סיכום Galacturonic Acid Inhibits the Growth of Saccharomyces cerevisiae on Galactose, Xylose and Ara

חומצה גלקטורונית – סיכום

Galacturonic Acid Inhibits the Growth of Saccharomyces cerevisiae on Galactose, Xylose and Arabinose

Eline H. Huisjes, Erik de Hulster, Jan C. van Dam, Jack T. Pronk and Antonius J. A. van Maris

מבוא

תסיסה יעילה של סובסטרטים מעורבים הינה חיונית להמרה מיקרוביאלית של חומרי גלם מדור שני, כולל מי קולחין עשירים בפקטין כמו קליפות של פירות הדר ועיסת סלק סוכר. חומצה גלקטורונית הינה מרכיב מרכזי בהידרוליזטים של חומרים אלו, העשירים בפקטין. שמר האפייה (Saccharomyces cerevisiae), המייצר העיקרי של ביו-אתנול, אינו מסוגל להשתמש בחומצת סוכר זו. ההשפעה של חומצה גלקטורונית על תסיסת אלכוהול באמצעות S. cerevisiae נחקרה בעזרת תרביות אצווה אנאירובית הגדלות על תערובת של גלוקוז וגלקטוז בריכוזי חומצה גלקטורונית שונים ועל תערובת של גלוקוז, קסילוז וארבינוז. בתרביות הגדלות ב- pH 5.0, הרבה מעל ערך ה- pKa של חומצה גלקטורונית (3.51), ההוספה של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית לא השפיעה על הקינטיקה והגדילה של תסיסת הגלקטוז. בתרביות שגודלו ב- pH 3.5, ההוספה של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית לא השפיעה באופן משמעותי על עיכול הגלוקוז. עם זאת, ברמת pH נמוכה זו, החומצה הגלקטורונית עיכבה לחלוטין את הצמיחה על גלקטוז והפחיתה את שיעור עיכול הגלקטוז ב- 87%. בנוסף, נמצא כי חומצה גלקטורונית מעכבת באופן משמעותי את התסיסה של קסילוז וארבינוז באמצעות זן ה- S. cerevisiae המהונדס IMS0010, הגורם לתסיסת פנטוז. הנתונים מצביעים על כך כי העיכוב מתרחש כאשר חומצה גלקטורונית לא-דיסוציאטיבית נמצאת מחוץ לתא ותומכים בהשערה כי שילוב של קצב ספיגת סובסטרטים מופחת הנובע מעיכוב תחרותי על Gal2p, דרישת אנרגיה מוגברת לצורך שימור הומיאוסטזיס תאי, ו/או הצטברות של חומצה גלקטורונית 1- זרחן תורמים לעיכוב זה. יש לקחת בחשבון את התפקיד של חומצה גלקטורונית כמעכבת תסיסת סוכר בעת תכנון תהליכי תסיסת שמרים המבוססים על חומרי גלם עשירים בפקטין.

השינוי שחל בביו-טכנולוגיה התעשייתית, משימוש בסירופ סוכר בזיקוק גבוה לשימוש במקורות אנרגיה ופחמן זולים וברי-קיימא, כמו הידרוליזטים של תאית עץ, מייצג בנוסף מעבר מיישום של חד-סוכרים ליישום של תערובות סובסטרט. הידרוליזטים של תאית עץ מהווים חומר גלם מבוקש עבור ייצור ביו-אתנול על ידי S. cerevisiae. הידרוליזטים אלו מכילים לא רק סוכרים תוססים, אלא גם מעכבים וסוכרים שאינם מותססים על ידי שמרים אלו. דוגמאות לחומרי גלם המכילים סובסטרטים מרובים הם עיסת סוכר סלק והידרוליזטים של קליפות פרי הדר, המכילים אמנם כמות קטנה יותר של ליגנין, אך במקום זאת מכילים כמות גדולה של פקטין. פקטין הינו רב-סוכר מורכב הבנוי משלד של שיירי חומצה גלקטורונית ועשוי להכיל שרשראות-צד המכילות מגוון סוכרים ניטראליים. בנוסף, ניתן להעביר את הפולימר מתיל-אסטריפיקציה ואציטלציה.

ההידרוליזטים של עיסת סוכר סלק וקליפות הדרים מורכבים בעיקר מגלוקוז, גלקטוז, ארבינוז, קסילוז וחומצה גלקטורונית. הגלוקוז והגלקטוז מתעכלים ברצף על ידי זני בר של S. cerevisiae. הגלקטוז עובר מטבוליזם דרך נתיב Leloir. חוסר היכולת של חלק מזני ה- S. cerevisiae לעבור מגדילה אנאירובית מוגבלת-גלוקוז לעיכול גלקטוז מדגימה את עלויות האנרגיה הקשורות בביטוי של האנזימים של נתיב Leloir. למרות שה- S. cerevisiae אינה מסוגלת להתסיס באופן טבעי את סוכרי הפנטוז קסילוז וארבינוז, ניתן להתגבר על מגבלה זו באמצעות מספר אסטרטגיות של הנדסת מטבוליזם. זני בר של S. cerevisiae אינם מסוגלים להתסיס את חלק החומצה הגלקטורונית הנמצא בהידרוליזטים של עיסת סוכר סלק, ועד עתה, לא ניתן היה להשיג זאת גם באמצעות הנדסה מטבולית. כתוצאה מכך, כאשר עיסת סוכר סלק או קליפות הדרים משמשים כחומרי גלם להתססה אלכוהולית, תתקיים נוכחות של ריכוזים גבוהים של חומצה גלקטורונית בציר ההתססה.

חומצה גלקטורונית הינה החומצה האורונית של גלקטוז והיא בעלת קבוע דיסוציאציה (pKa) של 3.51. לפיכך, בערכי pH הרלוונטיים עבור תסיסת תאית עץ, גם הצורה הדיסוציאטיבית וגם הצורה הלא-דיסוציאטיבית של החומצה הגלקטורונית יהיו נוכחות. לפי מיטב ידיעתנו, ההשפעות המעכבות האפשריות של חומצה גלקטורונית על ביצועי השמרים טרם נחקרו בעבר.

מוטיבציה ומטרות

תסיסה יעילה של סובסטרטים מעורבים הינה חיונית להמרה מיקרוביאלית של חומרי גלם מדור שני, כולל מי קולחין עשירים בפקטין כמו קליפות של פירות הדר ועיסת סלק סוכר. חומצה גלקטורונית הינה מרכיב מרכזי בהידרוליזטים של חומרים אלו, העשירים בפקטין. השינוי שחל בביו-טכנולוגיה התעשייתית, משימוש בסירופ סוכר בזיקוק גבוה לשימוש במקורות אנרגיה ופחמן זולים וברי-קיימא, כמו הידרוליזטים של תאית עץ, מייצג בנוסף מעבר מיישום של חד-סוכרים ליישום של תערובות סובסטרט. רבים מהיישומים המקובלים של השמרים Saccharomyces cerevisiae כבר מבוססים על תערובות סובסטרט, כמו תערובת של גלוקוז ופרוקטוז בתירוש ענבים ותערובות של מלטוז, סוכרוז, גלוקוז ופרוקטוז בתירוש בירה. בדרך כלל, השמרים מעכלים תחילה את הסובסטרט המועדף עליהם, גלוקוז או פרוקטוז, על ידי דיכוי גלוקוז של הגנים המעורבים בספיגה ובעיכול של סובסטרטים אחרים. מצב זה מוביל לעיכול רציף של סובסטרטים מרובים, הידוע בתור גדילה דו-שלבית (diauxic growth). הידרוליזטים של תאית עץ מהווים חומר גלם מבוקש עבור ייצור ביו-אתנול על ידי S. cerevisiae. הידרוליזטים אלו מכילים לא רק סוכרים תוססים, אלא גם מעכבים וסוכרים שאינם מותססים על ידי שמרים אלו. דוגמאות לחומרי גלם המכילים סובסטרטים מרובים הם עיסת סוכר סלק והידרוליזטים של קליפות פרי הדר, המשמשים כיום בעיקר בתור מזון בעלי חיים. באופן חלופי, ניתן להעביר אותם הידרוליזה ולהשתמש בהם בתור סובסטרטים לתסיסה. בניגוד למקורות המקובלים של תאית עץ, כמו שאריות קני תירס, קש חיטה ודוחן, עיסת סוכר סלק וקליפות הדרים מכילים אמנם כמות קטנה יותר של ליגנין, אך במקום זאת מכילים כמות גדולה של פקטין. המטרה של המחקר הנוכחי היא לבדוק את ההשפעה של חומצה גלקטורונית על תסיסת סוכר באמצעות S. cerevisiae. לשם כך, תרביות אצווה אנאירוביות על תערובות של גלוקוז וגלקטוז הורצו על מגוון ריכוזי חומצה גלקטורונית, גם ב- pH אופטימאלי (pH 5.0) וגם ב- pH נמוך (pH 3.5). בנוסף, נחקרה ההשפעה של חומצה גלקטורונית על התסיסה של תערובות של גלוקוז, קסילוז וארבינוז בתרביות אנאירוביות של זן ה- S. cerevisiae המהונדס IMS0010, הגורם לתסיסת פנטוז.

מהלך הניסוי

חומצה גלקטורונית מעכבת עיכול גלוקוז בתסיסה אנאירובית ב- pH נמוך – תחת תנאים אנאירוביים, הגלוקוז והגלקטוז תוססים לכמויות אקוימולריות של אתנול ו- CO2. הייצור של CO2, שנוטר באופן רצוף דרך ריכוזי ה- CO2 בגז, מהווה לפיכך מידה של שיעור התסיסה. לא נרשמו הבדלים משמעותיים בקינטיקות התסיסה בין התרביות הגדלות ב- pH 5.0 לבין אלו הגדלות ב- pH 3.5. על מנת לבחון את ההשפעות של חומצה גלקטורונית על התסיסה של תערובות סוכר, תרביות אצווה אנאירוביות גודלו על תערובת של גלוקוז וגלקטוז (10g ⋅ liter-1 כל אחד) עם ריכוזי חומצה גלקטורונית של לא יותר מ- 10g ⋅ liter-1. ההוספה של חומצה גלקטורונית בריכוזים של 2.5, 5.0, 7.5 או 10g ⋅ liter-1 לא השפיעה על שלב עיכול הגלוקוז ב- pH 3.5, כפי שניתן ללמוד משני השיאים הזהים כמעט לחלוטין בפרופיל ה- CO2. עם זאת, בניגוד חד לניסויים ב- pH 5.0, נרשמה השפעה משמעותית של הוספת החומצה הגלקטורונית על שלב עיכול הגלוקוז ב- pH 3.5.

ניתוח פיזיולוגי של עיכוב מטבוליזם הגלקטוז על ידי חומצה גלקטורונית – על מנת לקבל תובנות נוספות לגבי העיכוב הנצפה של מטבוליזם הגלקטוז על ידי חומצה גלקטורונית, עיכול הסוכר, ייצור האתנול והגדילה נקבעו בניסויי תסיסה כפולים עצמאיים עם תערובת של 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 גלקטוז, עם 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית ובלעדיה, ב- pH 3.5. ההוספה של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית הפחיתה (p < 0.01) את קצב עיכול הגלקטוז מ- 4.6 ± 0.4 לקצב ממוצע של 0.6 ± 0.0 mmol ⋅ g (dry weight)-1 ⋅ h-1. בעת הנוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית, ריכוז הביו-מסה נותר קבוע לאחר שהגלוקוז עוכל לחלוטין, מה שמצביע על כך שתסיסת הגלקטוז לא הייתה קשורה לגדילה. ריכוז הגליצרול הסופי עלה (p < 0.002) מ- 14.4 ± 0.1 mM בתרביות הרפרנס ל- 16.9 ± 0.0 mM בתרביות עם החומצה הגלקטורונית. בכדי לבדוק האם הפעילות המטבולית הנמוכה במהלך שלב עיכול הגלקטוז בנוכחות של 10g ⋅ liter-1  חומצה גלקטורונית נגרמה בשל קיימות מופחתת של התרבית, פרמטר זה נבדק על ידי הכתמת קיימות וציטומטריית זרימה. קיימות התרביות נותרה ב- 81% ± 8% 20 שעות לאחר תחילת שלב עיכול הגלקטוז (גיל האצווה 31.5 שעות).

חומצה גלקטורונית מעכבת תסיסת פנטוז באמצעות S. cerevisiae מהונדס – בתרביות האצווה של IMS0010, זן מהונדס של S. cerevisiae המסוגל לעכל באופן יעיל תערובת של גלוקוז, קסילוז וארבינוז, בדקנו האם החומצה הגלקטורונית מעכבת בנוסף גדילה על קסילוז ו/או ארבינוז. לשם כך, ה- IMS0010 הוכן בקדם-תרבית על ארבינוז ואופיין על ידי שימוש בתערובות של 20g ⋅liter-1 גלוקוז, 10g ⋅ liter-1 קסילוז, ו- 10g ⋅ liter-1 ארבינוז בביו-ריאקטורים אנאירוביים בנוכחות ובהיעדר  10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית ב- pH 3.5. להוספת 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית למערך ניסויי זהה לחלוטין הייתה השפעה דראסטית על ביצועי התסיסה של IMS0100. למרות שקצב עיכול הגלוקוז לא השתנה באופן משמעותי, העיכול של סוכרי הפנטוז הושפע באופן דראסטי. כפי שראינו במקרה ללא החומצה הגלקטורונית, בריכוזי גלוקוז של פחות מ- 10g ⋅ liter-1, חלק מהקסילוז (28%) וחלק מהארבינוז (14%) עוכלו, בעוד שיתר הגלוקוז התכלה.

חומצה גלקטורונית אינה מעכבת תסיסת גלוקוז – חומצה גלקטורונית (pKa 3.28) הינה החומצה האורונית הנגזרת מגלוקוז. על מנת לחקור האם העיכוב הנחזה של מטבוליזם הגלקטוז על ידי החומצה הגלקטורונית משקף השפעה כללית יותר של חומצות אורוניות על מטבוליזם סוכר באמצעות שמרים, תרביות אצווה אנאירוביות גודלו ב- pH 3.5 על 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 חומצה גלוקורונית. בניסויים אלו, התאים הוכנו בקדם-תרביות על גלוקוז, מכיוון שהאינדוקציה של נתיב Leloir לא הייתה נחוצה. ב- pH 3.5, 38% מהחומצה נמצאת בצורתה הלא-דיסוציאטיבית.

אינטראקציות אפשריות של חומצה גלקטורונית עם הגלקטוקינאז – מכיוון שגלקטוז וחומצה גלקטורונית הן תרכובות קשורות מבחינה מבנית, העיכוב (התחרותי) של גלקטוקינאז (Gal1p) עשוי להסביר את ההשפעה החזקה של החומצה הגלקטורונית על עיכול הגלקטוז. על מנת לבחון השערה זו, נבדקו האנזימים הראשונים בנתיב Leloir, בתמציות תאים של תרביות בקבוקי טלטול שגדלו על גלקטוז. פעילויות זירחון של חומצה גלקטורונית in vitro, שנבדקו בעזרת בדיקת גלקטוקינאז מותאמת, נותרו מתחת לגבול הזיהוי של 0.028 U ⋅mg protein-1

על מנת לחקור את הזירחון האפשרי in vivo של חומצה גלקטורונית, העשוי להוביל להצטברות תוך-תאית של חומצה גלקטורונית 1-זרחן, הדגימות נאספו במהלך שלב עיכול הגלקטוז של תרביות שגודלו על תערובת של 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 גלקטוז בנוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית ב- pH 3.5.

תוצאות ודיון

מנגנון העיכוב הנוצר על ידי חומצה גלקטורונית – רמות העיכוב השונות ב- pH 3.5 וב- pH 5 מצביעות על כך שההשפעה הנצפית על מטבוליזם הגלקטוז מתרחשת כאשר חומצה גלקטורונית לא-דיסוציאטיבית נוכחת באופן חוץ-תאי. בנוסף, ההבחנה של חומצה גלקטורונית 1-זרחן חוץ-תאית מצביעה על כך שלפחות חלק מהחומצה הגלקטורונית יכולה להיכנס לתא השמרים ב- pH 3.5. העיכוב התחרותי של נשא הגלקטוז Gal2p, שב-IMS0100 אחראי בנוסף לנשיאת ארבינוז, מציע מנגנון אפשרי לעיכוב חומצה גלקטורונית. העיכוב התחרותי באמצעות ריכוז קבוע של חומצה גלקטורונית אמור להיות בולט יותר כאשר הריכוז של המינים (הנישאים) האחרים פוחת בגלל העיכול שלו על ידי תאי השמרים. מצב זה אכן נצפה במהלך הגדילה האנאירובית על תערובות גלוקוז-גלקטוז בנוכחות של חומצה גלקטורונית ב- pH 3.5. העובדה כי חומצה גלקטורונית מעכבת בנוסף את התסיסה של קסילוז, שאינו נישא (רק) על ידי Gal3p, מצביעה על כך שחומצה גלקטורונית היא בעלת השפעות מעכבות נוספות.

בציטוסול, החומצה הגלקטורונית עוברת דיסוציאציה בשל ה- pH הבין-תאי הקרוב לניטראלי, ופוטנציאלית מובילה לטוקסיות חומצה אורגנית חלשה קלאסית. מכיוון שחומצה גלקטורונית אינה יכולה לעבור מטבוליזה על ידי S. cerevisiae, האניון מצטבר, מה שיכול לעכב תהליכים תאיים, או מופרש על חשבון ATP. ייצור ה- ATP הקשור בקצב עיכול הגלקטוז הנצפה ב- pH 3.5 בנוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית יהיה 1.2 mmol ATP ⋅ g(dry weight)-1 ⋅ h-1, והוא היה למעשה רק מעט מעל ערך זה. במצב כזה, דרישת האנרגיה הגבוהה יותר הדרושה לשימור הומיאוסטזיס תאי בשילוב עם שיעור ספיגת סובסטרט נמוך בשל העיכוב התחרותי של Gal2p יוביל למצב שבו אין די ATP זמין על מנת לאפשר גדילה. ממצא זה הינו עקבי להבחנה כי הגלקטוז עוכל, ורוב האוכלוסייה נותרה ברת-קיימא, אך לא התרחשה גדילה ב- pH 3.5 בנוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית. מכיוון שאפילו בהיעדר חומצה גלקטורונית, שיעורי העיכול של הקסילוז והארבינוז הם כבר נמוכים יותר מזה של הגלקטוז, ההשפעות של עיכוב תחרותי וטוקסיות חומצה אורגנית חלשה יהיו דרסטיות אף יותר.

מנגנון עיכוב אפשרי נוסף קשור לריכוזים הבין-תאיים הנמדדים של חומצה גלקטורונית 1-זרחן (ca. 1 μml ⋅ g[dry weight]-1), שהיו באותו טווח כמו הריכוזים של הקסוז-זרחן המשמשים כמתווכים של מטבוליזם שמרים מרכזי, כמו גלוקוז-6-זרחן או פרוקטוז-6-זרחן. למרות שבעבר הן לא תוארו לגבי חומצה גלקטורונית 1-זרחן, ההשפעות המעכבות של תרכובות מזורחנות מתועדות היטב. בהסתכלות כללית, הניסויים שכללו גם את התערובות של גלוקוז וגלקטוז וגם את התערובת של גלוקוז, קסילוז וארבינוז, איששו את ההשערה כי שילוב של מספר מנגנונים הוא האחראי לעיכוב הנגרם על ידי חומצה גלקטורונית.

במחקר זה לא נמצאו ראיות כלשהן לעיכוב של תסיסת גלוקוז על ידי חומצה גלוקורונית. ב- S. cerevisiae, נשיאת הקסוז מתאפשרת על ידי לפחות 20 חברים שונים במשפחת ההקסוז והמלטוז. בהינתן הגיוון הרב בזיקות של נשאי הקסוז שונים עבור גלוקוז וחד-סוכריים אחרים, נראה סביר כי לפחות חלקם הם בעלי קבוע מעכב נמוך עבור חומצה גלוקורונית. בנוסף, השיעור הגבוה יותר של תסיסת ATP הנובע מההמרה המהירה של גלוקוז לאתנול עדיין יאפשר גם גדילה וגם תחזוקה תאית.

מסקנות והמלצות

– התסיסה האלכוהולית היעילה של תערובות סוכר, במיוחד כאשר מדובר בסובסטרטים לא-טבעיים של S. cerevisiae כמו קסילוז וארבינוז, היא מאתגרת כשלעצמה גם ללא תרכובות מעכבות. ההשפעה החזקה והשלילית של ריכוזים נמוכים יחסית של חומצה גלקטורונית על התסיסה של גלקטוז, קסילוז וארבינוז באמצעות S. cerevisiae מייצגת אתגר שטרם היה ידוע לנו. פתרונות תכנון תהליך אפשריים כוללים הפעלת תהליכי תסיסה בערכי pH המאפשרים גדילה של S. cerevisiae בריכוזי החומצה הגלקטורונית הדרושים או הפחתה של ריכוזי הסוכר הכוללים. עם זאת, הגישה הראשונה עלולה להגדיל את הסיכוי לזיהום, בעוד שהגישה השנייה מובילה לריכוזי תוצר נמוכים ולפיכך לעלויות גבוהות של זיקוק אתנול. ניתן להתגבר על בעיה זו באמצעות הזנה מוגבלת גלוקוז, על מנת לספק את ה- ATP הדרוש בכדי להתגבר על ההשפעות הטוקסיות. אסטרטגיה תפעולית פשוטה יחסית מסוג זה עשויה גם להקל על טוקסיות החומצה החלשה של החומצה הגלקטורונית אך אינה משפיעה על העיכוב התחרותי של חומצה גלקטורונית על הנשיאה.

באופן חלופי, ניתן להתגבר על עיכוב חומצה גלקטורונית באמצעות הנדסה מטבולית או אבולוציונית. הנדסה אבולוציונית נמצאה כמסוגלת לשפר גם את התסיסה של תערובות גלוקוז, קסילוז וארבינוז, וגם את קינטיקות התסיסה של זנים מהונדסים עבור סובסטרט הקסילוז הלא-ילידי בנוכחות של חומצה אצטית. ייתכן וגישה כזו תניב בנוסף זני שמרים המסוגלים ליישם סובסטרטים מעורבים בנוכחות של חומצה גלקטורונית. יהיה זה רווחי אף יותר ליצור מטבוליזציה של חומצה גלקטורונית, ומוטב לעשות זאת על ידי המרתה לאתנול. למרות שזני בר של S. cerevisiae אינם מסוגלים להתסיס חומצה גלקטורונית, קיימים יתרונות רבים ההופכים שמרים לאורגניזם המועדף עבור ייצור ביו-אתנול מחומרי גלם מדור שני, העשירים בפקטין. כל עוד אסטרטגיות אלו אינן מוטמעות בפרקטיקה, עיכוב על ידי חומצה גלקטורונית ימשיך לייצג סוגיית מפתח בייצור מבוסס השמרים של ביו-אתנול ומוצרים אחרים מחומרי גלם עשירים בפקטין.