Gut microbiome modulates response to anti-pd-1 immunotherapy in melanoma patients

מיקרוביום מעי מגביל את התגובה לטיפול אנטי PD-1 בחולי מלנומה

מודלי עכברים טרום קליניים מראים כי המיקרוביום במעיים מוסת את תגובת הגידול עבור מעכבי מחסום חיסוניים; עם זאת, זה לא התאפיין היטב בבני אדם חולי סרטן. במאמר זה בחנו את המיקרוביום בפה ובמעיים של חולי מלנומה העוברים טיפול אנטי PD-1 (n = 112). הבדלים משמעותיים נצפו במגוון ובהרכבים של המיקרוביום של המעיים בחולים אשר הגיבו (R) לעומת אלו שאינם הגיבו (NR). אנליזה של דגימות מיקרוביום של צואה (n = 43, 30R, 13NR) הראתה מגוון אלפא גבוה משמעותית (p <0.01) ושפע יחסי של חיידקי ‘Ruminococcaceae’ (p <0.01) בחולים המטופלים. מחקרים מטא-גונמיים גילו הבדלים תפקודיים בחיידקי המעיים בחולים מסוג R, כולל העשרה של מסלולים אנבוליים. פרופיל החיסון הציג חסינות מערכתית ואנטי-גידולית משופרת בחולים בעלי מיקרוביום מעיים חיובי, כמו כן, גם בעכברים נטולי חיידק, המקבלים השתלות צואה מהמטופלים המגיבים לטיפול. יחד, לנתונים אלה ישנן השלכות חשובות על הטיפול בחולי מלנומה בעלי מעכבי חיסון.

התקדמויות עצומות נעשו בטיפול במלנומה ובסרטנים אחרים באמצעות מעכבי מחסום חיסוניים המכוונים את האנטיגן הקשור לימפוציטים מסוג T- לימפוציטים ציטוטוקסיים (CTLA-4) ועבור תאי PD-1, אולם התגובות לטיפולים אלו לעיתים קרובות הטרוגניות ולא עקביות (1-3). לאחרונה התברר כי ישנם גורמים מעבר לגנום של הגידול המשפיעים על התפתחות הסרטן ועל התגובות הטיפוליות (4-7), כולל גורמים מארחים כגון המיקרוביום של מערכת העיכול (8-10). מספר מחקרים הראו כי המיקרוביום במעיים עשוי להשפיע על התגובה החיסונית נגד הגידול באמצעות חסינות מולדת ובצורה מסתגלת (11, 12), וכי ניתן לשפר את התגובות הטיפוליות באמצעות האפנון שלהן (13, 14), אולם עניין זה לא נבחן בהרחבה בקרב חולי סרטן.

בכדי להבין טוב יותר את תפקיד המיקרוביום בתגובה למחסום החיסון, אספנו באופן פרוספקטיבי את דגימות המיקרוביום מחולים בעלי מלנומה גרורתית אשר החלו בטיפול באמצעות אנטי-PD-1 (n = 112 מטופלים) (איור S1 וטבלה S1). דגימות מיקרואלומות אוראליות בפה (buccal) ובמעי (fecal) נאספו בתחילת הטיפול, ובביופסיות הגידול ובדגימות דם נאספו בנקודות זמן מקדימות לטיפול, כאשר ניתן היה להעריך את השינויים הגנומיים, וכן את הצפיפות ופנוטיפ של חדירת הגידול ומחזור תת תאי החיסון (איור 1A ואיור S2). בוצע פרופיל טקסונומי באמצעות רצף הגן 16S rRNA על כל הדגימות הזמינות של הפה והמעיים, עם רצף מטאגנומי שלם (WGS) על רצף (n = 25).

מטופלים ראויים (n = 89) סווגו כמגיבים (R = n = 54) לעומת אלו שאינם מגיבים (NR, n = 35) בהתבסס על הערכה רדיוגראפית באמצעות קריטריוני ה-RECIST 1.1  (קריטריונים לבחינת תגובה בגידולים) לאחר 6 חודשים מתחילת הטיפול. המטופלים סווגו כ R (מגיבים) אם הם השיגו תגובה אובייקטיבית- תגובה מלאה או חלקית או מחלה יציבה שנמשכה לפחות 6 חודשים, לעומת NR (לא מגיבים)- במידה והם התקדמו בטיפול או היו חולים יציבים שנמשכו פחות מ -6 חודשים. סיווג זה מסביר את תת הקבוצה של חולים אשר עשוי להפיק תועלת מהמחלה לטווח ארוך, למרות שלא השיג תוצאה מהקריטריון RECIST, ומאז הוכרו במחקרים רבים שפורסמו על חולים בעלי בעיית מחסום החיסון (16-19).

החוקרים מציינים כי חולים בקבוצת R לעומת קבוצות NR היו דומים בקריטריונים- גיל, מין, סיווג ראשוני, טיפול קודם, טיפול סיסטמי בו-זמני, וכן סידן דהידרוגנז (L2H) (טבלה S2). בדיקות גנומיות קודמות הראו כי מטופלים עם גידולים בעלי עומס מוטציונאלי גבוה יותר, נוטים יותר להגיב לטיפול ב- CTLA-4 (16, 20, 21) או בטיפול אנטי PD-1 (21-24), אולם עומס מוטציה גבוה לבדו אינו מספק ולא חיוני לתגובה. במחקר זה, המספר הכולל והמוטיבים הספציפיים למלנומה, היו בין פרמטרים דומים בין R ו- NR בעקבות טיפול אנטי-PD-1 (איור S3), אם כי מספר הגידולים הזמינים עבור רצף (n = 10, R = 7, NR = 3) היה מוגבל, וייתכן שהפחית ביכולתנו לזהות קשר משמעותי בין נטל מוטציה לתגובה אמיתית.

איור 1

מגוון משופר של מעי גס המקושר לתגובה משופרת לטיפול אנטי-PD-1 בחולים עם מלנומה גרורותית

(A) איור של אוסף המדגם וניתוחו.

(B) קומפוזיציה של פילוגנטית של מיני חיידקים נפוצים abundance < 0.1%)) ברמת הסדר בדגימות בפה (n = 109, top) ובצואה (n = 53, למטה) הדגימות נעשה בעזרת 16S rRNA.

(C) מגוון של מיקרוביום המעיים בסיווג R (n = 30) ובסיווג NR  (n = 13)עבור אנטי PD-1 על ידי מבחן Mann-Whitney (MW). עמודות השגיאה מייצגות את התפלגות ציוני המגוון.

(D) הרכב פילוגנטי של דגימות צואה (n = 39) ברמת המשפחה abundance < 0.1%)) בתחילת המחקר. גבוה (בצבע כחול) (11.63<, n = 13), ביניים (בצבע זהב) (7.46-11.63, n = 13) ונמוך (בצבע אדום) (7.46>, n = 13) קבוצות הגיוון נקבעו באמצעות סף של ציונים הפוך.

(E) PFS על ידי מגוון צואה על ידי Kaplan-Meier (KM); גבוה (חציון PFS לא מוגדר), בינוני (חציון PFS = 232 ימים), נמוך (חציון PFS = 188 ימים). גידולים בינוניים וגבוהים (HR 3.60, 95% C.I. 1.02-12.74) וגבוהים לעומת נמוך (HR 3.57, 95% CI. 1.02-12.52) על ידי מודל Cox חד-משתני. * p <0.05, ** p <0.01.

(F) ניתוח קואורדינטות עיקריות של דגימות צואה (n = 43) על ידי תגובה באמצעות מרחקים משוקללים UniFrac.

החוקרים העריכו לראשונה את המיקרוביום הפה והמעיים בכל הדגימות הזמינות במטופלים (n = 112) עם מלנומה גרורתית באמצעות רצף 16S, וציינו ששתי הקהילות היו מגוונות יחסית, עם שפע גבוה של לקטובצילס במיקרוביום האוראלי (בפה) ובבקטרודיאלים מיקרוביום צואה (במעי) (איור 1B). ניתוח רשת דו-כיוונית הוכיח הפרדה ברורה בין המבנה הקהילתי בין המיקרוביום האוראלי לבין הצואה במונחים של דגימות תואמות וצבירות (איור S4), דבר המצביע על כך שקבוצות אלו נבדלות. אובדן של מגוון של חיידקים (dysbiosis) קשור לתנאים בריאותיים כרוניים ולסרטן, והוא קשור גם לתוצאות דלות לסוגים מסוימים של טיפול בסרטן, כולל השתלת תאי גזע אלוגניים.

בהתבסס על נתונים אלה, נבדק המגוון של המיקרוביום של הפה והמעיים בחולים מתאימים בטיפול אנטי PD-1 ונמצא כי מגוון אלפא של המיקרוביום במעיים היה גבוה משמעותית בקבוצה מסוג R (n=30) בהשוואה לקבוצה מסוג NR (n = 13 ) באמצעות מספר מדדים (p <0.01, איור 1C ותרשים S5). לא נמצאו הבדלים משמעותיים במיקרוביום האוראלי (R = 54, NR = 32, p = 0.11, איור S6). לאחר מכן נבדק הקשר בין גיוון לבין הישרדות ללא התקדמות המחלה (PFS) בקבוצה על ידי ריבוד המטופלים על בסיס שלישונים של ציוני הסף של Invers Simpson, והדגישו כי מטופלים עם מגוון גבוה של מיקרוביום צואה היו ממושכים משמעותית ל- PFS בהשוואה לאלו עם רמות בינוניות (p = 0.02 ו -0.04, בהתאמה, איור 1, D ו- E, איור S7). לא נצפו הבדלים ב- PFS בעת השוואת השונות של המיקרוביום דרך הפה (איור S8). חשוב לציין, כאשר שוערו טווחי הבטא המשוקללים במרחבי UniFrac (30) על ידי ניתוח קואורדינטות עיקרי, נמצא אפקט אשכולות בולט על ידי מצב התגובה במיקרוביום המעיים של חולים אלו, שלא נצפה במיקרוביום דרך הפה (איור 1F ותאורה S8E) ).

מאחר שההבדלים הם בקומפוזיציה במיקרוביום, הם עשויים גם להשפיע על התפתחות הסרטן ועל התגובה לטיפול, ביקשנו לקבוע אם קיימים הבדלים במיקרוביום בפה או במעיים בקבוצות R ו- NR לטיפול האנטי PD-1. כדי לבדוק זאת, השוו לראשונה יחידות טקסונומיות מבצעיות (OTUs) בקבוצת R לעומת קבוצת NR, והוכיחו כי קבוצות נבדלות של OTUs נדירות בשכיחות נמוכה, קשורות בתגובה לטיפול אנטי PD-1, עם העשרה של Clostridiales ב- R ו Bacteroidales ב- NR במיקרוביום המעיים (p <0.01, איור 2, A ו- B, ותאריכים S9, A ו- C). לא נמצאו הבדלים משמעותיים בהעשרה במיקרוביום האוראלי של R לעומת NR (ציורים S9, B ו- D, איור S10). כדי לחקור את הממצאים הללו, ביצענו השוואות מעמדיות גבוהות באמצעות אנליזה ליניארית של גודל ההשפעה (LefSe) (31), אשר הוכיחה שוב כי קיימים חיידקים דיפרנציאליים בשפע במיקרוביום הצואה של R לעומת NR לטיפול אנטי PD-1, כאשר Clostridiales / Ruminococcaceae (חיידקים) מועשר בקבוצת R ו Bacteroidales (חיידקים) מועשר בקבוצת NR (איור 2, C ו- D). לא נמצאו הבדלים משמעותיים במיקרוביום דרך הפה בין R ו- NR, למעט Bacteroidales גבוה יותר ב- NR לטיפול אנטי PD-1 (איור S11). לאחר מכן בוצעו השוואות של זוגות לתגובה עבור המסה החיידקית בכל הרמות. בנוסף לאישור ההבדלים הטקסונומיים הקודמים, ניתוחים אלה זיהו את הפאקאליבקטריום כמשמעותי עבור קבוצת R (איור 2E ו טבלה S3). Metagnomic WGS אישר עוד העשרה של מינים פקאליבקטריום בנוסף לאחרים ב- R, בעוד Bacteroides thetaiotaomicron, Escherichia coli, ו Anaototruncus colihominis היו מועשרים NR (איור 2F ו טבלה S4). חשוב לציין, מיקרוביום המעיים נמצא יציב יחסית לאורך זמן במספר מוגבל של דגימות שנבדקו (איור S12).

איור 2

ההבדלים בהרכב של המיקרוביום המעיים קשורים לתגובות לטיפול אנטי PD-1

Heatmap (A) (ייצוג גרפי של מידע בצורת מטריצה) של OTU R (n = 30) ו NR (n = 13). העמודות מציינות חולים מקובצים על ידי תגובה וממוינים לפי גיוון בתוך קבוצות R ו- NR; השורות מציינות OTUs חיידקים מקובצים ל3 קבוצות בהתאם להעשרה שלהם / דלדול ב R לעומת NR: קבוצה 1 (מועשרת ב R), קבוצה 2 (מדוללת), וקבוצה 3 (מועשרת ב NR), ולאחר מכן ממיינים לפי שפע ממוצע בתוך כל קבוצה.

(B) הרכב פילוגנטי של OTUs בתוך כל קבוצה לפי רמת הסדר. קבוצה 1 (מועשרת ב R); קבוצה 2 (מדוללת); קבוצה 3 (מועשרת ב NR).

(C) cladogram ( דיאגרמה המשמשת בכדי להראות קשרים בין אורגניזמים) טקסונומי מן LEfSe מראה הבדלים בצואה.

(D) ציוני LDA מחושבים עבור מינים דיפרנציאלים במיקרוביום צואה של R (כחול) ו- NR (אדום). אורך מציין את גודל האפקט הקשור לטקסון (קבוצה של אורגניזמים) p = 0.05 עבור מבחן Kruskal-Wallis; LDA> 3.

(E) חיידקי בטן שונים ב- R (כחול) לעומת NR (אדום) על ידי בדיקת MW (מותאמת ל- FDR) בכל הרמות הטקסונומיות.

(F) השוואות Pairwise (בזוגות) על ידי בדיקת MW של שפע של מינים מגטונמים (MGS) מזוהה על ידי WGS בדגימות הצואה (n = 25): R (n = 14, כחול), NR (n = 11, אדום). * p <0.05, ** p <0.01. הצבעים משקפים את השפע הגנטי המדמה באמצעות “ברקודים” לפי סדר העוצמה הבא: לבן (0) <כחול בהיר <כחול <כחול <צהוב <כתום <אדום עבור שפע גדל, וכל שינוי צבע מתאים לשינוי פי 4. “ברקודים” אלה, MGS, מופיעים כמו קווים אנכיים (גנים בשפע משותפת במדגם) צבעוני בהתאם לשפע הגן.

לאחר מכן שאלנו אם ההרכב החיידקי והשפע בתוך המעי הגס ו/או המיקרוביום האוראלי של המטופלים נקשרו לתוצאת טיפול ספציפית לטיפול אנטי PD-1. קיבצנו את כל OTUs המזוהים באשכולות של OTUs הקשורים (crOTUs) באמצעות בנייה של עץ פילוגנטי מתוך נתוני יישור רצף. טכניקה זו כוללת השוואה של שפע של קיבוצים פוטנציאליים שונים של חיידקים המבוססים על רצף 16S ומסייע להתמודד עם התפלגות דלילה של OTU השפע שנצפה בהעדר גישה זו (איור S13). קיבוץ היררכי ללא השגחה של שפע CROTU בתוך המעי הגס והמיקרוביום האוראלי בוצעו לאחר מכן ללא קלט של נתוני תגובה. מצאנו כי המטופלים הופרדו לשני סוגים שונים של הקהילה. סוג 1 כלל את R, והוא הועשר ב-Clostridiales, ואילו סוג 2 כלל תערובת של R ו- NR (p = 0.02) והועשר ב-Bacteroidales (איור 3A). בכדי להבין טוב יותר את הבדלי ההרכב, בין סוגי קהילות אלה, ביצענו שוב השוואות זוגיות של מיקרוביוטה במעיים, וזיהינו תבנית דומה מאוד לזו שנצפתה על ידי תגובה, כאשר Clostridiales / Ruminococcaceae מועשר בסוג 1, ו Bacteroidales מועשר בסוג 2 (איור S14A וטבלה S5). יתר על כן, קהילות אלה מקובצות באמצעות ניתוח קואורדינטות עיקריות של מרחקים משוקללים (איור S14B). ניתוח של CROTUs במיקרוביום של הפה לא גילה שום קשר לכאורה לתגובה של הטיפול (איור S15, A ו- B).

איור 3

שפע של CROTUs בתוך המיקרוביום במעיים, מנבא את התגובה של טיפול האנטי PD-1

(A) מלמעלה: אשכולות היררכיים ללא פיקוח על ידי הצמדה מלאה של מרחקים אוקלידים של שפע CROTU ב43 דגימות צואה שונות. מלמטה: שכיחותם היחסית ברמת סדר לפי סוג הקהילה crOTU.

(B) התאחדות של סוגי הקהילה crOTU עם תגובה לאנטי PD-1 על ידי מבחן מדויק של פישר. סוג הקהילה של crOTU 1 (שחור, n = 11: R = 11, NR = 0); crOTU סוג קהילה 2 (כתום, n = 32: R = 19, NR = 13). הפסים הכחולים מציינים את המגיבים, בעוד שפסים אדומים מציינים את אלה שאינם מגיבים.

(C) השוואה בין KM PFS עקומות על ידי מבחן טווח ארוך בחולים עם שפע גבוה (כחול כהה, n = 19, חציון PFS = undefined) או בעלי שפע נמוך (כחול בהיר, n = 20, חציון PFS = 242 ימים) של Faecalibacterium (עקומת PFS העליון ). שכיחות גבוהה (אדום כהה, n = 20, חציון PFS = 188 ימים) או בשפע נמוך (אדום בהיר, n = 19, חציון PFS = 393 ימים) של Bacteroidales (עקומת PFS התחתונה).

(D) אשכולות היררכיים ללא השגחה של העשרה, מחושבת כמספר נתיבי MetaCyc החזויים במטגונמיה של דגימות צואה מ 25 חולים (R = 14, NR = 11). העמודות מייצגות דגימות מטופלים (כחול = R, אדום = NR) ושורות מייצגות את ההעשרה של נתיבי MetaCyc החזויים (העשרה נמוכה = כחול, שחור = העשרה בינונית, צהוב = העשרה גבוהה). טקסט שחור: מסלולים ביוסינתטיים, טקסט כחול: מסלולים משפילים. * p <0.05.

בכדי לחקור כיצד משפיעים מיני חיידקיים ספציפיים על התגובה לטיפול בחולה, השוונו PFS לאחר טיפול אנטי-PD-1, שכן הוא התייחס ל”להיטים העליונים” שנצפו בעקביות בניתוחים שלנו. מהמשפחה של רומינוקוקאצ’אסי של סדר ה Clostridiales, התמקדנו בחייקים מסוג Faecalibacterium בקבוצת R, ומסוג Bacteroidales בקבוצת NR, חולים חולקו לתוך קטגוריות גבוהות ונמוכות על בסיס חציון יחסיות השפע של טקסה (קבוצה של אורגניזמים) במיקרוביום המעיים. לחולים עם שפע פאקליבקטריום גבוה היה PFS ממושך משמעותית לעומת אלו עם שכיחות נמוכה (p = 0.03). לעומת זאת, לחולים עם שפע גבוה של חיידקי Bacteroidales, היה PFS מקוצר בהשוואה לאלו עם שכיחות נמוכה (p = 0.05, איור 3D). זה עולה בקנה אחד עם נתונים שפורסמו לאחרונה בקבוצה קטנה של מטופלים על המצור CTLA-4, במקרה ההוא, לחולים עם שפע גבוה יותר של Faecalibacterium היה PFS מתמשך לעומת אלה עם שפע של חיידקי Bacteroidales של מיקרוביום המעיים. בנוסף, ניתוחי הסיכונים היחסיים של Cox הוכיחו כי הניבוי באמצעות החיידקים, החזקים ביותר עבור התגובה לטיפול אנטי PD-1, היו גיוון אלפא [יחס סיכון ביניים (HR) = 3.60, 95% C.I. = 1.02-12.74; (HR = 2.92, CI = 1.08-7.89) ובקטרואידים (HR = 0.39, 95% CI = 0.15-1.03). במיקרוביום צואה. לא נמצא קשר מובהק בין PFS ושלב בקבוצה שלנו.

המודל הסופי הרב-משתני שלנו נבחר על ידי בחירה מדורגת ורב-שכבתית, וכלל פאקליבקטריום (HR = 2.95, 95% CI = 1.31-7.29, p = 0.03) ו- טיפול מוקדם (HR = 2.87, 95% CI = 1.10-7.89, p = 0.03 ) (טבלה S6). כמו כן, השפע של פקאליבקטריום ובקטרואידאלים השגיח על משתנים קליניים רלוונטיים בניתוח של עקומת אופייני ROC (תרשים S16).

לאחר מכן, ביקשנו לקבל תובנה לגבי המנגנון שבאמצעותו מיקרוביום המעיים עשוי להשפיע על התגובה לטיפול אנטי PD-1, פרופיל גנומי ראשון שנערך לתפקודי דגימות מיקרוביום של המעי באמצעות רצף  WGSמטאגנומי (n = 25) ב- R (n = 14) לעומת NR (n = 11). אורגניזמים ספציפים של גנים הוקצו באנציקלופדיה של קויוטו (KEGG) אורתולוגיה (KO), ועל סמך הסברים אלה, מטגונמים עבור כל מדגם, שוחזרו במסלולים מטבוליים באמצעות היררכית MetaCyc.

אשכולות היררכיים ללא פיקוח של העשרת נתיבים חזויים זיהו שתי קבוצות של דגימות מטופלים, עם שיעורי תגובה של 69.2% ו- 41.7% (איור 3E). דפוס דומה נצפה גם בשכיחות KO עם שיעורי תגובה של 70.6% ושל 37.5% (איור S17). השוואות של העשרת המסלולים בקבוצות אלו הראו שינויים בתפקודים המטבוליים, עם תפקודים אנבוליים השולטים ב- R כולל ביוסינתזה של חומצות אמיניות (איור 3E), אשר עשויים לקדם את חסינות המארחת, ואילו פונקציות הקטבולי שולטות ב- NR (איור 3E, איור) . S16, וטבלה S7).

ישנן עדויות ברורות במודלים קדם-קליניים, שבהם הרכב דיפרנציאלי של המיקרוביום של המעיים עשוי להשפיע על תגובות טיפוליות לטיפול אנטי PD-1 ברמת המיקרו-סביבה, ולכן, בחנו את הקשר בין מיקרוביוטה של המעיים לבין מיקרוביוטיה מערכתית ולבין תגובות חיסוניות נגד גידול בקרב קבוצת המטופלים שלנו בטיפול אנטי PD-1. השוונו את החיידק החיסוני המשויך לגידול באמצעות אימונוהיסטוכימיה רב-פרמטרית (IHC) וצפינו בצפיפות גבוהה יותר של תאי T8 מסוג CD8 בדגימות בסיסיות של R לעומת NR (p = 0.04), בהתאם לדוחות קודמים (איור 4A ו- S18 ). השוואות ה-Pairwise (זוגות) באמצעות קורלציות דרגה Spearman בוצעו לאחר מכן בין המינונים של החיידקים הספציפיים המועשרים במיקרוביום המעיים של R ו- NR ובסימוני החיסון של המיקרו-סביבה של הגידול,  נראתה הוכחת המתאם החיובי המובהק סטטיסטית בין תאי CD8 + T בחדירה ובגידול ובשפע של הפקליבקטריום, ממשפחת Ruminococccaceae ו Clostridiales במעיים וקורלציה לא משמעותית אבל שלילית עם Bacteroidales (איור 4, B ו- C, תאנים S19 ו S20).

לא נמצאו קשרים בין צפיפות תאי ה- CD8 + T ובין מגוון החברות ב crOTU (איור S21). ניתוח של תגובות מערכת החיסונית באמצעות זרימת ה-cytometry (מדידת איפיוני התאים) ומבחני ציטוקינים גילו כי חולים עם שפע גבוה של Clostridiales, Ruminococcaceae או Faecalibacterium במעיים היו בעלי רמות גבוהות יותר של תאי CD4 + + ו CD8 + T במחזור המערכת עם תגובת ציטוקין לאנטי PD-1 , בעוד שלמטופלים עם שפע של Bacteroidales במיקרוביום של המעיים, היו רמות גבוהות יותר של תאי T רגולטוריים (Treg) ותאי מדכאים מיאלואידים (MDSC) במחזור הדם, עם תגובת ציטוקינים קהה (איור 4D ותאנים) S22 ו- S23).

כדי להבין טוב יותר את השפעת ההבדלי ההרכב במיקרוביום המעיים על עיבוד האנטגן והצגתו בתוך המיקרו-סביבתי של הגידול, ביצענו את ה- IHC המולקולי, המכוון את תא המיאלויד. במחקרים אלו, חולים עם שפע גבוה של פקאליבקטריום במיקרוביום של המעיים היו בעלי צפיפות גבוהה יותר של תאים חיסוניים וסמנים של עיבוד אנטיגן בהשוואה לאלו עם שפע של Bacteroidales (איור 4, E ו- F, ותאנים). S24 ו- S25), דבר המצביע על מנגנון אפשרי שבאמצעותו מיקרוביום המעיים עשוי לווסת את התגובות החיסוניות נגד הגידול, אם כי יש לאמת את זה בקבוצות גדולות יותר.

איור 4

מיקרוביום מעי חיובי קשור לחסינות מערכתית ואנטי-סרטנית משופרת

(A) כימות על ידי IHC של תאי CD8 + T בטיפול בגידולים בקבוצה R (n = 15, כחול) וקבוצה NR (n = 6, אדום) על ידי הבדיקה החד צדדית MW. ברי השגיאה מייצגים את התפלגות צפיפות תאי T + CD8.

(B) דירוגים שונים של דגימות צואה (n = 15) בתחילת המחקר ו- CD3, CD8, PD-1, FoxP3, Granzyme B, PD-L1 וצפיפות RORγT על-ידי ציון H בגידולים מתאימים.

(C) רגרסיה ליניארית חד-משתנית בין CD8 + ספירת / mm2 בגידול מול פקאליבקטריום (כחול, r2 = 0.42, p <0.01) ובקטרואידאלס (אדום, r2 = 0.06, p = 0.38) בשפע.

(D) דירוג המתאם בין מסה צואה שונה באופן משמעותי ותדירות של סוגי תאים שצוין על ידי cytometry הזרימה בדם ההיקפי בתחילת.

(E) הצגת multiplex IHC.

(F) תדירות של סוגי תאים חיסוניים שונים בחולים עם פקאליבקטריום גבוה (n = 2) או בקטרידוידים (n = 2) במעיים.

(G) תכנון ניסיוני של מחקרים בעכברים ללא גרגר (GF). זמן בימים (כפי שצוין D) ביחס הזרקת הגידול (תאים 2.5-8×105 הגידול).

(H) ההבדל בגודל על ידי MW הבדיקה של גידולים ביום 14, מושתלים R-FMT (כחול) ועכברים NR-FMT (אדום) באים לידי ביטוי כמו שינוי  (FC) ביחס נפח הגידול הממוצע של עכברים בבקרה GF. אלו נתונים מ 2 ניסויים FMT עצמאית (R-FMT, n = 5, חציון FC = 0.18, NR-FMT, n = 6, חציון FC = 1.52). (I) גידול של 2%, נפח החציון החציוני = 403.7 mm3), NR-FMT (אדום n = 3, נפח הגידול החציוני = 2301 mm3 ), ובקרת (שחור, n = 2, נפח הגידול החציוני = 771.35 mm3) עכברים. הסטטיסטיקה היא כדלקמן: p = 0.20 (R-FMT לעומת NR-FMT), p = 0.33 (NR-FMT לעומת בקרה) על-ידי בדיקת MW. קו שחור מנוקד מסמן חתך הגידול לטיפול α-PD-L1 (500mm3).

(J) N = FMT n = 2, חציון = 325 תאים / HPF על פני 12 אזורים). ו עכברים בקרה (n = 2, חציון = 412 תאים / HPF על פני 9 אזורים). MW הבדיקה p = 0.30 (R-FMT לעומת בקרה).

(N), NR-FMT (n = 2, חציון = 24 תאים / HPF על פני 5 אזורים), שליטה n = 2 (חציון = 47 תאים / HPF על פני 10 אזורים). MW הבדיקה p = 0.17 (R-FMT לעומת בקרה). * p <0.05, ** p <0.01, **** p <0.0001

כדי לחקור קשר סיבתי בין מיקרוביום מעי “חיובי” לבין תגובה לחסימה החיסונית, ביצענו ניסויים של השתלת מיקרוביום צואה (FMT) בעכברים מקבלי נגיפים (איור 4). במחקרים אלו, העכברים שהושתלו עם צואה מ R ל טיפול אנטי PD-1 (R-FMT) והם הפחיתו באופן משמעותי את צמיחת הגידול (p = 0.04, איור 4H ותאנה S26A) עד ליום ה-14 בהשוואה לאלו שהושתלה צואה מ NR (NR-FMT). חשוב לציין, העכברים המושתלים עם R-FMT הציגו תגובות משופרות לטיפול אנטי PD-L1 (איור 4I) בניגוד לעכברים שהיו מושתלים עם צואה מ NR (NR-FMT). לאחר מכן ביצענו 16S -רצף על דגימות צואה שנאספו עבור עכברים שטופלו ב FMT, הוכחנו כי לעכברים מה R-FMT היה גם שפע גבוה יותר של Faecalibacterium במיקרוביום המעי שלהם (p <0.01) (איור S27).

כמו כן, רצינו להבין טוב יותר את המנגנון שבאמצעותו מיקרוביום המעיים עשוי להשפיע על תגובות חיסוניות מערכתיות ואנטי-סרטניות, וביצענו מחקרים קורלטיביים על גידולים, דם היקפי וספליינס מעכברים אלה. מחקרים אלה הראו כי הגידולים של העכברים שקיבלו R-FMT היו בעלי צפיפות גבוהה יותר של תאי CD8 + T מאשר בעכברים שקיבלו NR-FMT, בהתאם לנתונים אנושיים (איור 4J ותיאור S26B, סדרה עליונה). ניתוח של CD45 + מיאלואידית תאים לימפואידים חדירת תאים על ידי זרימת cytometry אישרו תוצאה זו (איור S26C). יתר על כן, FMT מ R הגדיל באופן מקומי את מספר CD45 + החיסון ו CD8 + T תאים במעיים לעומת NR-FMT (איור 4K ו איור  S26B).

ניתוח cytometry המוני באמצעות הפחתת מימד t-SNE בוצע על גידולים של העכברים, והוכיח את הרגולציה של PD-L1 בסביבת המיקרו של הגידול של העכברים. קבלת R-FMT לעומת NR-FMT (איור S26D), דבר המצביע על התפתחות סביבת מיקרו גידול “חמה”. מחקרים פנוטיפיים נוספים על חדירת החיסון של הגידול גילו העשרה משמעותית של תאי המולדת המולדים (ביטוי CD45 + CD11b + Ly6G +) בעכברים שקיבלו R-FMT (איור S26E). תדירות נמוכה יותר של תאים מיאלואידים מדכאים (ביטוי CD11b + CD11c +) נצפתה בעכברים שקיבלו R-FMT בהשוואה לעכברים שקיבלו NR-FMT (איור S26F). לבסוף, עלייה בתדירות של RORγT + TH17 תאים בגידול זוהה גם בעכברים NR-FMT (איור S26G), בקנה אחד עם מה שראינו גידולים של חולים שלא הגיבו לטיפול אנטי PD-1. עכברים שקיבלו NR-FMT היו בעלי רמות גבוהות יותר של תאי CD4 + FoxP3 + T (איור S26H) ותאי CD4 + IL-17 + (איור S26I) בטחול, דבר המצביע על פגיעה בתגובות החיסונית של המארח.

התוצאות שלנו מראות כי מיקרוביום המעיים עשוי לווסת תגובות לטיפול אנטי PD-1 בחולי מלנומה. אנו מציעים כי חולים עם מיקרוביום בטן “חיובי” (למשל, גיוון גבוה ושפע של חיידקי Ruminococcaceae / Faecalibacterium) הגדילו את המערכת החיסונית ואת התגובות החיסוניות נגד הגידול בעזרת גמות אנטיגן מוגברת, ושיפור תפקוד תא T בפריפריה ואת סביבת המיקרו של הגידול. לעומת זאת, חולים עם מיקרוביום של מעיים “לא טובים” (למשל, גיוון נמוך ושפע יחסי גבוה של חיידקי Bacteroidales) סבלו מתגובות מערכתיות וחיסוניות נגד הגידול בתיווך לימפה תוך-מוחית מוגבלת וחדירת מיאלואיד ויכולת הצגה של אנטיגן. ממצאים אלה מדגישים את הפוטנציאל הטיפולי של שינוי המיקרוביום במעיים בחולים המקבלים חיסונים במחסום, ומצדיקים הערכה מיידית בחולי סרטן באמצעות ניסויים קליניים.