תקציר

בעבודה זו אתמקד בתיאור גנום וירוס הפטיטיס C, תוך איפיון מרכיביו ותפקידיהם וכן אציג מספר קולטנים של התא המארח בעלי תפקיד מרכזי בכניסת הנגיף לתא. לשם כך אציג מבוא הכולל רקע על וירוס ההפטיטיס C, המבנה שלו, התחלואה לה הוא גורם ואמצעי הטיפול הקיימים, וכן אציג חמישה עבודות מחקר שונות, תוך תיאור שיטות מחקר, תוצאותיהם ומסקנותיהם.

בתחילה עם זיהוי קיומו של וירוס הפטיטיס C, מבחני נוגדן שהתבססו על אזור מסויים בגנום, נמצאו לא יעילים בזיהוי זנים שונים של הזיהום, בשל שונות הרבה בגנום שלו. במחקר הראשון שאציג,  (1993, Simmonds et al.), סיווגו את גנום וירוס ההפטיטיס C לשישה גנוטיפים עיקריים וסדרה של תת גנוטיפים בעזרת אנליזה פילוגנטית של רצפי הנוקליאוטידים שנגזרו מחלק של הגן המקודד חלבון לא מבני (NS-5), מתוך אוסף של 76 דגימות תורמי דם שנדבקו ב- HCV ברחבי העולם. חשיבות זיהוי הגנוטיפים ותתי הגנוטיפים, מעבר לגורמים שאולי קשורים במהלך המחלה, קשור בעיקר להתאמת סוג הטיפול ולמשך הטיפול האנטי ויראלי,  לפי הגנוטיפ.¹

קושי גדול ונוסף, במחקרים של וירוס ההפטיטיס C, היה שלא הצליחו לגדל אותו בתנאי תרבית. המחקר השני שאציג (2005, Lindenbach et al.), מתאר גנום HCV באורך מלא, מגנוטיפ a2 (JFH1) שמשכפל עצמו ומייצר חלקיקי נגיף מדבקים בתא התרבית במבחנה (HCVcc). גנוטיפ זה מדביק ביעילות שורת תאי הפאטומה אנושי (Huh-7), או תת שיבוטים נגזרים שלו (Huh-7.5 ו- Huh-7.5.1).  במחקר עצמו, תוך תיאור תהליך הרכבת הגנום, ההדבקה לתאי התרבית, וזיהוי מאפייני “התנהגות” HVC, הודגמה חשיבות הקולטן התאי CD81 האנושי לכניסת HVC לתא, וייחודו של הוירוס בכך שצפיפותו קלילה מהרגיל,² וכפי שהוצג במחקרים מאוחרים יותר, ³ קשורה לאינטראקציה שלו עם ליפופרוטאינים.

אנליזה שיטתית של מאפיינים של תת תחומים של הגנום של וירוס הפטיטיס C ותפקידם, מתוארת במחקר השלישי שאציג, (2008, Arumugaswami et al.), המתבסס על הכנסת מוטציות של HCV על ידי הוספות אקראיות של 15 נוקלאוטידים (מסומנים בצבע זרחני), אשר גודלו ונבדקו בתאי תרבית. המיקום המדויק של הוספות והשפעתם על צמיחת הוירוס נותח בטכנולוגית גנוטיפ נימית וביואינפורמטיקה לקבלת פרופיל תפקודי של מתחמי חלבון ואלמנטים של ויסות (cis) הקריטיים לשכפול HVC  בתאי תרבית. אחד ממצאי מחקר זה הוא שמתחם NS3 הוא קריטי לשכפול הנגיף, שכן  90.6% מהוספות המוטציות ל- NS3 היו קטלניות לשכפול הנגיף. לפיכך, פרוטאז NS3 חיוני לשכפול נגיפי ומהווה יעד חשוב לטיפול נגדו.⁴ לפיכך, המחקר הרביעי (2010, Tong et al.) שאציג בוחן מולקולה קטנה מסוג קטו-אמיד (Narlaprevir) שמעכבת פרוטאז NS3  לוירוס הפטיטיס C, כאופציה טיפולית משופרת למעכבי פרוטז NS3 שכבר קיימים מסוג קטואמיד (Boceprevir, ו- Telaprevir) ומאושרים לטיפול בשילוב עם הטיפול הסטנדרטי (אינטרפרון אלפא וריבוירין). המחקר מציג מאפיינים קינטיים של מנגנון העיכוב של Narlaprevir (קבוע העיכוב, וזמן מחצית החיים לדיסוציאציה) יעילות נגד פרוטאזות של גנוטיפים 1 עד 3, מינון, והתוצאות הלא רצויות של יצירת מוטנטים עמידים שנמדדו במבחנה. ⁵ מאחר והטיפול האנטי ויראלי שתואר, יעילותו אינה מושלמת, קיים צורך בקיום מודל מתאים בחיות קטנות לשם פיתוח טיפולים אפקטיביים יותר. המחקר החמישי שאציג, (2011, Dorner et al.), מתאר עכבר עם מערכת חיסונית מלאה, אשר מבטא את שני הגנים האנושיים: CD81 ואוקלודין בלבד, מאפשר הדבקה שלו בהפטיטיס C. על מערכת זו נבדקו אפשרויות לחיסון סביל ופעיל. ⁶

אסכם את ממצאי המחקרים, ולאורם, אדון בדרכים לשיפור אפשרויות הטיפול בוירוס ההפטיטיס C.

תוכן
א. תקציר 4
ב. מבוא 5
ג. שיטות 7
1. ניתוח פילוגנטי של NS-5 לסיווג וירוס הפטיטיס C ל-6 גנוטיפים ותת גנוטיפים 7
2. הדבקה ושכפול וירוס הפטיטיס C בתאי תרבית במבחנה 7
הרכבת הגנום והדבקה לתאי תרבית 7
בחינת יכולת שכפול של הגנום שהורכב בתנאי תרבית 7
בדיקות לאישור שהתנהגות HCVcc מתאימה לזה של HVC הטבעי 8
3. אנליזה של הפרופיל הפונקציונאלי של גנום וירוס הפטיטיס C בעזרת החדרת מוטציות 8
יצירת ספריית מוטציות ב- HVC 8
הגדרת פנוטיפ לכל מוטציה לפי השפעת על שכפול הנגיף 10
אימות הפנוטיפים שזוהו בעזרת וירוס מוטציה מדווח 10
4. מנגנון פעילות אנטי ויראלית של מעכב פרוטאז NS3 חדש (Narlaprevir) 10
מאפיינים קינטיים של SCH900518 10
פעילות SCH900518 במערכת רפליקון HCV מגנוטיפ 1b. 10
פעילות SCH900518 בשילוב עם אינטרפרון אלפא 10
אפיון תאים עמידים 11
5. הדבקת עכבר בוירוס הפטיטיס C ובדיקת אפשרויות של חיסון 11
בניית הגנים האנושיים הרלוונטים שיבוטאו בעכבר 11
בניית HVC הרקומביננטי 11
הערכת הדבקת העכבר 11
בדיקת אפשרות של חיסון 11
ד. תוצאות 12
1. ניתוח פילוגנטי של NS-5 לסיווג וירוס הפטיטיס C ל-6 גנוטיפים ותת גנוטיפים 12
2. הדבקה ושכפול וירוס הפטיטיס C בתאי תרבית במבחנה 12
בחינת יכולת שכפול של הגנום שהורכב בתנאי תרבית 12
בדיקות לאישור שהתנהגות HCVcc מתאימה לזה של HVC הטבעי 13
3. אנליזה של הפרופיל הפונקציונאלי של גנום וירוס הפטיטיס C בעזרת החדרת מוטציות 14
זיהוי הפנוטיפ לכל מוטציה לפי השפעת על שכפול הנגיף 14
אפיון הגנום לפי המיקום הספציפי של המוטציה בגנום והשפעתה על שכפול הנגיף 15
אימות הפנוטיפים שזוהו בעזרת וירוס מוטציה מדווח 17
4. מנגנון פעילות אנטי ויראלית של מעכב פרוטאז NS3 חדש (Narlaprevir) 17
מאפיינים קינטיים של SCH900518 17
פעילות SCH900518 במערכת רפליקון HCV מגנוטיפ b1 17
פעילות SCH900518 בשילוב עם אינטרפרון אלפא – 2b 18
אפיון תאים עמידים 18
5. הדבקת עכבר בוירוס הפטיטיס C ובדיקת אפשרויות של חיסון 18
הדבקת עכבר בוירוס הפטיטיס C 18
בדיקת אפשרויות חיסון על העכבר 20
ה. מסקנות ודיון 20
1. ניתוח פילוגנטי של NS-5 לסיווג וירוס הפטיטיס C ל-6 גנוטיפים ותת גנוטיפים 20
2. הדבקה ושכפול וירוס הפטיטיס C בתאי תרבית במבחנה 20
3. מציאת הפרופיל הפונקציונאלי של הגנום של וירוס הפטיטיס C 21
4. מנגנון פעילות אנטי ויראלית של מעכב פרוטאז NS3 חדש (Narlaprevir) 21
5. הדבקת עכבר בוירוס הפטיטיס C ובדיקת אפשרויות של חיסון 21
ו. סיכום 22
ז. ביבליוגרפיה 23