Ageing Changes in the Tensile Properties of Tendons Influence of Collagen Fibril Volume Fraction

שינויי הזדקנות בתכונות המתיחה של הגידים: ההשפעות של מקטע הנפח של פיבריל קולגן

רקמות חיבור הן תרכובות ביולוגיות הכוללות פיבריל קולגן המוטמעים בתוך ג’ל מועשר-פרוטאוגליקן (PG) בתוך המטריצות החוץ-תאיות (ECMs). שינויי הזדקנות בתכונות המכאניות של הרקמות נמצאו קשורים בשינויים במבנה של ECMs, כלומר, קוטר הפיבריל. עם זאת, הניסיונות לכמת את הקשר בין קוטר הפיבריל לבין התכונות המכאניות הניבו ראיות שנויות במחלוקת. מאמר זה מתאר גישה חדשנית המבוססת על חוק התערובות (rule of mixtures) עבור תרכובות סיבים בכדי לאמוד את התלות של שינויים קשורי-גיל בכוח המתיחה של הגידים (σ) וקשיחות (E) על מקטע אזור חתך-הרוחב של פיבריל קולגן (p), הקשור במקטע הנפח של הפיבריל. גידי זנב של עכברי C57BL6 בגילאי 1.6-35.3 חודשים נמתחו עד נקודת הכשל בכדי לקבוע את σ או E. מדידות מקבילות של p כפונקציה של גיל נערכו בעזרת מיקרוסקופ מעבר אלקטרון. מודלים מתמטיים (חוק התערובות) של פיברילים המחזקים ג’ל PG בגידים יושמו בכדי לבדוק את ההשפעה של p על שינויי הזדקנות ב- σ וב- E. הגודל של σ, E ו- p עלה במהירות מ- 1.6 חודשים עד 4.0 חודשים (P-value < 0.05) לפני שהגיע לקבוע (תלוי גיל) מ- 4.0 חודשים עד 29.0 חודשים (P-value < 0.05). מגמה זו המשיכה עבור E ו- p (P-value < 0.05) מ- 29.0 חודשים עד 35.3 חודשים, אך לא עבור σ, שפחת בהדרגה (P-value < 0.05). ניתוח רגרסיה ליניארית הראה כי שינויים קשורי-גיל ב-σ ו- E הם בעלי קורלציה חיובית ל- p (P-value < 0.05). מקטע אזור חתך הרוחב של פיבריל קולגן (p) הינו פרדיקטור מובהק של שינויי הזדקנות ב-  σ ו- E בגידי הזנב של עכברי C57BL6.

1. מבוא

שינויי הזדקנות בתכונות המכאניות של רקמות חיבור נמצאו קשורים בשינויים במבנה של המטריצה החוץ תאית (ECM), כלומר, קוטר הפיבריל. הניסיונות העדכניים להסביר את היחסים בין מבנה הפיבריל קולגן בתוך הרקמה לבין התכונות המכאניות של הרקמה מבוססים על ניתוח איכותני. קוטרי פיבריל גדולים, הנצפים בגידים לצד ההזדקנות, עשויים להיות קשורים בעלייה בצפיפות של קשרי-רוחב קוולנטיים תוך-פיבריליים ועשויים להשפיע על היכולת להתנגד לעומס גידי. מצד שני, קוטרים קטנים עשויים להשפיע על היכולת להתנגד ל- creep מכיוון שהקוטר המופחת עשוי להגדיל את שטח הפנים לכל יחידת מאסה של הפיברילים ולהגדיל את הצפיפות של קשרי-רוחב לא-קוולנטיים בין הפיברילים לבין רכיבי ה- ECM. הסברים אלו מבוססים על קונספטים של חומרים הנדסיים (הרכב סיבים); מאמר זה מציג תיאוריות לגבי המיקרו-מכאניקה של הסיבים, המתארות כיצד סיבים מספקים חיזוק לחומרים תחת עומסים הקשורים בהעברת מאמץ (stress) אלסטית ופלסטית, תוך יישום מודלים של shear-lag ו- shear-sliding, בהתאמה.

לא קיימות ראיות ברורות המדגימות את הקורלציה של השינויים קשורי-הגיל בתכונות המכאניות של הרקמות לקוטר הפיבריל. ברקמות רבות, היסטוגרמות של התפלגות קוטר הפיבריל מראות פיזור ערכים שתוארו במחקרים באופן איכותני בתור חד-מודאליים או דו-מודאליים, בהתחשב בגיל ובסוג הרקמה. מלבד הפיזור הצר של קוטר הפיבריל הנצפה ברקמה עוברית, טווח הקוטרים גדל מהילדות עד הבגרות. היעדר הסדירות של חתכי-הרוחב של הפיבריל עולה גם הוא עם הגיל, ומצב זה מיוחס להיתוך פיבריל-פיבריל. במובן זה, הפרמטר של הקוטר יכול לספק רק תיאור חלקי של המבנה. לפיכך, טיבו של חתך-הרוחב של הפיבריל פירושו כי הקורלציה בין התכונות הטנסיליות לבין קוטרי הפיבריל הינה מורכבת ולא לניתן לנבא אותה באופן אמין באמצעות ניתוח סטטיסטי.

קיימות ראיות לכך ש- p קשור באופן מובהק לתכונות הטנסיליות של רקמות, כמו גידים וצוואר הרחם. בבסיס יחסים אלו עומד קונספט המבוסס על חוק התערובות של תרכובות סיבים. חוק התערובות מתייחס למערכת דו-פאזה שבה פאזה אחת הינה פאזה המחזקת את הפאזה האחרת כאשר המערכת מתמודדת עם עומס חיצוני. רקמות חיבור הן תרכובות ביולוגיות הכוללות פיבריל קולגן המוטמעים (ומחזקים) בג’ל PG בתוך ה- ECMs. לפי החוק, התכונות המבניות של ה- ECMs, כמו מקטע הנפח של פיבריל קולגן (β), עשויות להיות קשורות לקשיחות הטנסילית E והחוזק σ. נובע מכך כי p הינו אנלוגי ל- β. בעוד שהקורלציה הודגמה על גידים מזנבות של עכברים בני 0.7 חודשים ו- 1.9 חודשים, לא ברור כיצד היא רלוונטית לגידים זקנים יותר. מאמר זה מתאר ניסיון לאמוד את התלות של שינויי הזדקנות ב- σ ו –E על p על סמך חוק התערובות עבור תרכובות סיבים, תוך שימוש בגידי זנב של עכברי C57BL6 צעירים ומבוגרים. ההשערה היא כי β (או p) מהווה השפעה משמעותית על σ ו- E. בכדי לבחון את ההשערה, יישמנו רגרסיה ליניארית. מחקרים קודמים הוכיחו את התוקף של שימוש בגידי זנב עבור חקר של השפעות הזדקנות על תכונות טנסיליות.

טבלה 1: מספר עכברי ה- C57BL6 שנבדקו בכל נקודת גיל (N), p, σ ו- E ממוצעים עבור 8 קבוצות הגיל שנבדקו במחקר. הגדלים של p, σ ו- E מוצגים כערכים ממוצעים (עם SE).

2. חומרים ושיטות

2.1. מודלים: מופעל מאמץ על רקמה מסוימת, לדוגמא גיד, בכיוון של מערך של פיברילים גליליים אחידים מקבילים, הטבועים בג’ל PG. בכדי להעביר את המאמץ מקצה אחד של הגיד לקצה השני ללא שינויים בגודל, ה- p הכולל חייב להיות אחיד על פני הגיד. טיעון זה מביא לרלקסציה של האילוץ עבור סיבים רציפים; אין בידינו ראיות ברורות לכך שפיברילים הם רציפים לכל אורך הרקמה. על סמך מיקרו-מכאניקה של סיבים קצרים, המבנה של פיבריל קולגן מבוסס על יחס רוחב-גובה q (ידוע גם בתור תמירות, slenderness) המוגדר בתור היחס בין האורך לקוטר. הפיבריל הוא ביחס רוחב-גובה קריטי כאשר הוא תמיר מספיק בכדי לגרום למאמץ הטנסילי המתחולל בתוך הפיבריל להגיע  לחוזק טנסילי σf במרכזו במהלך העברת המאמץ הפלסטית. לפיכך, בכדי שהגידים יעמדו במאמץ הטנסילי, מצב זה דורש מהפיברילים לשאת יחס רוחב-גובה קריטי גדול וכי q יהיה גדול יותר מיחס הרוחב-גובה הקריטי. לפי חוק התערובות, אנו יכולים לתאר את התכונות המכאניות של הרקמה באופן הבא:

האיברים בצד הימני של משוואות (1) ו- (2) מכילים את משתנים E ו- σ, המסמנים קשיחות טנסילית וחוזק טנסילי. ה- f וה- g הקשורים באיברים אלו מתייחסים לפיברילים ולג’ל, בהתאמה. ההשערה שלנו היא כי β  (או p) מהווה השפעה משמעותית על שינויים קשורי-גיל בתכונות הטנסיליות. בכדי לתמוך בטיעון זה, קבענו את הערכים של הפרמטרים המכאניים E ו- σ על בסיס ניסויים טנסיליים ואת p על בסיס מחקרי מיקרוסקופיית העברת אלקטרונים (TEM) של גידי זנבות עכברים בגילאים שונים. היחסים בין כל אחד מהפרמטרים המכאניים לבין p נבדקו באמצעות ניתוח סטטיסטי.

2.2. רקמות: טבלה 1 מציגה ניתוח של גידי זנבות עכברים (זכרים) ב- 8 נקודות גיל שונות. העכברים הורדמו בהתאם להנחיות משרד הפנים הבריטי. העור הוסר מהזנב על מנת לחשוף את הגידים, והגידים הוסרו על ידי משיכתם לאורך הזנב באמצעות כוח מינימאלי, על מנת למזער נזקים. הגידים אוחסנו בטמפ’ של -20oC עד השימוש.

2.3. ניסוי מכאני: מתקן אופקי קטן לניסוי טנסילי שימש בכדי למתוח את הגיד עד קריעתו. המערכת כללה מתמר כוח עם קיבולת של 450 g, שנאי דיפרנציאלי ליניארי מגוון למדידת התקת grip-to-grip של הגידים, ובקר מוטורי למתיחת הדגימה בקצב התקה מבוקר. לפני הניסוי, כל גיד נחתך לאורך של 7 mm; הקצוות של כל חתך הודבקו למסגרת אלומיניום מלבנית דקה באמצעות דבק ציאנואקרילט, ולאחר מכן הוצבו על הגריפים בתוך המסגרת. שיטה זו אפשרה יישור קל של הצירים בכיוון ההתקה על מתקן הגידים וצמצמה מתיחה לא רצויה של הדגימה לפני הניסוי. היתרון העיקרי של מסגרת אופקית הוא כי כך ניתן לשמור על הדגימה לחה במהלך הניבוי על ידי טבילתה בחוצץ של תמיסה פוספאטית (pH 7.2) בצלוחית פטרי שהותקנה בתוך המסגרת.

לפני הפעלת המתקן, הוסרו שני הצדדים של הטמפלט המקבילים לגיד. תוך יישום של קצב התקה של 0.067 mm/s, הדגימה נמתחה ממצב של רפיון קל עד קריעתה. כוח האחזור (P) שהתחולל בדגימה וההתקה היחסית (x) בין זוג פלטות הגריפ תועדו באמצעות מתמר הכוח והשנאי הדיפרנציאלי, בהתאמה.

2.4. עיבוד הנתונים המכאניים: עקומת העומס-התארכות של כל דגימה נאמדה בכדי לקבל נתוני מאמץ ועיבור (strain). הגדרנו את היחס ε = x/s כאשר s הוא מרחק ה- grip-to-grip לאחר יישור הגידים בכדי להסיר את הקרימפים המיקרוסקופיים בגודל 200 μm עבור קירוב העיבור. הגדרה זו של העיבור אפשרה לנו לבצע השוואות עם מחקרים דומים העוסקים בגידי הזנב של עכברי C57BL6. אנו מודעים לכך שהגדרה זו היא שונה במקצת מזו של מחקרים אחרים. דגימת הגיד הרפויה יושרה בזהירות בקצב איטי ביותר (קצב עיבור < 0.5%) על ידי ניטור הקרימפים המיקרוסקופיים תחת מיקרוסקופ אופטי עד שהקרימפים נעלמו. באופן מיידי, הפסקנו את אספקת החשמל של מתקן הניסוי. על סמך תמונות שצולמו על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר, הקוטר נמדד ב- 5 מיקומים שונים לאורך החלק המרכזי של הדגימה באמצעות IMAGEPRO PLUS. הקוטר הממוצע (d) נקבע ושימש לחישוב A(=πd2/4), אזור חתך-הרוחב הממוצע הנומינאלי של הגיד; הנחנו כי לגיד יש חתך-רוחב מעגלי. המאמץ נאמד בתור היחס בין P ל- A.

עקומות המאמץ-עיבור הציגו פרופילים (איור 1) אופייניים לגידי זנב שתוארו במחקרים קודמים. המאמץ המקסימאלי הגדיר את σ. בכדי לקבוע את E בכל רמת גיל, יישמנו משווא פולינומיאלית מסדר-חמישי בכדי להתאים את נקודות נתוני המאמץ-עיבור (של כל דגימה) מ- ε = 0 ל- ε = ε0 (כלומר, העיבור בזמן מאמץ מקסימאלי) באמצעות שיטת ריבועים פחותים; במקרה שלנו, הסדרים הנמוכים לא שימשו להתאמת הנתונים. מכיוון שהחלק של עקומת המאמץ-עיבור מ- ε = 0 ל- ε = ε0 היה לא-ליניארי, בחרנו בנקודת הפיתול על העקומה המותאמת על מנת לחשב את הגרדיאנט בכדי לגזור את E; שוב, שיטה זו הינה עקבית למחקרים קודמים ומייצגת את המודולים המקסימאליים שנצפו.

איור 1: ה- plot של המאמץ (MPa) מול עיבור בטעינה של גיד זנב עד קריעה. הגידים נלקחו מעכברי C57BL6 בני 1.6 חודשים ו- 4.0 חודשים. נתוני המאמץ-עיבור הותאמו למשוואה פולינומיאלית מסדר חמישי. החוזק והקשיחות של הגיד נקבעו על סמך המאמץ המקסימאלי והגרדיאנט של נקודת הפיתול, בהתאמה.

2.5. מיקרוסקופיית מעבר אלקטרון: הגידים קובעו ב- 2% גלוטרלדהיד בחוצץ פוספאטי של 100 mM , pH 7.0, במשך 30 דקות בטמפ’ של 20oC, ולארח מכן במשך שעתיים ב- 4oC. לאחר השטיפה בחוצץ פוספאטי 200 mM, הדגימות קובעו ב- 1% גולטרלדהיד ו- 1% OsO4 בחוצץ פוספאטי 50 mM, pH 6.2, במשך 40 דקות ב- 4oC. לאחר שטיפה במים מזוקקים, הדגימות הוכתמו עם 2% אורניל אצטט מימי בכל בלוק במשך 16 שעות ב- 4oC, יובשו באתנול והוטבעו בשרף Spurr. תמונות TEM של חתכים אולטרא-דקים (בערך 70 nm) הושגו באמצעות Tecnai BioTwin במתח האצה של 80 kV. ההגדלה כוילה באמצעות רפליקת סריג עקיפה (2160 mm-1).

מיקרוגרפים דיגיטליים של חתכים כמעט-רוחביים שימשו למדידת p. המיקרוגרפים של מדידות ה- p היו בהגדלה אינסטרומנטאלית של x 15,000. כל אזור דגימה הינו מיקרוגרף שלם התואם למלבן דגימה של 4 x 5 μm2. מקטעי האזור מכל דגימת גידים היו ממוצע של 10 מלבני דגימות עם כל הפיברילים בחתך כמעט-רוחבי; אזורים מלבניים אלו נבחרו אקראית באמצעות סקירה של מיקומים מרוחקים על פני דגימת הגיד. חתך-הרוחב של כל פיבריל (או פיבריל חלקי בגבול התמונה) סומן ידנית, והאזור מוחשב באמצעות SEMPER5. הערך של p חושב בתר היחס בין סכום אזורי חתך-הרוחב של הפיבריל / אזור הדגימה הכולל.

2.6. ניתוח סטטיסטי: בכדי למצוא ראיות להבדלים (כלומר, וריאציות גיל ב- E, σ ו- p), ערכנו ניתוח ANOVA, אך אם הנתונים לא ענו על הקריטריונים של הומוגניות ונורמאליות לא-פרמטרית, יישמנו את מבחן קרוסקל-וואליס. בכדי למצוא ראיות ליחסים (כלומר, σ מול p ו- E מול p) יישמנו ניתוח רגרסיה ליניארית, המוכר בתור קורלציית פירסון, מכיוון שהנתונים ענו על הקריטריונים של הומוגניות ונורמאליות. עבור ניתוח הרגרסיה, השתמשנו בערכים העיקריים של σ, E ו- p ; ה- ANOVA שימשה בכדי לקבוע האם השיפוע של הקו המותאם היה שונה במידה מובהקת מ- 0. סטטיסטיקות המבחן יחס-F (ANOVA) ו- H (קרוסקל-וואליס) נאמדו ברמת מובהקות של α = 0.05 (5%). בהתאם לשיטות של האוט ועמיתיו, ודרווין וסוסלובסקי, נקבעו כל התכונות מכל דגימה שטופלה מכל בעל חיים ועברו מיצוע מול דגימות אחרות מאותו בעל חיים בכדי ליצור ערך מייצג של הממוצע וטעות התקן של התכונה בכל בעל חיים.

3. תוצאות הניסוי

3.1. וריאציות קשורות-גיל של E, σ ו – p: בחינת המיקרוגרפים חשפה וריאציות בגודל ובצורה של הפיברילים, הקשורות בגיל. איור 3 מציג תמונות TEM של חתכי-רוחב של פיברילים בתוך חתך רוחבי האופייני לגידים של זנבות עכברי C57BL6 מקבוצות גיל 1.6 חודשים, 4.0 חודשים, 23.0 חודשים, ו- 29.0 חודשים. בגיל 1.6 חודשים, הפיברילים דחוסים באופן משוחרר למדי; חתכי-הרוחב של הפיברילים היו מעגליים והאזורים היו קטנים. אצל עכברים מבוגרים יותר, הפיברילים היו דחוסים באופן צפוף יותר, ונצפו אזורי חתך-רוחב גדולים יותר (איורים 2(b) ו- 2(c)). בנוסף לעלייה בצפיפות ובגודל אזורי חתך-הרוחב, החל מגיל 29 חודשים נצפתה גם עלייה במספר הפיברילים עם צורות בלתי-סדירות ביותר.

שינויי ההזדקנות ב- p ו- σ מוצגים באיור 3(a); שינויי ההזדקנות ב- p ו- E מוצגים באיור 3(b). ה- plots האלו מציגים בנוסף נקודות נתונים ממחקרו של רובינסון, לשם השוואה. יש לציין כי השוואה זו הינה סבירה מכיוון שלמיטב ידיעתנו, זהו המחקר היחיד שהיה רלוונטי למחקר שלנו, בשל העובדה כי שני המחקרים יישמו שיטות ניסוי דומות. באופן כללי, ה- plots מראים כי הגודל של p, σ ו –E בגיל 1.6 חודשים היה קטן; הגודל עלה עם הגיל עד 4 חודשים. לאחר מכן, נרשמו תנודות בגדלים עד גיל 35.3 חודשים, מלבד σ, שפחת במידת מה מגיל 29.0 והלאה. הגדלים של p, σ ו- E מוצגים בטבלה 1.

בכדי לקבוע את המובהקות של מגמות אלו, נערך ניתוח סטטיסטי בכדי לקבוע את השערת ה- null כי הגדלים של p, σ ו – E לא השתנו באופן מובהק עם הגיל מול ההשערה החלופית, לפי טווחי הגילאים הבאים: (i) 1.6-4.0 חודשים; (ii) 4.0 – 29.0 חודשים; (iii) 29.0 – 35.4 חודשים. בכדי לאמוד את (i), יישמנו 3 נקודות גיל תוך השמטת הנתונים של רובינסון, מכיוון שלא היו בידינו הנתונים הגולמיים שלהם לגבי כל בעל חיים בכל נקודת גיל. בדומה, יישמנו 3 נקודות גיל עבור (iii). עם זאת, בכדי לאמוד את (ii), יישמנו 4 נקודות גיל, אך 2 מתוכן היו משותפות ל- (i) ו- (iii).

תוצאות הניתוח הסטטיסטי שלנו לגבי 3 טווחי הגילאים מסוכמים באופן הבא: עבור טווח (i), סטטיסטיקת הניסוי המחושבת עבור כל אחד מ- 3 הפרמטרים נמצאה כגדולה יותר מהערך של הכי-בריבוע (α = 0.05; P-values = 0.027, 0.030, 0.012 עבור p, σ ו- E, בהתאמה( שהושג מהטבלאות הסטטיסטיות. הסקנו כי קיימות ראיות מספקות לדחיית השערת ה- null; הוריאציות של p, σ ו –E פורשו כמגמת עלייה מגיל 1.6 חודשים עד 4.0 חודשים. עבור טווח גילאים (ii), יחס ה- F של כל אחד מ- 3 הפרמטרים היה קטן יותר מאשר יחס-F הקריטי Fcrit (α= 0.05; P-values = 0.130, 0.850, 0.930 for p, σ, E) שהושג מהטבלאות הסטטיסטיות. בטווח גילאים זה, הסקנו כי לא קיימות ראיות מספקות לדחיית השערת ה- null; p, σ ו- E פורשו כבלתי-תלויים בגיל בגילאי 4.0 חודשים עד 29.0 חודשים. לבסוף, עבור טווח גילאים (iii), יחס ה- F עבור σ היה גדול יותר מאשר Fcrit (α = 0.05; P-value = 0.037). לפיכך, עבור (iii), הסקנו כי קיימות ראיות מספיקות לדחיית השערת ה- null עבור σ; מסקנה זו מלמדת כי σ משתנה עם הגיל (במגמת ירידה, כלומר σ פוחת עם הגיל) מגיל 29.0 חודשים עד גיל 35.3 חודשים. מצד שני, טווח (iii) חשף כי יחסי ה- F המחושבים עבור p ו- E היו קטנים יותר מאשר Fcrit (α = 0.05; P-values = 0.088, 0.080 for p, E). לפיכך, עבור טווח גילאים זה, הסקנו כי לא קיימות ראיות מספקות לדחיית השערת ה- null עבור p ו- E; כלומר, p ו- E אינם משתנים עם הגיל.

בהשוואה לתוצאות מהספרות, רובינסון השיג את הנתונים הבאים עבור ממוצע ± SE הקשור בעכברים בגיל 3 שבועות (0.7 חודשים, N = 5) ו- 8 שבועות (1.9 חודשים, N = 55): p = 0.60 ± 0.03 (0.7 חודשים) ו- p = 0.68 ± 0.08 (1.9 חודשים), σ = 7.0 ± 0.5 MPa (0.7 חודשים) ו- σ = 29.0 ± 0.4 MPa (1.9 חודשים), E = 202.0 ± 29.5 MPa (0.7 חודשים) ו- E = 467.0 ± 14. 3 MPa (1.9 חודשים). התוצאות שלנו ב- 1.6 חודשים (7.0 שבועות) היו p = 0.56 ± 0.03, σ = 26.1 ± 3.0 MPa ו- E = 417.0 ± 51.2 MPa, שהיו בטווח של התוצאות שדווחו לגבי עכברים בגילאי 0.7 חודשים ו- 1.9 חודשים.

איור 2: מיקרוגרפים של מעבר אלקטרון המראים חתכי-רוחב של פיברילים בתוך חתך רוחבי של גידים מזנב של עכברי C57BL6 לפי קבוצות הגיל הבאות: a) 1.6, b) 2.6, c) 11.5, d) 29.0. קנה מידה = 350 nm.

איור 3: גרפים של a) חוזק σ ואזור p, ו- b) קשיחות E ו- p מול גיל הגידים מזנבות של עכברי C57BL6. יהלומים (♦) מייצגים נקודות נתונים התואמות את σ ו- E; נקודות (•) מייצגות את p. הקו האנכי בכל נקודת נתונים מצביע על ה- SE של הערך הממוצע של σ, E ו- p. הנקודות ממחקרו של רובינסון מוקפות בעיגול.

איור 4: ה- plots של הרגרסיה הליניארית עבור a) חוזק σ מול אזור p ו- b) קשיחות E מול p. הקו הרצוף (קו מגמה 1) נקבע בתור σ = 114.21p-35.41 (R2 = 0.56) ו- E = 921.05p-106.34 (R2 = 0.61). הטבלאות הסטטיסטיות שימשו לקביעת יחס ה- F הקריטי (Fcrit = 5.99, α = 0.05, ורמות החופש v1 = 1, v2 = 6). על סמך ה- ANOVA יחסי ה- F  המחושבים עבור (a) ו- (b) היו 7.68 ו- 9.41, בהתאמה; P-values < 0.05. כאשר שילבנו את הנתונים שלנו עם הנתונים של רובינסון, הקו המקווקו (קו מגמה 2) נקבע בתור σ = 166.96p-78.06 (R2 = 0.68), E = 1366.80p-463.14 (R2 = 0.69). Fcrit = 4.41 (α = 0.05, v1 = 1, v2 = 8). יחסי ה- F המחושבים עבור (a) ו- (b) היו 17.15 ו- 17.69, בהתאמה; P-values < 0.05. • נתונים מהמחקר הנוכחי. ■ נתונים ממחקרו של רובינסון.

3.2. ניתוח רגרסיה ליניארית: בכדי לבחון את ההשערה שלנו, יישמנו ניתוח רגרסיה ליניארית בכדי לבחון את השערת ה- null לפיה השיפוע של הקו המותאם לנתונים היה 0, מול ההשערה החלופית. משתני התגובה בניתוח היו הפרמטרים המכאניים E ו- σ, בזמן ש- p היה הפרדיקטור, על פי משוואות (1) ו- (2). יישמנו ANOVA בכדי למצוא ראיות ליחסים ליניאריים בין הפרמטרים המכאניים לבין p, על ידי חישוב יחסי ה- F וערכי ה- P התואמים. E, σ ו- p היו הערכים הממוצעים של הפרמטרים הקשורים בכל עכבר בכל קבוצת גיל. ניתוח הרגרסיה שקל שני מקרים: נתונים מהמחקר הנוכחי בלבד, ונתונים מהמחקר הנוכחי וממחקרו של רובינסון.

בכדי לאמוד את הפרופורציה של הווריאציה ב- E ו- σ המוסברת על ידי וריאציה ב- p, כלומר, מ- 0 עד 1, חישבנו את המקדם של הזיהוי, R-בריבוע, באמצעות רגרסיה ליניארית. איור 4(a) מציג את ה- plots של E מול p, שלכל אחד מהם הותאמו קווים ישרים. כאשר שוקלים את נקודות הנתונים של המחקר הנוכחי בלבד, ערכי ה- R-בריבוע היו 0.54 (σ מול p) ו- 0.61 (E מול p). תוצאות אלו מלמדות כי p מסביר יותר ממחצית, כלומר R2 > 0.50, מהשינוי בתכונות המכאניות על פני טווח הגילאים במחקר. אף על פי כן, ניתן לראות כי חלק גדול מהנקודות לא נמצאו על הקו המותאם; פירוש הדבר כי ייתכנו גורמים אחרים המשפיעים על התכונות המכאניות. כאשר שוקלים את נקודות הנתונים של שני המחקרים, ערכי ה- R-בריבוע עלו ל- 0.69 (E מול p) ו- 0.68 (σ מול p).

בנוסף, במקרה של נתוני המחקר הנוכחי בלבד, יחסי ה- F המחושבים היו גדולים יותר מאשר Fcrit = 5.99 (α = 0.05; v1 = 1, v2 = 6); ה- P-values היו קטנים מ- 0.05. תוצאות אלו מלמדות כי השיפועים של הקווים באיור 4 היו שונים באופן מובהק מ- 0. לפיכך, ניתן לדחות את השערת ה- null; קיימות ראיות מספקות ליחסים ליניאריים בין E ל- p ובין σ ל- p. יש לציין כי כאשר שוקלים את נתוני שני המחקרים, יחסי ה- F המחושבים עדיין יותר גדולים מ- Fcrit = 5.32 (α = 0.05; v1 = 1, v2 = 8); P-values < 0.05.

4. דיון ומסקנות

במחקר זה תיעדנו את הווריאציות בחוזק (σ), קשיחות (E) ומקטע אזור הקולגן (p) של גידי זנבות עכברים עם הגיל, בתוך טווח הגילאים במחקר. מחקר האפיון חשף מגמת עלייה מהירה (1.6 – 4.0 חודשים; P-values < 0.05). מ- 4.0 חודשים עד 29.0 חודשים לא נרשם שינוי מובהק (בלתי תלוי בגיל, P-values > 0.05). מגיל 29.0 חודשים עד 35.3 חודשים E ו- p לא הציגו שינויים מובהקים (α = 0.05; P-values > 0.05 ). עם זאת, σ הציג מגמת ירידה הדרגתית מ- 29.0 חודשים עד 35.3 חודשים עם P-values = 0.037 < 0.05 (בהשוואה ל- P-values = 0.030 עבור 1.6 – 4.0  חודשים). מגמות אלו מלמדות כי המעבר מגדילה לבגרות מתרחש במשך 4.0 חודשים בקירוב. לאחר מכן, להוציא את E ו- p, המגמות של σ מראות מעבר מבגרות לזקנה המתרחש במשך 29.0 חודשים בקירוב.

מטרת המחקר הייתה לאמוד את התלות ב- p של שינויי הזדקנות ב- σ ו- E . ניתוח רגרסיה ליניארית הניב ראיות לקורלציה בין כל אחת מהתכונות הטנסיליות לבין p במהלך הגדילה, הבגרות והזקנה. ממצא זה מלמד כי p הינו פרדיקטור מובהק של σ ו- E. כפי שציינו קודם, ניתן להתייחס לגידים בתור תרכובות המחוזקות עם פיבריל קולגן. טענה זו מלמדת כי ניתן לנבא את התגובה המכאנית של הרקמה לפי מקטע הנפח של הקולגן הנוכח על סמך חוק התערובות. השוואה בין ערכי ה- R-בריבוע של E מול p , ושל σ מול P, מלמדת כי התגובות של E ו- σ לשינויים ב- p היו דומות. לדוגמא, עלייה במקטע הנפח של הפיברילים הובילה לעלייה ב- E ו- σ.

וריאציות בתכולה של הקולגן, כלומר, בזמן התהליך של ההרכבה העצמית או ההיתוך של הפיבריל, יכולות להשפיע על אזורי חתך-הרוחב של הפיבריל. כפי שציינו קודם, העלייה בצפיפות הדחיסה ברקמות זקנות מלווה בעלייה במספר הפיברילים ואי-סדירות בצורה. פרופילים בלתי-סדירים אלו יכולים לנבוע מהיתוך פיבריל-פיבריל; שינויים אלו בגודל ובצפיפות של הפיברילים בגידים הינם עקביים לאלו שדווחו במחקרים קודמים, לגבי גידי הזנב של חולדות. עם זאת, עלייה בתכולת הקולגן יכולה להקביל לשינויים בצפיפות של קשרי-רוחב קוולנטיים של הקולגן, אשר בתורם עשויים לשקף שינויים ב- σf ו- Ef. קשרי-רוחב אלו קושרים את מולקולות הקולגן מקצה לקצה לאורך הפיבריל. קשרים אלו נוצרים באמצעות שני מנגנונים: 1) קישור-רוחב מדויק בשליטה אנזימית במהלך הגדילה (קשרים דיוולנטיים) ובבגרות (קשרים טריוולנטיים); 2) מנגנון לא-אנזימי, הידוע בתור גליקציה (הוספת גלוקוזה לקולגן), לאחר התבגרות הרקמה. וריאציות קשורות-גיל בפרופורציות של קשרי-רוחב אלו יכולות לתרום לווריאציות ב- σf ו- Ef. כתוצאה מכך, באנלוגיה לתרכובות הנדסיות, הן יכולות להסביר את הפיזור שנצפה ברגרסיה הליניארית (איורים 4(a) ו- 4(b)). רובינסון ערך לאחרונה ניתוח רגרסיה ליניארית בכדי לאמוד את התרומות היחסיות של משתנים מבניים – p, קוטרי פיבריל ממוצעים, ווריאציות בקוטר הפיבריל (FDV) , כלומר סטיית התקן חלקי קוטר הפיבריל הממוצע – ומשתני ההרכב, כלומר תכולת הקולגן והפרוטאוגליקן, לניבוי תכונות מכאניות רקמתיות בשתי נקודות גיל, 0.7 חודשים ו- 1.9 חודשים, בגידי הזנב של עכברי C57BL6. המחקר מצא קורלציה חיובית בין σ ו- p ובין E ו- p, אך לא עם תכולת הקולגן, קוטרי הפיבריל הממוצעים, ו- FDV. למרות שהמחקר לא ניסה לנתח את היחסים בין p לבין תכולת הקולגן, הא הראה כי קוטר הפיבריל הממוצע היה קשור לתכולת הקולגן בגילאי 0.7 חודשים עד 1.9 חודשים, ובכך חיזק את טענותינו כי עלייה בגודל הפיבריל משקפת עלייה בתכולת הקולגן. נמצאה קורלציה שלילית בין תכולת הקולגן לבין כל אחת מהתכונות המכאניות; בעוד שתכולת ה- PG תרמה לאחוז נמוך יותר של משקל יבש, נמצא משקל גדול יותר של קולגן לכל יחידה; לפיכך, נרשמו E ו- σ גבוהים יותר. מסקנה זו זכתה לתמיכה נוספת על ידי ראיות לקורלציה שלילית בין תכולת הגליקוזאמינוגליקן לכל יחידת משקל יבש ובין תכולת הקולגן הכוללת וקוטר הפיבריל הממוצע. בסך הכול, מכיוון שהמחקר נערך בשתי נקודות גיל בתחילת חיי העכברים, לא ברור כיצד וריאציות אלו, כלומר תכולת הקולגן, עשויות להשפיע על E ו- σ במהלך חיי העכבר. שאלה זו דורשת חקר נוסף.

לפי מיטב ידיעתנו, זוהי הפעם הראשונה שבה נערך מחקר מקיף לגבי σ, p ו- E של גידי הזנב של עכברי C57BL6 בטווח נרחב של נקודות גיל. חשוב לציין כי גידי הזנב אינם נושאים במשקל, וניתן להחשיבם ככאלו המושפעים מהזדקנות. כיצד תוצאות אלו עומדות מול מיני מכרסמים אחרים? עד עתה, מרבית הנתונים הזמינים הגיעו מחולדות; אנו מתמקדים רק בתוצאות המכאניות, מכיוון שלא נמצאו תוצאות לגבי p, ובמחקרים הכוללים טווחי גיל נרחבים, מספר נקודות גיל, ומספר מודלים של בעלי חיים לכל נקודת גיל, מכיוון שאלו נכללו במחקרנו. באופן כללי, לעכברים וחולדות יש תוחלת חיים דומה, 3 שנים בקירוב. התוצאות של ווגל וטורפ חשפו מגמות עקביות למחקר שלנו עבור E ו- σ בטווח גילאים של 1.0 עד 30.0 חודשים. למרבה הצער, לא נמצאו נתונים מעבר לגילאים אלו. ויידיק הציג נתונים לגבי 1.0 – 35.0 חודשים; בפרט, הנתונים הראו כי לקראת הזקנה, σ פוחת אך E עולה. עם זאת, לא ברור האם מגמות אלו היו מובהקות, מכיוון שלא דווח על ניתוח מובהקות סטטיסטית.

החלק הבא עוסק ב- 3 סוגיות הנוגעות למתודולוגיה של המחקר. הסוגיה הראשונה נוגעת לרקמות ביולוגיות העוברות התכווצות במהלך הייבוש ותהליכי ההטמעה עבור המיקרוסקופיה האלקטרונית. הגודל של השפעה זו תלויה ברקמה, שיטות הקיבוע הכימי, והליך הטבעת השרף. האופי של הליך ה- TEM פירושו כי הוא יביא להתכווצות של הפיברילים וג’ל ה- PG בתוך דגימת הרקמה כך שמדידות ה- p הן יחסיות במקום אבסולוטיות. נערך מחקר בכדי לכמת את התכווצויות אלו בסטרומה קורניאלית של בקר בוגר, שהכילה צפיפות גבוהה של פיברילים, תוך כיסוי טווח רחב של הליכי עיבוד ושרפי הטבעה. לאחר הליך הדומה לזה שנערך במחקר שלנו (קיבוע גלוטרלדהיד, קיבוע אוסמיום, והטבעה בשרף אפוקסי), נמצאה ירידה במרווח הבין-פיברילי של כ- 9%. הירידה בקוטר הפיבריל לאחר הטבעת אפוקסי הייתה בערך 10%. כתוצאה מההתכווצות, נרשמה הערכת-חסר של 2% בניבוי ה-p. ערכי התכווצות אלו היו יחסיים לפרמטרי פיבריל שנגזרו מנתוני פיזור רנטגן בזווית קטנה מרקמות ילידיות שיובשו לחלוטין. ההשפעות של הווריאציה בשגיאה זו כתוצאה מגיל הגידים צפויות להיות קטנות בהשוואה לווריאציה ב- p. הסוגיה השנייה נוגעת להשפעות של הקפאה על התכונות המכאניות במהלך האחסון. נמצא בעבר כי הקפאה מובילה להיווצרות גבישי קרח על הרקמות. נזק תאי הנגרם מהקפאה מיוחס לכוחות המתחוללים במהלך היווצרות גבישי הקרח המובילים לקריעה של הממבראנות הציטופלזמיות החלשות. לא ברור כיצד גבישי הקרח משפיעים על הפיברילים. במחקר אחר שבחן את ההשפעה של טמפרטורת האחסון על התכונות המכאניות, בדקנו דגימות טריות ודגימות מופשרות מטמפרטורות אחסון של -20oC ו- -80oC מזנב של עכבר בן 16 חודשים; בשני המקרים, נאמדו 10 דגימות. מניתוחי t-test של שני דגימות, לא מצאנו הבדל מובהק (P-value > 0.05) בין הדגימות הטריות (ממוצע ± SE; σ = 54.4 ± 4.4 MPa; E = 440.0 ± 36.8 MPa) לבין הדגימות שהופשרו מטמפ’ אחסון של -20oC (σ = 58.1 ± 3.5 MPa; E = 529.7 ± 26.9 MPa). עם זאת, נמצא הבדל מובהק (P-value < 0.05) בין דגימות טריות לבין דגימות מופשרות מטמפ’ של -80oC (σ = 78.6 ± 9.6 MPa; E = 633.0 ± 70.7 MPa). הסקנו כי אחסון רקמות ב- -20oC אינו משפיע על התכונות המכאניות. ההשפעה של הווריאציה בין דגימות טריות לדגימות שאוחסנו ב- -20oC כנראה אינה גדולה בשל גיל הגידים; מחקרים אחרים דיווחו כי לא נמצא הבדל מובהק בין דגימות טריות לבין דגימות שאוחסנו ב- -15oC. הסוגיה השלישית נוגעת לפיזור של נקודות הגיל על פני הטווח שנבדק במחקר. ניתוח הרגרסיה הניב שיפור (ביחס לערכי ה-R-בריבוע) כאשר שילבנו את הנתונים שלנו עם נתונים הנוגעים לנקודות גיל מוקדמות יותר ממחקרים אחרים. שילוב זה שיפר את הטווח של p, ובנוסף הצביע על כך שהרחבת היקף המחקר הנוכחי צריכה לכלול נתונים לגבי רקמות מתפתחות. אנו מתכוונים לעסוק בנושא זה בעתיד.

לסיכום, ביקשנו לחקור את הווריאציות הקשורות-בגיל בתכונות המכאניות (σ ו –E) של גידי הזנב של עכברי C57BL6. מצאנו קורלציות בין תכונות אלו לבין שינויים מבניים בגיד, כלומר p. הניתוח שלנו חשף כי p הינו פרדיקטור מובהק של שינויי הזדקנות ב- σ ו –E. מחקר זה מהווה חלק מתוך מאמץ נרחב יותר לחולל מידע בסיסי לגבי המנגנונים השולטים בתהליך ההזדקנות ב- ECM. עכברי C57BL6 מהווים אופציה אטרקטיבית בהקשר של מחקרי ביולוגיה אינטגרטיביים מכיוון שהגנום המלא שלהם עבר ריצוף, ולפיכך יכול לשמש כמודל מועיל לחקר של השערות הזדקנות ברקמות חיבור. המידע המוצג כאן יכול לתרום למטרה ארוכת הטווח לבחינת השערות הזדקנות בשינויים פיזיולוגיים בתאים מזדקנים הקשורים בירידה בסינתזה ושימור מבנה ה- ECM והמנגנונים הגנטיים המשפיעים על מודיפיקציות פוסט-תרגום.