אנזים וסובסטרט, ואחוז החיתוך נאמד על ידי HPLC. העדפות הסובסטרט היחסיות מדווחות כאחוז או יחס של חיתוך המצע המועדף.

מבחני הפעלה Plasminogen

פתרונות מלאי של Spectroymym PL (5.0 מיקרומולר) (American Diagnostica)

ו-

human glu-type plasminogen

(0.5 מ”ג מ”ל -1) נעשו ב. 50 mM Tris, 0.01% Tween 20, pH 7.4

כדי להשלים את העבודה, 5 מ”ל של Spectrozyme PL (ריכוז סופי 0.5 מיקרומולר) ו 1 מ”ל של

plasminogen נוספו ל- 44 מ”ל של

0 mM Tris, 0.01% Tween 20, pH 7.4. 0.2–5

5.0  מיקרומולר של האנזים הנקי (tPA (American Diagnostica) / RV-OmpT / OmpT)

נוספו ל- 200 מיקרוליטר של התמיסה, וקינטיקה התגובה היתה בפיקוח ב 405 ננומטר מכשיר BioTek Synergy HT ב-37 מעלות צלזיוס.

כדי להעריך האם לאנזימים היו פעילויות מעבר להידרוליזה, בוצעו בדיקות דומות עם  סובסטרט כרומוגני בהעדר פלסמינוגן.

שיטות אחרות

פרוטוקולים לזריעת הסובסטרט המצע, בניית ספריה וסריקה 30,31, ניקוי אנזימים וקינטיקה, מבחני b-defensin 32 מתוארים בשיטות המשלימות באינטרנט.

תמונות וטבלאות

תמונה 1. שיטת הסריקה והסובסטרטים אשר נעשו בהם שימוש בסריקה. (a) זרימה ציטומטרת בשני צבעים שימשה לבידוד של וראינטים של OmpT עם ספציפויות שונות. (b) רצף חומצות אמינו של הסובסטרטים (שהם פפטידים) של הסלקציה (selection) והסלקציה נגד (counterselection) אשר נעשה בהם שימוש בסריקת ספריה בעזרת זרימה ציטומטרית (1a–5a) ולמאפיינים קינטיים ע”י  (כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה)HPLC  (1b–5b). BD, BODIPY; Q, QSY7.

תמונה 2. מידע של זרימה ציטומטרית. היסטוגרמות של פלאורוסנציה של E. coli BL21(DE3), בלי ביטוי של פלסמיד, תאים המבטאים ER-OmpT, ותאים עם שינוי בחומצה אמינו יחידה – E27L, D208R ו-  S223G.

טבלה 1. מאפיינים קינטיים של ואריאנטים של OmpT

החלפות חומצות אמינו וקינטיקה אנזימטית עם סובסטרט מועדף לכל ואריאנט של OmpT. aL183F הוא מוטציה שהופך את האתר הפעיל ללא פעיל ונמצא מחוץ ל- b-barrel (מבנה השניוני באתר הקישור ).

טבלה 2. אנליזה לספציפיות של ואריאנטים של OmpT

זוגות של אנזים-סובסטרט עברו אופטימיזציה בעזרת 0.5–20 nM של אנזים באינקובציה עם 30 mM

סובסטרט ב- 25 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. העדפות הסובסטרט היחסיות מדווחות כחלק של החיתוך של הסובסטרט המועדף aOmpT חותך את הפפטיד בין RkV. bOmpT חותך את הפפטיד בין KkG.

תמונה 3. סיכום של אסטרטגיית ריצוף רנדומלי וסריקת ספרייה אשר מוביל לבידוד של הואריאנטים של OmpT עם הפעילות ועם הסלקטיביות הטובות ביותר. רפרנס 15.