Immune recognition of somatic mutations leading to complete durable regression in metastatic breast cancer

זיהוי חיסוני של מוטציות סומטיות מוביל לנסיגה קבועה של סרטן שד גרורתי

אימונותרפיה באמצעות חסימת נקודות בקרה או שינוי מותאם של לימפוציטים אנטי-גידוליים נצפה כיעיל בטיפול בסוגי סרטן המאופיינים בתדירות גבוהה של מוטציות סומטיות – כמו מלנומה, סרטן ריאות כתוצאה מעישון וסרטן שלפוחית השתן – אך עם השפעה מועטה על סוגי סרטן אחרים בעלי תדירות נמוכה יותר של מוטציות סומטיות, כדוגמת סוגי הסרטן של מערכת העיכול, השדיים והשחלות 1-7. שינוי מותאם של לימפוציטים אוטולוגיים המתמחים באיתור של חלבונים המקודדים על ידי גנים שעברו מוטציה סומטית הוביל לנסיגות קליניות משמעותיות אצל חולים עם סרטן גרורתי של תעלות המרה, מעי הגס וצוואר הרחם 8-11. אנו מציגים מטופלת שהציגה תוצאה חיובית של סרטן שד גרורתי בקולטן הורמון (HR) כמורצפטורי, שטופלה בלימפוציטים חודרי גידול (Tumor Infiltrating Lymphocytes – TILs) שהופעלו כנגד ארבעה חלבונים – SLC3A2, KIAA0368, CADPS2 ו- CTSB. שינוי מותאם של ה-TILs הספציפיים לחלבונים המוטנטיים יחד עם אינטרלויקינים (IL)-2 וחסימה של נקודות בקרה, הובילו לרגרסיה מלאה וקבועה של סרטן השד הגרורתי, שנכון לאותה נקודת זמן נמשך מעל ל-22 חודשים, מה שמייצג גישה אימונותרפית חדשה לטיפול במטופלים כאלו.

אישה בגיל 49 הסובלת מסרטן שד גרורתי, כולל קולטן אסטרוגן (ER)-חיובי וקולטן טירוזין קינאז 2 מסוג ERB-B2 (ERBB2, ידוע גם כ-HER2)-שלילי שהתגלה כעמיד לטיפולי כימותרפיה רבים נרשמה לניסוי קליני, NCT01174121, שעוצב על מנת לקבוע את היכולת של לימפוציטים אוטולוגיים חודרי-גידול (TILs) להוביל לנסיגה של הגידול אצל מטופלים עם סוגי סרטן אפיתל גרורתיים. ריצוף של כלל האקסום (WES) וריצוף רנ”א (RNA-Seq) של גידול סאבקוטאני מהשד הימני הראו נוכחות של 62 מוטציות סומטיות לא מזוהות (נספח טבלה 1). כמות המוטציות הזו נמצאת בטווח הבין-רבעוני (IQR 30-95.5, חציוני 47) של קבוצה סטטיסטית של 140 מטופלים עם סרטן שד גרורתי HR+HER2-, בעוד שסרטן שד A לומינלי ראשוני, המאופיין בדרך כלל ב- HR+HER2-, מציגים בדרך כלל פחות מוטציות (IQR 26-39.5, חציוני 32)12-14. דגימות אוכלוסיות לימפוציטים TIL שהופקו מתרביות של חתיכות קטנות של הגידול של המטופלת שהושרו בריכוז גבוה של IL-2 (נספח טבלה 2) נסרקו בתחילה כנגד כל המוטציות באמצעות שימוש ב- PPs 1-6 (Pulsed peptide pools) או טרנספקציה של mRNAs (צמדי מיני-גנים (TMGs) 1-6) שבוטאו בתאים מציגי אנטיגן אוטולוגיים (ACPs). דגימות F8 ו-F12 של TIL הראו פעילות כנגד PP1 אבל לא ל-TMG1 התואם להם. TIL F13 הראה פעילות גם כנגד PP6 וגם כנגד TMG6 (תרשים 1a,b). סריקות פפטיד אינדיבידואליות של דגימות ה-TIL הראו כי F8 ו-F12 זיהו את החלבון Solute Carrier family 3 member 2 (SLC3A2) (תרשים 1c). בשל שחבור חלופי, וריאנט בגן SLC3A2 ייצר 3 פפטידים נפרדים, כאשר כל אחד מכיל את אותה המוטציה (p.lysine>threonine) אך אזור C-טרמינלי שונה (נספח טבלה 1). כל שלושת הפפטידים SLC3A2 זוהו על ידי TILs F8 ו-F12 (תרשים 1c). TIL F13 הפעיל זיהה מתאם ו-Scaffold של פרוטאוזום EMC29 מוטנטי (ECPAS, ידוע גם כ-KIAA0368) (תרשים 1d). הפעילות של SLC3A2 ו-KIAA0368 תווכה על ידי תאי T CD4+ ו-CD8+, בהתאמה (תרשים 1e,f ונתונים שאינם מוצגים).

על מנת לזהות סוגי תאי T משובטים המגיבים לאנטיגנים חדשים, תאים המגיבים לפפטידים מוטנטיים מוינו על בסיס האזור המשתנה של קולטן תא T (TRBV) של הקולטן (TCR)-β או על בסיס ביטוי ברמות גבוהות של 4-1 BB (CD137, סמן של הפעלה של תאי T) ולאחר מכן בכפוף לריצוף תא-בודד (Single Cell Sequencing – SSS). TILs מדגימות פעילות (F12 ו-F13) מוינו לפי FACS על ידי נוגדנים הספציפיים לחבר-משפחה (Family member specific antibodies) TRBV ועברו עירור עם APCs בעלי המוטנט (mut)-SLC3A2 או mutKIAA0368. ריצוף עמוק שהתמקד ב- של התאים TCR שהתמיינו זיהה אוכלוסייה רב שבטית של מקטעים המקודדים ל-TCR עם שני אזורי TRBV דומיננטיים (TRBV10-01 ו- TRBV05-01) ושלושה מקטעים דומיננטיים בעלי גיוון ב-TCR-α (TRAV) (TRAV08-06, TRAV38-01, TRAV02-01) (נספח תרשים 1a). מתוך ששת הזוגות TCR שנבדקו, שני TCRs (TRBV19-01-TRBV02-01 (TCR K) ו-TRBV05-01 – TRBV38-01 (TRC L)) זיהו את המוטציה mutSLC3A2 כמו שהיא מוצגת באמצעות הרצת ELISPOT לאיתור של תאים המייצרים IFN-γ (נספח תרשים 1b) ול-Upregulation של 4-1 BB (תרשים 1g ונתונים שאינם מוצגים). בנוסף, זוהה שיבוט יחיד של TCR הפעיל בתגובה ל-KIAA0368 (TRAV21-01 – TRBV06-05) (תרשים 1h, נספחים תרשים 1b,c). לחילופין, תאי 4-1 BBhi מוינו עבור ריצוף-תא אחד (SSS). 5 זוגות TCR הרגישים ל-utSLC3A2 זוהו (נספחים טבלה 3). לא זוהו כל TCRs חדשים הרגישים ל-mutKIAA0368. בסך הכל, שבעה TCRs הרגישים ל-mutSLC3A2 הציגו זיהוי ספציפי ונמרץ של mutSLC3A2 בריכוזים נמוכים עד כדי 10 ng/ml (נספחים תרשים 2a). התגובה הייתה מוגבלת לאנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA)-DRB1*07:01, והאפיטופ המינימלי אותר בתוך מקטע חומצות האמינו, DPPALASTNAEVT (נספחים תרשימים 2b-f). ה-TCR הרגיש ל-mutKIAA0368, TRBV05-05 – TRAV21-01 (TCR R), זיהה את פפטיד ה- mutKIAA0368 בריכוזים נמוכים עד כדי 100 ng/ml (תרשים 1h, ובנספחים תרשים 3a). בנוסף, TILs מסוג F13 שמוינו לפי Vβ13.1+ (TRBV06-05, TRBV06-06 ו- TRBV06-09) זיהו באופן ספציפי APCs שהורצו ב-TMG6-Electrophoresis, מדגימים בכך כי החלבון mutKIAA0368 עובד בצורה מספקת והוצג (נספחים תרשים 3b). ה- CD8+ TCRs הספציפיים ל-mutKIAA0368 זיהו את האפיטופ הצפוי (10-mer, MPYGYVLNEF, rank 0.06, 9.5 nM), שהיה מוגבל על ידי HLA-B*35:01 (נספחים תרשימים 3c,d).

המטופלת טופלה באמצעות 8.2×1010 TILs כמתואר בתרשים 2a. התאים שהוחדרו היו בעיקר CD4+ (62.5%), עם פנוטיפ זיכרון אפקטורי (CD62L-CD45RO+). המוצר שהוחדר שימר את הרגישות שלו ל-mutSLC3A2 ו-KIAA0368 אחרי התפשטות מואצת של תאי T מהדוגמיות (תרשים 2b), ובערך 21% מתאי ה-CD3+ שהוחדרו הציגו מוות תאי מתוכנן 1 (PD-1). בנקודת הזמן הראשונה שבה ניתן היה לבדוק, 6 שבועות לאחר החדרת התאים, מצאנו כי גידול המטרה התכווץ ב-51%. בבדיקה האחרונה שנעשתה (22 חודשים לאחר החדרת התאים), כל תאי גידולי המטרה ואלו שאינם נעלמו רדיוגרפית (תרשים 2c).

על מנת להעריך את פוטנציאל ההשפעה של pembrolizumab, נוגדן אנטי-PD1 חד שבטי, על הגידול של המטופלת, בוצעה אנליזה רטרוספקטיבית לביטוי של PD-1 ואחד מהליגנדים שלו, PD-L1, על שני דוגמיות גידול שנלקחו לפני הטיפול בהחדרת התאים. ביופסיה של גידול מדופן החזה שהייתה עמידה לטיפולים רבים הציגה אזור מוקדי קטן של תאי CD3+PD-1+ שלא הציגו כלל PD-L1 על הגידול או על הסטרומה (תרשים 2d, למעלה). הגידול הזה נסוג לאחר החדרת תאים מותאמים (Adoptive Cell Transfer – ACT). הגידול הוסר כאשר המקור של TILs היה גידול בשד הימני שהיה בגדילה מואצת ונמצא כמכיל כמות גדולה של תאי T CD3+PD-1+ תוך גידוליים עם סטרומה PD-L1+. בכל זאת, לא הייתה שום עדות לביטוי של PD-L1 בתאי הגידול (תרשים 2d, למטה). ביטוי של PD-1 בדם פריפריאלי היה 11.4% של תאי CD3+ 6 שבועות לאחר הטיפול, ונשאר קבוע יחסית בנקודות זמן מאוחרות יותר – 9% של תאי CD3+ (9 חודשים לאחר הטיפול) ו-7.9% של תאי CD3+ (שנתיים לאחר הטיפול).

ריצוף עמוק הממוקד ב-TCR של אוכלוסיית התאים שהוחדרה הראתה את האזור המשלים הקובע TRBV הייחודי 3 (Unique TRBV complementarity determining region 3 – CDR3) – רצפים המקודדים לשמונה השבטים הרגישים למוטציות (שבע רגישים ל- TCRs של SLC3A2 ואחד רגיש ל- TCRs של KIAA0368), העולים לסך של 23.1% מהרצפים היצרניים בזמן של החדרת התאים (תרשים 3a). בחינה של הדם הפריפריאלי שישה שבועות לאחר החדרת התאים הראתה כי ה-TCRs הידועים כרגישים לחלבונים מוטנטיים התמידו להישאר ברמה של 1.73% מתוך כלל רצפי ה-TRBV היצרניים.

אנליזה נוספת הראתה ששלוש משפחות TRBV –TRBV07, 12.41%, TRBV20, 13.56%, TRBV28, 16.54%, התפשטו באופן משמעותי במהלך ששת השבועות שלאחר הטיפול, כאשר TRBV20 ו- TRBV28 מכילים לפחות סוג שבט TCR אחד (שרשרת-β של CDR3: CSASDGSTTGSTYEQYF, 11.4%; ו- CDR3:CASRPPGYEQYF, 5.4% בהתאמה) עם רגישות לא ידועה (תרשים 3b). תאים שמוינו לפי TRBV20+ היו לא פעילים כלל כנגד מאגרי פפטידים (Peptide pools), TMGs ופפטידים מציטומגלווירוס (Cytomegalovirus – CMV), וירוס אפשטיין בר (EBV) ווירוס אינפואנזה (פפטידי CEF, נתונים לא מוצגים). תאי TRBV28+ שמוינו לפי FACS הראו זיהוי ספציפי של PP6 ו- TMG6 (תרשים 3c). תאי ה- TRBV28+זיהו באופן ספציפי שני חלבונים מוטנטיים: אקטיבטור הפרשה תלוי סידן 2 (CADPS2; p.Arg1266His) ו- Cathepsin B (CTSB; p.Asp159His) (תרשים 3d). ריצוף תא בודד (SSS) הראה צמד TCR דומיננטי, TRBV28-01 – TRAV26-01 (TCR J, 82% מסך כלל רצפי ה-TCR), שזיהה באופן ספציפי mutCADPS2 והיה מוגבל ל-HLA-C*04-01, והאפיטופ המינימלי שזוהה היה ה- 9-mer, TYDTVHRHL הצפוי (תרשים 3e, נספחים תרשימים 4a-c וטבלה 4). שני רצפי TCR זוהו כרגישים ספציפית את mutCTSB (TCR M ו- TCR O, שניהם TRBV28-01 – TRAV12-01) עם אזורי CDR3 ייחודיים (תרשים 3f, נספחים תרשים 4d וטבלה 4(. שני ה-TCRs הספציפיים ל-CTSB היו HLA Class II, מוגבלים ל-DRB1*07:01, והאפיטופ המינימלי אותר ברצף חומצות האמינו GYNSYSVSNSEKHIM (נספחים תרשימים 4e,f). אנליזה חוזרת של רפרטואר תאי ה-T בשקית האינפוזיה, באמצעות ריצוף אולטרה-עמוק, חשפה את הנוכחות של TRCs ספציפיים ל- CADPS2 ול- CTSB (TCR J ו- TCR M, בהתאמה), בתדירות של פחות מ-0.001%, בעוד שה-TCR השני הספציפי ל-CTSB לא אותר.

בסך הכל, 11 סוגי שבט TCR (Clonotypes) זיהו את ארבעת הנאואנטיגנים (SLC3A2, KIAA0368, CADPS2, CTSB) עבור מטופלת 4136. רק שני TCRs, ששניהם זיהו mutSLC3A2 (TRBV7-9 – TRAV26-2 (TRC D) ו- TRBV19-TRAV9-2 (TRC H)), זוהו בדם פריפריאלי לפני הטיפול (0.003% ו-0.002% מתוך כלל רצפי TRBV, בהתאמה). לאחר החדרת התאים, בחנו את העמידות של TCRs הידועים כרגישים לנאואנטיגנים בדם הפריפריאלי. התדירות המצטברת החציונית במהלך שבועות 3-12 הייתה 2.83% מרפרטואר הדם הפריריפריאלי, וסוגי-השבט הידועים כרגישים היוו 0.81% מהרפרטואר לאחר ההחדרה של התאים (תרשים 4a). שמונה מתוך 11 סוגי ה-TCRs הרגישים לנאואנטיגנים נשארו בדם הפריפריאלי של המטופלת לפחות 17 חודשים אחרי ההחדרה (תרשים 4b). בנוסף, סוג השבט הדומיננטי שזוהה שישה שבועות לאחר ההחדרה נשאר.

על מנת להבין טוב יותר את ההטרוגניות של המוטציות הלא מזוהות בגידול של המטופלת, בוצעה אנליזה שבטית על הדנ”א של הגידול שהוסר. האנליזה חשפה כי 20/62 (32%) מוטציות היו שיבוטיות, 37/62 (60%) היו תת-שיבוטיות, ואת אופיין של 5 (8%) מוטציות לא ניתן היה לקבוע. mutSLC3A2 ו-mutCADPS2 היו שבטיות (Cancer cell Fraction (CCF): 0.999, לכל אחד), בעוד ש- mutCTSB ו-mutKIAA0368 נראו כתת-שבוטיות (CCF:0.669 ו-0.489, בהתאמה) (תרשים 4c).

הטיפול המותאם מאוד אישית זיהה תאי T הפעילים כנגד סוגים רבים של נאואנטיגנים המוגבלים ל-HLA-Class-I ו- .HLA-Class-II שהוצגו על ידי הגידול האוטולוגי, מעשירים בכך את הרפטואר של תאי T רגישים למוטנטים על פני מאגר של TILs בלבד. איתור של אנטיגנים סרטניים רבים הינו בעל פוטנציאל למנוע טכניקות בריחה של הגידול, כמו דאון-רגולציה של מולקולות Class I או הטרוגניות של הגידול. באמצעות סריקה של פעילות על בסיס מוטציות לא מזוהות, תאי T שזיהו סוגים אחרים של נאואנטיגנים פוטנציאליים לא נבחרו בכוונה, ובכך התאפשר להם להיות מוחדרים יחד עם שאר התאים במהלך הטיפול.

לאחר הטיפול, הדם הכיל אוכלוסיית תאי T רב שבטית עם ספציפיות לא ידועה, שיכול להיות שהייתה פעילה כנגד הגידול ויכול להיות שלא. סביר להניח שההתפשטות של תאי T חסרי ספציפיות הייתה תוצאה של שיקום הומאוסטטי לא ספציפי אחרי דילול בכמות הליפוציטים, או שלחילופין היא מייצגת פיזור של אפיטופ שהתפשט כתוצאה מגירוי על ידי נאואנטיגן של הגידול שעדיין לא זוהה, שהיה בעל פוטנציאל עירור או העצמה של התפשטות האפיטופ על יד חסימה של מעכב נקודת בקרה. הודגם קודם כי דילול לימפוציטים כהכנה לטיפול יכול ליצור סביבה חיסונית המועדת להתפשטות לימפוציטים, עם רמות סירקולציה של IL-7 ו- IL-15 [15]. בעוד שכמות הציטוקינים המוגדלת בהומאוסטזיס יכולה לסייע בשגשוג של TILs אוטולוגי, סביר להניח שכלל אוכלוסיית הלימפוציטים המשתקמת תתחרה על גורמי הגדילה הללו.

על אף שדווח על תגובה מוגבלת לטיפול באמצעות  pembrolizumab, בקרב חולים עם סרטן שד שלילי-משולש (TNBC), לא התפרסמו נתונים התומכים בפעילות של pembrolizumab בסרטן שד HR+. הביופסיות של דופן החזה ושל המסות הסאב-קוטניות המוצגות בתרשים 2 לא חשפו כל ביטוי של PD-L1, מה שמעלה את ההשערה כי הטיפול באמצעות pembrolizumab היה כנראה בעל השפעה מינימלית, אם בכלל, על המטופל. בניסוי קליני קשור, 2 מתוך 12 המטופלים, אחד עם סרטן צינור המרה[10] והאחר עם סרטן המעי הגס[9], קיבלו TILs הרגיש לחלבון מוטנטי בלי לקבל pembrolizumab, ואצל שניהם התרחשה נסיגה של הסרטן. על בסיס מחקרים קודמים, לימפוציטים שהוחדרו הציגו מעט, אם בכלל, PD-1 בזמן ההחדרה, אך הציגו מחדש PD-1 חודש לאחר ההחדרה[16]. למרות שחלק מהתוצר שהוחדר למטופלים הללו הכיל כבר PD-1, רמת הביטוי של PD-1 בדם הפריפריאלי נשארה יחסית קבועה במהלך ולאחר מתן pembrolizumab. אסטרטגיית השילוב של טיפול עם pembrolizumab יחד עם החדרת תאים היה ניסיון למנוע חסימה של תאי T בתיווך של PD-1/PD-L1, במיקרו-סביבה של הגידול בזמן של החדרת התאים. הנסיגה המוחלטת של הגידול אצל המטופל לא נראית מתאימה לתגובה למתן קצר-מועד שלsingle-agent pembrolizumab.

הזיהוי המהיר של רצפי TCR הספציפיים לחלבונים מוטנטיים על ידי ריצוף תא-בודד יכול לספק אפשרויות להנדסה של פעילות נאואנטיגנית בתוך PBLs אוטולוגיים עם פוטנציאל שגשוג גבוה, מה שיכול להיות בעל יותר השפעה מאשר שימוש ישיר ב-TILs. סרטן שד גרורתי יכול היות מחלה הטרוגנית, והמטופלת הזו המחישה כי תרפיה מותאמת אישית המעוצבת לאתר את המוטציות הסומטיות הייחודיות המוצגות על ידי גידול אוטולוגי של אדם הסובל מהמחלה יכול להוביל לנסיגה מוחלטת וקבועה של הסרטן.

שיטות:

שיטות, כולל הצהרות בדבר זמינות נתונים וכל שותפות קוד קשורה והפניות, זמינות בכתובת:

https://doi.org/10.1038/s41591-018-0040-8

רשימת התרשימים והגרפים עד עמ’ 730:

תרשים 1 : אוכלוסיות TIL ממטופלת 4136 מזהות את האטיגנים של המוטנטים האוטולוגיים SLC3A2 ו-KIAA0368

תרשים 2: נסיגה של גידול כתוצאה מהחדרה של TILs אוטולוגיים המוכוונים לאתר מוטציות אימונוגנים ממקור סרטני

תרשים 3: עמידות של סוגי-שבט TCR הידועים כרגישים למוטנטים בזמן ההחדרה, וזיהוי של סוגי-שבט דומיננטיים חדשים בעלי פעילות לא ידועה הנוכחים ב- apheresis שהופקה שישה שבועות לאחר הטיפול

תרשים 4: עמידות של 11 סוגי-שבט TCRs הרגישים למוטנט משלב ההחדרה של התאים ועד 17 חודשים לאחר מכן