A molecular network of the aging human brain provides insights into the pathology and cognitive decline of Alzheimer’s disease

רשת מולקולארית של המוח האנושי המזדקן מספקת תובנות לגבי הפתולוגיה וההידרדרות הקוגניטיבית של מחלת האלצהיימר

קיים צורך במטרות תרפויטיות חדשות שבאמצעותן ניתן למנוע אלצהיימר (AD), המהווה תורם מרכזי להידרדרות קוגניטיבית הקשורה בגיל. מאמר זה מציג את היצירה והתיקוף של רשת מולקולארית של הקורטקס הקדמי המזדקן. באמצעות ריצוף RAN של 478 אינדיבידואלים, אנו יוצרים ראשית רשת מולקולארית באמצעות מודולים של גנים בביטוי משותף, ולאחר מכן מקשרים רשת זו ל- AD והאנדופנוטיפים הנוירו-פתולוגיים והקוגניטיביים שלה. אנו מאששים אסוציאציות אלו בשני מערכי נתונים בלתי תלויים של AD. בנוסף, נתאר את השימוש ברשת עבור תעדוף של גנים קשורי-עמילואיד וקשורי-קוגניציה עבור תיקוף in vitro בנוירונים ואסטרוציטים אנושיים. ניתוחים אלו, המבוססים על קוהורטים ייחודיים, מאפשרים לנו לזהות את התפקיד של מודולים קורטיקליים ייחודיים המשפיעים ישירות על הצטברות פתולוגיית AD מאלו המשפיעים באופן ישיר על ההידרדרות הקוגניטיבית, ומדגימים גישת רשת למחלות מורכבות.

ההיארעות של אלצהיימר בגיל מאוחר צפויה לשלש עצמה בארצות הברית עד שנת 2050, אך טרם נמצאו טיפולים מתאימים לריפוי או מניעה של המחלה. הסיבות האפשריות לכישלון זה כוללות את המורכבות הביולוגית של המחלה וההטרוגניות הפנוטיפית שלה. מחקרי קשרים כלל גנומיים (GWAS) זיהו מטרות תרפויטיות פוטנציאליות חדשות המעורבות באנדוציטוזיס, מטבוליזם ודלקות. עם זאת, קשה לבצע מעבר מוריאציות רגישות לא-מקודדות למנגנונים מולקולאריים המובילים להצטברות המאפיינת של פתולוגיית β-עמילואיד ופילמנט טאו הליקלי (PHFtau), ולהידרדרות הקוגניטיבית של AD.

מאמר זה מציג ניתוח של משתתפים משני מחקרי אורך קוהורטים של הזדקנות (n = 478), לצד סט תיקוף (n = 82), הכולל אומדן זהיר של התפקוד הקוגניטיבי הקודם למוות והעומס הנוירו-פתולוגי לאחר המוות. אנו משערים כי נתוני ריצוף RNA (RNA-seq) מהקורטקס הקדם-מצחי הדורסלי לטראלי (DLPFC) יאפשרו לנו לזהות מנגנונים תאיים הקשורים בהידרדרות הקוגניטיבית ו/או שינויים נוירו-פתולוגיים. מכיוון שמדידות גנומיות דינאמיות כמו RNA-seq משקפות את ההשפעה הקולקטיבית של תהליכים במעלה הזרם, במורד הזרם ובעלי קורלציה עם מחלות, אנו מיישמים סדרה של גישות מבוססות-רשת המזהות גורמים מפקחים ידועים וסמויים בכדי להעשיר את התוצאות המצביעות על קשרים אפשריים במעלה הזרם.

פרספקטיבה מבוססת-רשת מאפשרת הגדרה מולקולארית מדויקת יותר של מחלות מורכבות בהשוואה לקשרים חד-גנטיים מסורתיים מכיוון שהיא מספקת מסגרת טבעית להרכבת ממצאים חד-גנטיים בתוך מנגנוני המחלה. ניתן להשתמש בנתוני טרנסקריפטום לזיהוי קבוצות של גנים בעלי ביטוי משותף, או מודולים, המייצגים תהליכים תאיים, ולקשרם לפנוטיפים הנחקרים. גישה זו מציעה פרספקטיבה בלתי מפוקחת וספציפית-לרקמות המזהה תוכניות תעתוק הקשורות לפנוטיפים של מחלות, באופן בלתי תלוי בהטיה היסטורית הנובעת מחקר של גנים ונתיבים ספציפיים.

גישות של ביטוי משותף שימשו לזיהוי של גנים הקשורים באבחון סינדרומי של דמנציה של AD. עם זאת, גישות אלו מעולם לא יושמו לגבי קוהורטים גדולים עם מדידות כמותיות של הנוירו-פתולוגיה וההידרדרות הקוגניטיבית של AD. מכיוון שהעומס והקוגניציה הנוירו-פתולוגיים מציגים ביזור חשוב ב- AD, מידול משותף של שני היבטים אלו של המחלה עשוי לשקף באופן טוב יותר את היחסים בין אירועים מולקולאריים לבין שלבים שונים של תהליך המחלה. בנוסף, מחקרים קודמים לא הבדילו בין דפוסי טרנסקריפטום שאינם קשורים ישירות לפנוטיפים של AD דרך רשת של מתווכים, לבין אלו בעלי קשר ישיר. כאן, אנו מסתמכים על מחקרים קודמים בכדי לענות על מגבלות אלו. הגישה שלנו, הנקראת ניתוח רשת גנים של מודול-תכונה (MTN) (איור 1), בונה מודולים של ביטוי גנטי ומזהה את אלו הקשורים ישירות להידרדרות הקוגניטיבית, ותלויים בנוירו-פתולוגיה ושינויי טרנסקריפטום גדולים אחרים במוח המזדקן. אנו מאשרים את הסבירות הביולוגית של ניתוח מערכות ביולוגי זה ב- 5 סוגים אחרים של מערכי נתונים בלתי תלויים. לבסוף, אנו בוחנים את הקשרים המזוהים במודל אנושי בכדי לאפיין פונקציונאלית את התפקיד של גנים נבחרים בהקשר של רמות ה-β-עמילואיד (אנדופנוטיפ מדיד במערכת ניסויית) ובכדי לתעדף מועמדים עבור אומדן נוסף של מטרות תרפויטיות פוטנציאליות.

איור 1: סכמה של הטמעת רשת המודול-תכונה (MTN) לתעדוף מודולים וגנים הקשורים ישירות לתכונות הקשורות ב- AD במחקר זה. a) הקלט של שיטת ה- MTN הוא (i) תכונות AD פתולוגיות של מדידות עמילואיד וטאו, המצטברות על פני מספר רב של אזורים במוח, (ii) שיפוע ההידרדרות הקוגניטיבית לפני המוות, המצטבר על פני מספר רב של מבחנים נוירו-פסיכולוגיים, (iii) הביטוי הממוצע של סטים של גנים בביטוי משותף (מודולים), שזוהו אצל אותם סובייקטים באמצעות אישכול קונצנזוס. b) 3 הקלטים הללו משולבים באמצעות יחסים בלתי תלויים מותנים (דרך רשתות בייסיאניות), לזיהוי יחסים ישירים בקרב המודולים של הביטוי המשותף, תכונות AD וההידרדרות הקוגניטיבית. c) הרלוונטיות למחלה של הגנים הצפויים ביותר נבחנת באופן ניסויי במערכת in vitro של אסטרוציטים ונוירון בהשראת-iPSC.

תוצאות

מקור הנתונים ופנוטיפים

הנתונים נלקחו מסובייקטים המשתתפים במחקר Religious Orders (ROS) או פרויקט Rush Memory and Aging (MAP), שני מחקרי קוהורט פרוספקטיביים קליניים-פתולוגיים לגבי הזדקנות ודמנציה. אף אחד מהמשתתפים לא סבל מדמנציה בעת ההרשמה, וכולם השתתפו באומדנים קליניים שנתיים והסכימו לתרומת מוח. לאחר המוות, כל המוחות עברו אומדן נוירו-פתולוגי כמותי מובנה. שני המחקרים (הנקראים יחד ROSMAP) חולקים סטנדרטים קליניים ונוירו-פתולוגיים, המאפשרים ניתוח משותף של הנתונים. המסלולים האינדיבידואליים של ההידרדרות הקוגניטיבית מחושבים על בסיס מדידות אורך קוגניטיביות הכוללות עד 20 אומדנים שנתיים. עבור מחקר זה, השתמשנו בנתונים של 478 משתתפים, עם גיל מוות ממוצע של 88.7. במהלך המחקר, חלק מהסובייקטים חוו הידרדרות קוגניטיבית, ובעת המוות 32% נותרו ללא נזק קוגניטיבי, 39% אובחנו עם דמנציית AD, ו- 2% אובחנו עם סוג אחר של דמנציה. בנוסף, 58% מסובייקטים אלו אובחנו עם AD פתולוגית. עם זאת, 46% מאינדיבידואלים אלו עם AD פתולוגית היו ללא דמנציה קלינית, ממצא המדגים את הביזור הידוע של אבחון קליני ופתולוגי של דמנציית AD (טבלה 1 בנספחים).

הניתוח שלנו כלל 5 תכונות פנוטיפיות הקשורות ב- AD. 2 מתכונות אלו הן מדידות קליניות: אבחון קליני של דמנציית AD קרוב למוות (AD קלינית), ומדידה רצופה של ההידרדרות הקוגניטיבית במשך הזמן המכומתת כשיפוע של מסלול ההידרדרות הקוגניטיבית על בסיס מודל השפעות מעורבות ליניארי של כל סובייקט. 3 המשתנים הפתולוגיים כוללים מדידה רצופה של צפיפות הסבכים (tangle) של PHFtau ועומס ה–βעמילואיד (שניהם עוברים מיצוע על פני אזורים מרובים) ואבחון בינארי של AD פתולוגית.

בסובייקטים אלו, זיהינו את הקשר הצפוי החזק של הפלוטיפ APOE ε4 עם AD קלינית (P = 5.55 x 10-16, תוך יישום רגרסיה לוגיסטית עבור מידול של מספר האללים ε4 תוך שקלול גיל ומגדר), אך אפילו גורם סיכון גנטי ייחודי זה מסביר רק חלק קטן מהשונות ב- AD קלינית (הסבר של 2.2% מהשונות) או ההידרדרות הקוגניטיבית (הסבר של 5.1% מהשונות). הכללת 21 משתני הרגישות האחרים של AD בכדי לייצג את הארכיטקטורה הגנטית הידועה של AD מסבירה רק 2.1% של AD קלינית ו- 7.6% מההידרדרות הקוגניטיבית. לפיכך, למרות שמשתני רגישות איתנים אלו מספקים תובנות חשובות לגבי גורמי סיכון התורמים ל- AD, הם לוכדים רק מקטע קן ביותר של הביולוגיה של המחלה, שחלק גדול ממנה עשוי להיות מושפע מגורמי סיכון לא-גנטיים. הטרנסקריפטום, בעל האופי הדינאמי המעוצב על ידי חשיפה סביבתית וחוויות החיים, מספק גישה משלימה לזיהוי מטרות תרפויטיות ב- AD.

נתוני ביטוי גנטי של RNA-seq וניתוח קשרים סטנדרטיים

לאחר אומדני בקרת איכות קפדניים, אספנו נתוני RNA-seq מה- DLPFC של 478 משתתפים עבור ניתוח מורד הזרם; בממוצע, 95 מיליון (חציון של 90 מיליון) קריאות קצה זוגיות היו זמינות עבור כל סובייקט. נתוני ה- RNA-seq עברו נורמליזציה בכדי להסביר את ההשפעות של גורמים מפקחים ביולוגיים וטכניים ידועים רבים. גנים בעלי ביטוי נמוך הוסרו בכדי לצמצם את ההשפעה של רעש טכני, מה שהוביל לביטוי מכומת של 13,484 גנים ייחודיים (25,400 תעתיקים).

ראשית, ערכנו מחקר קשרי כלל-טרנסקריפטום סטנדרטי על מנת לזהות גנים בעלי רמות ביטוי הקשורות בפנוטיפים של AD. רמות הביטוי של אלפי גנים הקשורים בתכונות אלו זוהו בקצב גילוי שגוי (FDR) < 0.05 (איור 2a, טבלה 2 בנספחים). השילוב של פנוטיפים קוגניטיביים ופתולוגיים מאפשר לנו לאמוד את ההשפעות היחסיות שלהם על הביטוי הגנטי, ומצאנו כי ההידרדרות הקוגניטיבית הייתה קשורה במספר הגדול ביותר של גנים (3025 גנים ב- FDR < 0.05), בהשוואה לתכונות AD  אחרות. בהתאם לכך, המשתנה הקליני העיקרי של ההידרדרות הקוגניטיבית עשוי להצביע על מנגנונים מולקולאריים נוספים ב- AD, מעבר לאלו שזוהו על ידי המארקרים הנוירו-פתולוגיים של AD. אכן, רוב ההידרדרות הקלינית הקשורה-בגיל אינה מוסברת על ידי המדידות העדכניות של AD או פתולוגיות אחרות הקשורות בגיל. באופן כללי, באמצעות סטטיסטיקת π, הערכנו כי 55-90% מהגנים הקשורים משותפים בין תכונות AD קשורות אלו (איור 2 בנספחים). המספר הגדול של גנים קשורים מדגיש את הצורך לשלב ממצאים אלו לתהליכים ביולוגיים קוהרנטיים הקשורים ישירות לנקודות-קצה ספציפיות הרלוונטיות למחלה.

איור 2: אפיון של נתוני RNA-seq אנושיים קורטיקלים והקשר שלהם לתכונות AD ותהליכים תאיים. a) מספר הגנים שרמות הביטוי שלהם קשורות באופן מובהק לכל אחת מ- 5 תכונות ה- AD שנבחנו (0.05 FDR): PathoAD – AD פתולוגית; ClinAD – AD קלינית; CogDec – הידרדרות קלינית. התוצאות מציגות קשרים ברמת הגנים וברמת התעתוק. b) ההעשרה של כל אחד מ- 47 המודולים של גנים בביטוי משותף עבור גני חתימה ספציפיים-לתא שזוהו בעכברים (ציר y). ציר ה- x מציג את חוזק הקשר בין כל מודול ובין ההידרדרות הקוגניטיבית. הנקודות הגדולות (מודולים) הן אלו המייצגות במידה הרבה ביותר את 4 סוגי תאי המוח העיקריים: נוירונים (m187), מיקרוגלייה (m116), אוליגודנדרוציטים (123), ואסטרוציטים (m107). c) חוזק הקשרים בין כל אחד מ- 47 המודולים (ברים אנכיים) לבין כל אחת מתכונות ה- AD (ציר x). הקו המקווקו מציג את סף מובהקות Bonferroni ברמת המודול (P < 0.001). למען הפשטות, אנו מציגים רק חלק מהמודולים שעברו את הסף. d) החוזק והכיוון של קשר מודול עבור הקשר עם אבחון בינארי של AD פתולוגית במחקר ROSMAP על ציר y. ציר x מציג את חוזק הקשרים בין כל מודול ובין AD פתולוגית במיקרו-מערך של נתונים ממחקרו של ז’אנג. בפרט, המודולים מוגדרים בעזרת דגימות ROSMAP וההגדרות שלהם מוקרנות על הנתונים של ז’אנג. האזור של כל נקודה מייצג את גודל המודול (כלומר, מספר הגנים המוקצים). צבע הנקודות משקף את המובהקות של הקשר בניתוח-מטא של המודולים של ז’אנג ו- ROSMAP. הבוקסות הכתומות מדגישות את המודולים הקשורים באופן מובהק לאבחון של AD פתולוגית במיקרו-מערך של ז’אנג. הבוקסה הירוקה מסמנת את המודולים הקשורים באופן מובהק ל-  AD פתולוגית בנתוני ROSMAP.

בניית הצמתים של רשת המודולים-תכונות

על מנת לזהות תהליכים תאיים קוהרנטיים המשפיעים על הפונטיפים של AD, יישמנו את גישת ה- MTN. מטרת גישה זו היא להרחיב את הקשרים החד-גנטיים לשם הגדרת מנגנונים מולקולאריים איתנים תוך הימנעות ממגבלות הנתיבים הנגזרים ממאגרי נתונים אונטולוגיים. גישת ה-MTN מסכמת שינויי טרנסקריפטום גדולים לתוך מודולים גנטיים ומתעדפת גנים ספציפיים במודול עבור ניסויים נוספים. גישת ה- MTN כוללת 3 שלבים. כפי שיתואר בפירוט בהמשך, ראשית אנו מזהים קבוצות של גנים בעלי ביטוי משותף, או “מודולים”, אותם אנו מתקפים במערכי נתונים אחרים. הסטים של גנים בעלי ביטוי משותף מייצגים את התוצאה של מנגנוני תעתוק רגולטורים הכוללים גורמי תעתוק, אישור כרומטין וגורמים לטנטיים המחוללים קורלציות, כמו השיעור של סוגי תאים שונים הנוכחים בדגימת הרקמה. בשלב השני, אנו קובעים לאלו מודולים יש יחסים ישירים עם ההידרדרות הקוגניטיבית ותכונות AD אחרות באמצעות רשתות בייסיאניות בכדי לנפות קורלציות לא ישירות בין המודולים לבין תכונות AD. בשלב האחרון, אנו בוחרים מודולים בעלי דירוג גבוה ומתעדפים גנים בעלי השפעות ייחודיות בתוך אותו מודול עבור תיקוף במערכות מודלי ה- in vitro שלנו.

בשלב הראשון של ה- MTN, יישמנו את אלגוריתם אישכול הקונצנזוס SpeakEasy על נתוני ה- RNA-seq וזיהינו 47 מודולים אקסקלוסיביים בעלי טווח גדלים של 20-556 חברי גנים (טבלה 3 בנספחים, איור 3 בנספחים). יש לציין כי האישכול שזוהה על ידי האלגוריתם הציג חפיפה משמעותית עם אלו שזוהו על ידי אלגוריתם WGCNA הנפוץ (שיטות וטבלה 4 בנספחים). עם זאת, בחרנו להשתמש ב- SpeakEasy בשל הביצועים המרשימים שלו על מערכי נתונים ממשיים.

אימתנו את הקוהרנטיות הביולוגית של 47 המודולים על בסיס 5 פרספקטיבות: (i) ניתוח העשרה פונקציונאלית של אונטולוגיה גנטית (GO), (ii) קוהרנטיות של המודולים (“שימור”) בעיבוד נפרד של דגימות ROSMAP וקוהורט בלתי תלוי לחלוטין, (iii) התאמה לקו-רגולציה שנצפתה בנתונים אפיגנומיים שנוצרו מאותם מוחות ROSMAP, (iv) התאמה לנתוני ביטוי גנטי של מודלי עכברים מרובים של AD, (v) ביטוי ספציפי לסוג התא. בתיקוף הראשון, מצאנו כי 29 (62%) מהמודולים הועשרו עבור קטגוריה פונקציונאלית אחת לפחות של GO (Bonferroni P < 0.01, טבלה 5 בנספחים), טווה העשרה דומה לזה שזוהה במחקרים אחרים. שנית , בדקנו האם 47 המודולים משתמרים ב- (i) מערך-מיקרו של נתוני DLPFC שפורסם בעבר של 229 אנשים עם AD קלינית ופתולוגית, ו- (ii) נתוני RNA-seq מסט בלתי תלוי של 82 סובייקטים של ROSMAP. באמצעות סטטיסטיקת סיכום-z , המסכמת מדידות מרובות של שימור מודולים, מצאנו ראיות מובהקות של שימור ב- 45 מתוך 47 המודולים במערך-המיקרו הבלתי תלוי ובכל 47 המודולים בסובייקטים הנפרדים של ROSMAP (Bonferroni P < 0.05) (איור 4a בנספחים). שלישית, אמדנו את האיתנות של מודולים אלו מפרספקטיבה של רגולציית תעתוק עם נתונים של אימונופרסיפיטציה וריצוף כרומטין (ChIP-seq) של אצטילציית היסטון H3 Lys9 (H3K9ac) שנוצרו מאותן דגימות DLPFC. סימן ההיסטון H3K9ac נמצא ליד אתרי תחילת תעתוק אקטיביים ומזרזים, ולפיכך יש לצפות לקו-אצטילציה אצל גנים בעלי ביטוי משותף ברמת ה- RNA. בנתונים שלנו, זיהינו קו-אצטילציה ב- 32 מתוך 47 המודולים שהוגדרו באמצעות RNA-seq, ממצא המלמד כי המודולים משקפים, באופן חלקי, את הארכיטקטורה האפיגנומית הבסיסית (איור 4a בנספחים). רביעית, מצאנו בנוסף כי 31% מהמודולים משתמרים באופן מובהק (Bonferroni P < 0.05) בנתוני הביטוי הגנטי שנגזרו מהקורטקס של מספר מודלי עכברים מבוססי-פתולוגיה של AD (איור 4a בנספחים), ממצא שעשוי לסייע לתעדוף התוצאות אותן ניתן להוסיף ולחקור במודלי העכברים. חמישית, מצאנו כי 13 מודולים מעושרים במידה חזקה עבור גנים ספציפיים לסוג התא, כולל אלו מתאי מיקרוגלייה, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים, ושני סוגי משנה עצביים (נוירונים פירמידליים ו- GABA-ארגיים) (איור 2b, טבלה 6 בנספחים) על בסיס אוכלוסיות תאים מטוהרים עצביים ולא-עצביים שנגזרו ממוחות העכברים. לפיכך, חלק מהמודולים לוכדים סטים של גנים ספציפיים-לתא שזוהו בעבר. כל אחד מ- 5 שלבי תיקוף אלו במערכי נתונים מקבילים ואורתוגונאליים מצביע על כך שהחברות הגנטית במודולים אלו היא ברת-שיחזור ומשמעותית מבחינה ביולוגית.

לאחר מכן אמדנו את הקשר בין כל מודול לבין כל תכונה פנוטיפית. בסך הכול, נמצאו 11 מודולים (Bonferroni P < 10-3 לאחר תיקון לרמת המודול) בעלי קשר להידרדרות הקוגניטיבית, דמנציית AD או תכונות פתולוגיות של AD (איור 2c, טבלה 7 בנספחים). בהתאם לתוצאות של הרמה הגנטית, ההידרדרות הקוגניטיבית נמצאה קשורה במספר הגדול ביותר של מודולים. באופן כללי, מודולים שעברו העשרה עבור קטגוריות GO הקשורות באימוניות, מיטוכונדריה, מחזור התא ורגולציית התעתוק הציגו קורלציה חיובית עם β-עמילואיד, AD והידרדרות קוגניטיבית, בעוד שמודולים של תפקוד עצבי או סינפטי הציגו קורלציה שלילית. בכדי לשחזר את הקשרים הפנוטיפים של מודולים אלו, הקרנו אותם על המחקר הגדול ביותר שבחן את המיקרו-מערך של המוח ב- AD (המחקר של ז’אנג). המחקר של ז’אנג מציג רק אבחון מאושר פתולוגית של דמנציית AD, ומצאנו התאמה משמעותית בחוזק ובכיוון של הקשרים המודולים-פתולוגיים ב- AD אותם הגדרנו בסובייקטים של ROSMAP (איור 2d). מצאנו כי קשרי התכונות ברמת המודול היו דומים יותר בין שני מערכי נתונים אלו מאשר קשרי התכונות החד-משתנים ברמת הגנים, ממצא המחזק את היישומיות של גישת רמת המודול (איור  4bבנספחים).

מכיוון שוריאציות אינדיבידואליות בשיעורי סוג התא יכולות להניע דפוסי ביטוי משותף בין גנים, ייתכן ומספר קשרי מודול-תכונה נובעים משינויים בשיעurי סוג התא המתרחשים במהלך המחלה (איורים 5a, b בנספחים). חשוב לציין, כפי שנתאר בהמשך, כי הזיהוי של “מודולים ספציפיים לסוג התא” אפשר לנו להכווין תיקוף פונקציונאלי ולערוך מידול מקיף של שינויים בהרכב סוג התא העשויים להניע שינויי תעתוק גדולים ב- AD ברמת הרקמות.

זיהוי מודולים הקשורים במחלה ברשתות של המוח האנושי המזדקן

בכדי להפריד מספר קטן של קשרי מודול-תכונה מהמספר הגדול יותר של קורלציות מודול-תכונה עקיפות, יישמנו היסק של רשת בייסיאנית. רשת בייסיאנית יוצרת מודל של ההסתברויות המשותפות של סט של משתנים אקראיים בתור גרף אציקלי מוכוון. כאן, המשתנים האקראיים מייצגים רמות ביטוי מודולים וערכי תכונות אצל כלל האינדיבידואלים. הגבולות ברשת הבייסיאנית מייצגים תלות מותנית ישירה בין שני משתנים: חץ מ- X ל- Y ברשת הבייסיאנית מלמד כי ערך הנלקח ממשתנה Y תלוי בערך הנלקח ממשתנה X, ומותנה בכל המשתנים האחרים ברשת (ראה שיטות).

על מנת להגביל את גודל הרשת עבור היסק מדויק יותר, כללנו רק מודולים הקשורים באחת משלושת התכונות העיקריות של AD (עומס β-עמילואיד, צפיפות סבכי tau, והידרדרות קוגניטיבית). כללנו בנוסף 4 מודולים המייצגים את השיעורים של 4 סוגי תאי מוח עיקריים – מיקרוגלייה, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ונוירונים – בכדי להסביר את השפעות השינויים בתדירויות אוכלוסיית התאים. לסיכום, הרשת הבייסיאנית שנוצרה כללה 18 צמתים: 11 צמתים המייצגים מודולים הקשורים בתכונות, 3 צמתי תכונות, ו- 4 מודולים של סוגי תא (איור 3a).

מודול 109 (m109) היה המודול שהציג את הקשר החזק ביותר עם ההידרדרות הקוגניטיבית, באופן מותנה בכל שאר המודולים בעלי הקורלציה ומודולים המייצגים שיעורי סוג תא (איור 3a). המודול כלל 390 גנים עם שלל פונקציות. הפונקציות הבולטות המועשרות במודול זה קשורות ברגולציה של מחזור התא ומודיפיקציה של כרומטין (טבלה 5 בנספחים). הקשר של m109 להידרדרות הקוגניטיבית שוחזר בעיבוד הנפרד של 82 הסובייקטים של ROSMAP ( P = 0.006).

הקשר בין המודולים שנגזרו מ- RNA לארכיטקטורה הגנטית של AD

להפלוטיפ APOE ε3 יש תפקיד ייחודי במחלה, בהתחשב בגודל האפקט המשמעותי שלו (OR > 3 עבור עותק אחד של הפלוטיפ APOE ε4) והתדירות המשמעותית באוכלוסיות אנושיות. לפיכך, אמדנו את ההשפעה שלו על m109 ומצאנו כי ל- APOE ε4 יש קשר מתון עם ביטוי גבוה של m109 (P = 0.03 נומינאלי, מבחן ווילקוקסון, איור 6 בנספחים), ממצא עקבי לקשרים הידועים של הפלוטיפ זה עם ההצטברות של פתולוגיית β-עמילואיד והידרדרות קוגניטיבית. בניתוח קשר מותנה, לאחר שקלול ההפלוטיפ APOE ε4, ה- m109 הוסיף להציג קשר חזק עם AD פתולוגית (גודל האפקט פחת ב- 13%, P = 0.0027 לאחר התאמה) ועם ההידרדרות הקוגניטיבית (גודל האפקט פחת ב- 7.4%, P = 5.03 x 10-10 לאחר התאמה), ממצא המלמד כי ההשפעה של m109 הינה בלתי תלויה ברובה בהפלוטיפ רגישות זה. הרחבנו את הניתוח הגנטי של m109 לוריאציות נפוצות אחרות של רגישות AD, אשר הציגו במחקרים קודמים קשר מועט בלבד או היעדר קשר לתכונות הנוירו-פתולוגיות של AD. 21 הוריאציות הנפוצות של AD לא הציגו קשר עם m109 בניתוח trans-eQTL (ביטוי כמותי של מיקום תכונות), ממצא עקבי לדלילות הנצפית של קשרי trans (trans-eQTLs) שדווחו במחקרים עם דגימות גדולות יותר.

בדקנו בנוסף האם המודולים מועשרים עבור גנים הנמצאים בקרבת וריאציות ה- AD (הגנים הקרובים ביותר) ומצאנו מודול מועשר אחד, m116 (P = 0.0018, אלגוריתם INRICH), המכיל בעיקר גנים מיקרוגליאלים (טבלה 6 בנספחים). עם זאת, לא נמצא קשר ישיר בין m116 לבין ההידרדרות הקוגניטיבית, פתולוגיית AD או דמנציית AD במערך נתונים זה (טבלה 7 בנספחים). לעומת זאת, נמצא קשר בינו לבין הגיל (P = 0.003), ממצא המדגיש את התפקיד החשוב של ההזדקנות ברגישות של AD והעובדה כי מחקרי AD GWAS מיישמים אבחון קליני של AD וסובייקטים צעירים של בקרה בכדי לקבל דגימות גדולות במיוחד.

לבסוף, עבור השלמות, בחנו את הקשר בין 21 האללים הנפוצים של רגישות AD לבין המודולים (כלומר, ניתוח מודול-QTL) ולא מצאנו קשרים מובהקים לאחר מספר תיקונים, ממצא עקבי להבחנה הקודמת לפיה אללי רגישות אלו הינם גורמי סיכון איתנים, אך הם לוכדים מקטע קטן בלבד מהשונות בתכונות AD אלו.

איור 3: מודל רשת ה- AD מתעדף m109 כבעל קשר ישיר להידרדרות הקוגניטיבית. a) גרף אציקלי מוכוון, שהושג באמצעות למידת רשת בייסיאנית, מייצג את היחסים בין המודולים (עיגולים), מארקרים של סוג התא (ריבועים), ו- 3 תכונות AD רלוונטיות (β-עמילואיד, סבכי טאו והידרדרות קוגניטיבית; יהלומים). עובי החץ הוא פרופורציונאלי למספר הפעמים שבו זוהה קשר. צבע המודולים קשור לתיווי באמצעות מאגר GO. b) מסלולי ההידרדרות הקוגניטיבית עבור אנשים עם רמות נמוכות (ימין) או גבוהות (שמאל) של ביטוי m109. משמאל: קווים מקוטעים כחולים מציגים את ציוני הקוגניציה הגלובאליים השנתיים של 50 משתתפים אקראיים עם רמה נמוכה של ביטוי m109 (רבעון ראשון) בכדי להמחיש את האופי של הנתונים הקוגניטיביים האורכיים; הקו השחור הרצוף מציג את המסלול של ההידרדרות הקוגניטיבית עבור משתתפת אופיינית בת 85 בעת המוות, עם 15 שנות השכלה ורמת ביטוי ממוצעת אצל הקבוצה (האחוזון ה- 10 בקירוב של ביטוי m109). מימין: plots אדומים מציגים את ציוני הקוגניציה הגלובליים השנתיים של 50 משתתפים אקראיים עם ביטוי גבוה (רביעון רביעי); הקו השחור מסמן את המסלול הקוגניטיבי מבוסס-המודל עבור משתתפת אופיינית בת 85 עם 15 שנות השכלה ורמת ביטוי ממוצעת אצל הקבוצה (אחוזון 90 בקירוב). c) ביטוי m109 (ביטוי ממוצע של גנים שהוקצו ל- m109) עבור אינדיבידואלים ללא כל ליקוי קוגניטיבי (NCI, אדום); ליקוי קוגניטיבי מתון (MCI, ירוק); או אבחון AD (כחול(. כל נקודה מייצגת אדם אחד. d) ביטוי m109 עבור אינדיבידואלים ללא (אדום) ועם (טורקיז) עמילואיד בניתוח לאחר המוות. כל נקודה מייצגת אדם אחד. ה- plot של הבוקסה מציג את החציון ואת האחוזונים ה- 25 ו- 75 של ההתפלגות; זיפים מסמנים פי 1.5 של הטווח הבין-רבעוני.

תעדוף גנים במודול m109 ובחינת ההשפעה שלהם על רמות ה-β-עמילואיד החוץ-תאיות

בשל הקשר הישיר החזק של m109 להידרדרות הקוגניטיבית (P < 10-9) (איורים 3b, 3c) בחרנו למקד את האומדנים הפונקציונאליים שלנו במודול זה. בנוסף להידרדרות הקוגניטיבית, m109 קשור בפתולוגיית β-עמילואיד (P < 0.0001) (איורים 3a,d וטבלה 7 בנספחים), אך יש לציין כי ניתוח הקשרים המותנים הראה כי ההשפעה של m109 על ההידרדרות הקוגניטיבית אינו מתווך באופן מלא על ידי ההצטברות של β-עמילואיד. כלומר, m109 משפיע על ההידרדרות הקוגניטיבית הן דרך β-עמילואיד והן דרך תהליכים לא-β-עמילואידיים. בשל היעדר מודל תאי של הידרדרות קוגניטיבית, מיקדנו את מאמצי התיקוף שלנו בקשר של m109 עם העומס של β-עמילואיד. בכדי לתעדף גנים ב- m109 עבור תיקוף פונקציונאלי, יישמנו מספר קריטריונים: קישוריות הרשת הגנטית (איורים 4a,d וטבלה 8 בנספחים), רמות ביטוי מספקות בתרביות אסטרוציטים אנושיות ו/או נוירונים אנושיים (שתי המערכות הניסוייות שלנו), הגודל של הקשר עם שלושת הפנוטיפים הקשורים ב- AD ברמה הגנטית, והידע הקיים לגבי תפקוד הגנים. זיהינו 21 גנים ב- m109 שענו על קריטריונים אלו שנבחרו עבור ניסויי גירוי (perturbation). עבור 21 הגנים הנבחרים, בחנו ממוצע של 5 קונסטרוקטים של short hairpin RNA   המתמקדים בכל גן נבחר, עבור ה-knockdown של ביטוי הגנים (טבלה 9 בנספחים). בכדי להיכלל בסינון הפונקציונאלי שלנו, הגנים היו חייבים להציג לפחות שני קונסטרוקטים של shRNA העונים על קריטריוני יעילות ה- knockdown שלנו של > 50% הפחתה בביטוי בסוג תא המטרה. 12 גנים (עם  37 קונסטרוקטים של shRNA) ענו על קריטריונים אלו בנוירונים ו- 14 גנים (עם 41 קונסטרוקטים של shRNA) ענו על קריטריונים אלו באסטרוציטים; 11 גנים נבחנו בשני סוגי התא (טבלה 10 בנספחים).

ערכנו 78 ניסויי shRNA בכדי לבצע knockdown של 14 הגנים הנבחרים באסטרוציטים ו- 12 הגנים בנוירונים. באמצעות ניבויי knockdown אלו, מדדנו את הרמות החוץ-אתיות של פפטיד Aβ42 β-עמילואיד הפתוגני, שניתן לערוך עליו ניסויי in vitro וקשור ללזיה הפתולוגית העיקרית ב- AD. מדדנו אותו בתווך מותנה מתרביות אסטרוציטים ראשיות לצד תרביות עצביות נגזרות-תאי גזע (iPSC) פלוריפוטנטיות לאחר גירוי התאים. ניסויים אלו כללו 3 סוגים של בקרה שלילית, כוללים ווקטורים ריקים ווקטורים המכילים GFP בלבד. מכיוון ש- m109 מציג קורלציה חיובית עם עומס ה-β-עמילואיד (טבלה 7 בנספחים), גישת ה- MTN צופה כי knockdown של הביטוי יוביל לירידה ברמות של β-עמילואיד.

תוך יישום מודל ANOVA הכולל בחינת קונסטרוקטים מרובים בכל גן, אמדנו את ההשפעה של כל קונסטרוקט shRNA על רמות ה- Aβ41 החוץ-תאיות בהנגדה לבקרות השליליות. מדידה זו לא השתנתה בנוירונים. בניגוד לכך, זיהינו שני קונסטרוקטים של shRNA המתמקדים בגנים שונים, INPPL1 ו- PLXNB1, שחרגו מסף המובהקות של Bonferroni (P < 0.0012) באסטרוציטים (איור 5a וטבלה 11 בנספחים) בסינון הזיהוי שלנו. שני קונסטרוקטים נוספים של גנים אלו הציגו סף מרמז (P < 0.024, שנקבע בתור ההדדיות של מספר הניסויים). באופן בולט, שני גנים אלו צפויים להיות במעלה הזרם של שאר הגנים בניסוי במודל הרשת הבייסיאנית (איור 4a), קשורים זה לזה ישירות ומהווים את שני ה- hubs העיקריים ברשת הביטוי המשותף של m109.

בכדי לשחזר ממצאים אלו, חזרנו על ניסויי הגירוי, והפעם כללנו 4 קונסטרוקטים של shRNA עבור INPPL1 ו- 3 קונסטרוקטים של shRNA עבור PLXNB1, לצד מספר בקרות חיוביות ושליליות. בפרט, בתור בקרה חיובית, כללנו קונסטרוקטים של shRNA המתמקדים ב- APP, חלבון האב של פפטיד Aβ42. בניסויים אלו, knockdown של שני הגנים הוביל להפחתה ברמות החוץ-תאיות של Aβ42 בתרביות האסטרוציטים (PINPPL1 = 2 x 10-4 ו- PPLXNB1 = 9 x 10-6). בסך הכול, תוצאות אלו הינן עקביות לכיוון של הקשר של m109, לפיו ביטוי גבוה יותר של m109 נלווה לעומס גדול יותר של β-עמילואיד. ביצענו בנוסף הכתמת-אימונו של הקורטקס הקדמי אצל סובייקטים עם AD פתולוגית ומצאנו כי גם INPPL1 וגם PLXNB1 התבטאו ברמת החלבון באסטרוציטים (איור 5c), ממצא המאשר כי שני גנים אלו התבטאו in vivo בסוג התא האנושי ששימש בניסויי התיקוף. האסטרוציטים המבטאים שני גנים אלו נמצאים ליד מצבורי ה-β-עמילואיד. גנים אלו מתבטאים בנוסף בסוגי תאים אחרים, כמו נוירונים, ואין לשלול את האפשרות כי הם מעורבים ביותר מסוג תא אחד ב- AD.

לאחר שאימתנו פונקציונאלית את התפקיד של שני גני m019 אלו באפנון הרמות החוץ-תאיות של Aβ42 פתוגני in vitro, חזרנו לנתוני התעתוק שלנו בכדי לאמוד את הגודל של ההשפעה של INPPL1 ו- PLXNB1 על עומס ה-β-עמילואיד. באופן נפרד, כל אחד מהם אחראי לשיעור קטן של השונות בעומס ה-β-עמילואיד – 2.8% עבור INPPL1 ו- 3.1% עבור PLXNB1 – וכפי שצופה מודל הרשת שלנו, הם יתירים במידה רבה, ויחד הם מסבירים 3.1% מהשונות (R2 מותאם) של עומס ה-β-עמילואיד (איור 5d). ממצא זה הינו בר-השוואה ל- < 1% מהשונות של תכונה זו המוסברת על ידי פולימורפיות נוקליאוטיד בודד תקפה של AD מלבד אלו ב- APOE. לדוגמא, אלל הרגישות CR1 מסביר 0.39% מהשונות בעומס ה-β-עמילואיד בנתונים שלנו. ההשפעה של INPPL1 ו- PLXNB1 הייתה חזקה יותר במידת מה על ההידרדרות הקוגניטיבית; 5.5% מהשונות מוסבר על ידי INPPL1, 4.4% על ידי PLXNB1 ו- 5.4% (R2 מותאם) על ידי שניהם. באופן כללי יותר, אמדנו את המידה שבה שני גנים אלו לוכדים את ההשפעה של כל המודול. המטא-תכונה של m109 מסבירה 4.3% מהשונות בעומס ה-β-עמילואיד ו- 8.5% מהשונות בהידרדרות הקוגניטיבית, ולאחר שקלול INPPL1 ו- PLXNB1, ניתן לראות כי חלק מההשפעה של m109 נותר עבור β-עמילואיד (0.95% מהשונות, P = 0.029) ומשתמר חלק גדול יותר מההשפעה על ההידרדרות הקוגניטיבית (3.5% מהשונות, P = 2.7 x 10-5). לפיכך, בעוד ש- INPPL1 ו- PLXNB1 הם חשובים ב- m109, הם אינם מסבירים את ההשפעות של כל המודול, ממצא המלמד כי יש לערוך תיקופים נוספים על מנת לזהות גנים מניעים נוספים עבור m109 וכי קרוב לוודאי שהם יושפעו מתהליכים לא-β-עמילואידים.

איור 4: זיהוי גנים ספציפיים בתוך m109 עבור מעקב ניסויי. a) הרשת הרגולטורית המוערכת של הגנים (רשת בייסיאנית) עבור 112 גנים נבחרים ב- m109. כל גן מהווה צומת (עיגול) בגרף. צמתים צבעוניים הם אלו שנבדקו במערכות הניסוי שלנו (צהוב: נבחנו גם באסטרוציטים וגם בנוירונים נגזרי-iPSC, כחול: נבחנו רק באסטרוציטים, כתום: נבחנו רק בנוירונים נגזרי-iPSC). האזור של כל צומת הוא פרופורציונאלי לרמת הצומת שלו (המספר הכולל של גבולות נכנסים ויוצאים בכל צומת). b) ערכי הביטוי המשותף של 112 הגנים המוצגים באיור 3a, המדגישים את התת-מבנה בתוך דפוס הביטוי המשותף של m109. מסומנים הגנים שנבחנו במערכת הניסוי שלנו; ניתן למצוא אותם בכל קבוצת משנה של מטריצת הקורלציה.

איור 5: knockdown של INPPL1 ו- PLXNB1 באסטרוציטים אנושיים מנמיך באופן מובהק את Aβ42. אסטרוציטים אנושיים או נוירונים נגזרי-iPSC עברו טרנסדוקציה עם לנטיוירוס המקדד קונסטרוקט shRNA המתמקד באחד מגני m109 הנבחרים. רמות ה- Aβ42 נמדדו על ידי ELISA בתווך המותנה מתרביות מטרה מוצלחות. a) volcano plot המסכם את התוצאות של סינון הזיהוי שבו נערכו ניסויי knockdown על האסטרוציטים (נקודות אדומות) ונוירונים נגזרי-iPSC (נקודות שחורות). כל נקודה מייצגת קונסטרוקט אחד, כשגודל האפקט על הפרשת ה- Aβ42 מדווח על ציר x והמובהקות הסטטיסטית של השפעת הקונסטרוקט על ציר y. קווים מקווקווים מסמנים את הספים של תוצאות מובהקות (לאחר תיקון Bonferroni) ומרומזות (חיובי כוזב אחד בניסוי) בניסויי האסטרוציטים. b) מחקר השחזור: תוצאות ה- knockdown של INPPL1 ו- PLXNB1 על הפרשת ה- Aβ42 נמדדו בניסויים נוספים באמצעות קונסטרוקטים של shRAN המתמקדים בכל אחד מגנים אלו. ה- knockdown של APP, המפיק את פפטיד Aβ42, בוצע במקביל עבור השוואה. כל נקודה מייצגת ניסוי בודד של כל קונסטרוקט, והרמה הממוצעת של הפרשת Aβ42 עבור המקרים של אומדן קונסטרוקט ספציפי מוצגים בבר רצוף עם אינטרוול ביטחון של 95%. הקו המקווקו מסמן את רמת ההפרשה הממוצעת בכל ניסויי הבקרה. c) הכתמת-אימונו של INPPL1 ו- PLXNB1 בוצעה על חלק מה- DLPFC מניתוח מוח לאחר המוות של סובייקט עם AD. תיוג משותף של ALDH1 (מארקר ספציפי של אסטרוציטים קורטיקלים) נצפה בקבוצת משנה של תאים המתויגים עבור INPPL1 או PLXNB1. קנה מידה, 100 μm. d) שיעור השונות בהידרדרות הקוגניטיבית המוסבר על ידי גורמים שונים. השורה הראשונה (כתום) מציגה את שיעור השונות המוסבר (PVE) על ידי מדידות של פתולוגיית טאו ועמילואידים הנלכדות על ידי הבחינה המובנית לאחר המוות של כל סובייקט. השורה השנייה מציגה PVE שבו אנו משתמשים בכל 47 המודולים בנוסף לפתולוגיה: נתוני RNA מסבירים כמות גדולה יותר של השונות בהידרדרות הקוגניטיבית מאשר זו הנלכדת על ידי שתי המדידות העיקריות של פתולוגיית AD. השורה השלישית מציגה PVE על ידי מודול ה- m109 בלבד (עמילואיד וטאו). לבסוף, 3 השורות הבאות מציגות PVE על ידי INPPL1 ו- PLXNB1, יחד וכל אחד לחוד. כפי שניתן לראות, PLXNB1 ו- INPPL1 לוכדים כמות גדולה אך לא את כל ההשפעה של m109, והם יתירים במידה רבה זה עם זה.

דיון

יישמנו את ה- MTN, גישה מבוססת-רשת, לזיהוי תהליכים ביולוגיים קוהרנטיים וגנים ספציפיים הקשורים במספר רב של תכונות הרלוונטיות ל- AD. אחד המאפיינים העיקריים של גישתנו הוא זיהוי יחסים מולקולאריים-פתולוגיים-קליניים ישירים וייחודיים, האמורים להפחית את המאמצים המתבזבזים על אסוציאציות מפוזרות ואסוציאציות עקיפות של המחלה. בנוסף, יישמנו את MTN על קוהורט הכולל מדידות של שינויים בקוגניציה על פני זמן, התוצאה הקלינית הרלוונטית ביותר של ניסויי AD קליניים עבור AD פרודרומלית לצד נזק קוגניטיבי קל הנובע מ- AD ודמנציית AD. המסגרת והנתונים אפשרו לנו לזהות תהליכים תאיים בקורטקס האנושי הקשורים ישירות להידרדרות הקוגניטיבית, באופן נפרד מהגנים המשפיעים ישירות על ההצטברות של פתולוגיית AD. תהליכים אלו הם שונים ומשלימים את אלו שזוהו על ידי גנים נגזרי-GWAS, מכיוון שההשפעה של פולימורפיות נוקליאוטיד בודד נגזרת-GWAS על ביטוי הגנים במקרה זה הייתה מוגבלת.

הממצא העיקרי של פרויקט זה הוא קיומו של סט איתן של גנים המתבטאים במשותף, הנתמך על ידי מספר רב של מערכי נתונים אחרים, הקשור גם לעומס β-עמילואיד וגם לשיפוע של ההידרדרות הקוגניטיבית אצל אנשים מבוגרים. מכיוון שמידול ההידרדרות הקוגניטיבית in vitro הינו קשה, חקרנו את היחסים של קבוצת משנה של גנים אותם צפינו כי ישפיעו על ביולוגיית ה-β-עמילואיד בתוך m109. שנים מגנים אלו, INPPL1 ו- PLXNB1, הציגו יחסים עם רמות ה-β-עמילואיד החוץ-תאיות בתרביות אסטרוציטים, תוצאה ראשונית מעניינת הדורשת חקר נוסף. יש לציין כי המסקנות הכוללות של מחקר זה הן חזקות ביותר ברמה המערכתית וכי דרושים ניסויי in vitro וסלקציה קפדנית של מודלים נוספים בכדי לבחון את המבנה הרגולטורי של מערכת זו, באופן כולל.

ה- PLXNB1 הינו חבר במשפחת חלבונים המתווכת את איתות הסמפורין, הממלא תפקיד בתהליכים עצביים כולל צמיחת נויריטים, מידול מחדש ופלסטיות סינפטית. עם זאת, קיים מידע מועט בלבד לגבי התרומה הפוטנציאלית שלו להידרדרות הקוגניטיבית ו- AD. ה- INPPL1, הידוע גם בתור SHIP2, הינו פוספטאז ליפיד המווסת את הרמות של השליח השניוני החשוב פוספטידילינוסיטול-3,4,5-טריספוספאט. הרמות של שליח שניוני זה מווסתות את נתיבי איתות AKT ו- GSK3β במורד הזרם, כאשר AKT הינו בנוסף חבר במודול m109. ה- INPPL1 הינו חלק חשוב באיתות אינסולין, ופולימורפיות בגן INPPL1 נמצאה קשורה בסוכרת מסוג 2. עכברים טרנסגניים בעלי ביטוי-יתר של INPPL1 מציגים הפרעות באיתות של גורם גדילה 1 של אינסולין ודמוי-אינסולין (IGF1) המתווך על ידי AKT בתרביות נוירונים, ועכברים אלו מציגים בנוסף ליקויים בזיכרון. בנוסף, יישום של מעכב INPPL1 במודל סוכרת של עכברים הצליח להשיב את הפלסטיות הסינפטית וליקויי הזיכרון שנצפו במודל זה. למרות שמחקרים אלו מתמקדים בנוירונים ולא באסטרוציטים עליהם מצביע מחקר ה- shRAN שלנו, הם מצליחים להרחיב את התמונה לגבי האופן שבו INPPL1 ממלא תפקיד בעל היבטים רבים ב- AD.

במחקר קודם, מצאנו ראיות לתגובה מופחתת ל- IGF1 אצל מוחות של אנשים עם ליקויים קוגניטיביים מתונים ודנמציית AD בהשוואה לבקרה, ללא קשר לסטאטוס של הסוכרת. בפרט, הרמות של הצורות המותאמות של רצפטור IGF1 לאחר התרגום הציגו קשר חיובי ל-β-עמילואיד וקשר שלילי לזיכרון עבודה וזיכרון אפיזודי, לאחר התאמה לפתולוגיית AD. בהתאם לממצאים אלו, מחקר זה מספק ראיות לכך שגן INPPL1 ממלא תפקיד בהידרדרות הקוגניטיבית והצטברות β-עמילואיד, ומציע אפשרויות חדשות לחקר היחסים בין פוספואינוזיטידים, איתות אינסולין ו- AD.

חשוב בנוסף לציין את המגבלות של גישתנו. ראשית, אומדן ה- FPR של MTN או שיטות דומות אחרות דורש ניסויים בסט גדול של מטרות null צפויות, אפשרות יקרה מדי בשלב זה. בנוסף, מסגרת ה- MTN מגבירה את דיוק הרשת על ידי מידול רשתות בשתי רזולוציות (רשת מודול-תכונה בזום-אאוט ורשת גנים בזום-אין בתוך מודולים נבחרים), אך המחיר של דיוק זה הוא הכללת רק קבוצת משנה של מודולים בתהליך ההיסק, מה שמוביל לאובדן של מידע. בנוסף, אחת המגבלות הביולוגיות העיקריות היא סינון פונקציונאלי של גני m109 עבור השפעות על רמות ה-β-עמילואיד החוץ-תאיות in vitro, כאשר ההשפעות החזקות ביותר שלהם היו על התפקוד הקוגניטיבי. לפיכך, מחקר זה בוחן רק חלק מהפונקציות של m109.

לסיכום, השלמנו את הקשת הראשונית של זיהוי ותיקוף הרשתות המולקולאריות, והצגנו את השימוש ברשת בתעדוף המודול m109, וקבוצת משנה של גנים הנכללים בו עבור אומדן פונקציונאלי. ה- INPPL1 ו- PLXNB1 הינם מועמדים פוטנציאליים אותם קישרנו לביולוגיה של העמילואיד in vitro וכעת נדרש חקר נוסף בכדי לאמוד את הפוטנציאל שלהם כמטרות תרפויטיות של AD. מחקר זה מהווה אם כך שרטוט ראשוני עבור גישת מערכות כמותיות לחקר של הפתו-ביולוגיה והתפקוד של המוח האנושי המזדקן.