Anti-stress and neuronal cell differentiation induction effects of Rosmarinus officinalis L. e

השפעות נוגדות-דחק ואינדוקציית התמיינות תאי עצב של שמן אתרי Rosmarinus officinalis L.

תקציר

רקע: הפרעות מצב רוח (mood disorders) אחראיות ל- 13% מנטל המחלות הגלובאלי. בעוד שקיימת זמינות של סוכנים תרפויטיים, בדרך כלל כאלו הנצרכים אוראלית, רובם כוללים תופעות לוואי בלתי רצויות, וכתוצאה מכך אינהלציה של שמנים אתריים (EOs) הופכת לחלופה תרפויטית מבוקשת. ה- EO Rosmarinus officinalis L. (רוזמרין רפואי) (ROEO), ROEO ים תיכוני, מסוגל לשפר את הקוגניציה, מצב הרוח והזיכרון, אך השפעותיו על הדחק (סטרס) טרם נקבעו. במחקר זה, ההשפעות נוגדות-הדחק של ROEO נאמדו in vivo  ו- in vitro.

שיטות: עכברי ICR זכרים בני 6 שבועות עברו אינהלציה של ROEO ונבדקו במבחן tail suspension (TST). על מנת לקבוע את השפעות התמיינות תאי עצב של ROEO in vitro, נצפתה אינדוקציה של התמיינות תאי-עצב PC12 שטופלו ב- ROEO. בנוסף, נקבעו רמת האצטילכולין והכולין התוך-תאית, ורמות ביטוי הגן Gap43.

תוצאות: אינהלציה של ROEO הפחיתה באופן מובהק את זמן האי-מוביליות של עכברי ICR ורמות הקורטיקוסטרון של הסרום, בליווי רמות דופמין מוגברות במוח. קביעת המנגנון הבסיסי In vitro חשפה אפקט אינדוקציית התמיינות של PC12 באמצעות אפנון של אצטילכולין, כולין, ורמות ביטוי של גן Gap43 תוך-תאיות. ה- ROEO מוביל לאקטיבציה של מערכת התגובה לדחק דרך נתיב ה- NGF וציר ההיפותלמוס-בלוטת יותרת המוח-בלוטת יותרת הכליה (ציר ה- HPA), ומעודד ייצור והפרשה של דופמין. ניתן לשייך את ההשפעה של ה- ROEO לרכיבים הביו-אקטיביים שלו, במיוחד אלפא-פינן, אחד התרכובות העיקריות שלו הכוללת תכונות אנקסיוליטיות.

מסקנות: תוצאות מחקר זה מראות כי אינהלציה של ROEO היא בעלת פוטנציאל תרפויטי נגד הפרעות פסיכיאטריות הקשורות בדחק.

רקע

הפרעות רגשיות, כולל דיכאון, גורמות לנטל עצום על הבריאות ברחבי העולם. הוצעו מספר תיאוריות המסבירות את הפתוגנסיס של דיכאון, אך בשל המורכבות הרבה של הנושא, זיהוי המנגנונים הספציפיים של הדיכאון הינה משימה קשה. עם זאת, הראיות מלמדות כי דיכאון ודחק קשורים לאטרופיה ואובדן של תאי עצב, ולהפחתה בנפח של מספר מבני מפתח במוח. חשיפה כרונית לדחק, לדוגמא, גורמת לאינדוקציה של דלקות עצביות, ניוון עצבי, ו- micro-damage במוח. תרופות אנטי-דיכאון שאושרו לאחרונה, כמו מעכבי קליטה חוזרת בררניים של סרוטונין (SSRI), או אנקסיוליטים בצריכה אוראלית, מציגות יעילות תרפויטית מוצלחת יותר בהשוואה לתרופות קודמות. עם זאת, תופעות הלוואי הבלתי רצויות של תרופות אלו, כמו ההשפעה האמנסטית של בנזודיאזפין, טרם הועלמו לחלוטין, והמנגנונים המולקולאריים והתרפויטיים שלהן עדיין אינם מובנים במלואם. על מנת לפתור חששות לגבי היעילות המוגבלת של התרופות הקיימות, קיים ביקוש לסוכנים נוגדי-דיכאון חדשים או סוכנים חלופיים עם מנגנונים חדישים המציגים אפקטיביות רבה יותר ללא תופעות לוואי.

שמנים אתריים (EOs) משמשים מזה זמן רב ברפואה העממית ומהווים סוכן תרפויטי מבוקש כנגד דחק אוקסידטיבי, היווצרות גידולים (טומוריגנסיס), והפרעות הקשורות בדחק כמו חרדה ודיכאון. גם הספרות האנקדוטית וגם הספרות האמפירית כוללות מחקרים לגבי EOs עיקריים, הנוגעים להשפעות התנהגותיות או פסיכולוגיות, אך ההשפעות של EOs רבים עדיין אינן ידועות. ה- Rosmarinus officinalis (רוזמרין רפואי) הינו עשב המשמש למטרות קולינריות ורפואיות, המכיל פוליפנולים כמו חומצה רוזמרינית, חומצה קרנוסית, לוטאולין ופיטוכימיקלים מסיסים במים אחרים הגורמים למספר השפעות על מחלות פסיכיאטריות או התפקוד הנוירולוגי, כולל תכונות נוריופרוטקטיביות וקוגניטיביות, והשפעות נוגדות דיכאון וחרדה. המחקרים מראים כי ה- EO של רוזמרין רפואי (ROEO) מציג פעילות אנטי-פרוליפרטיבית, אנטי-אוקסידנטית ואנטי-בקטריאלית, ומראה שיפור של הקוגניציה, מצב הרוח והזיכרון אצל מבוגרים בריאים, ושיפור של פעילות לוקומוטורית אצל עכברים. נטילה אוראלית של ROEO הראתה השפעות דמויות אנטי-דיכאון אצל עכברים, אך הטרפנואידים והקטונים של EOs מציגים לעתים קרובות טוקסיות חמורה אפילו בריכוזים נמוכים ביותר. אינהלציה של EO בטיפול סדאטיבי אנקסיוליטי ונוגד-דחק מבטיח אפקטיביות ללא תופעות לוואי בלתי רצויות והוא בעל יתרון במונחים של היעדר השלכות פתולוגיות על האיברים והרקמות. עם זאת, האפקטיביות והמנגנונים המפורטים של אינהלציה של ROEO על התפקוד הפסיכולוגי והנוירולוגי הם עדיין בלתי ידועים.

במחקר זה, אנו אומדים את ההשפעה של אינהלציה של ROEO על המנגנונים המולקולאריים באמצעותם ה- ROEO מפיג דחק in vitro דרך תאי PC12 ו- in vivo באמצעות עכברי ICR, זן עכברים המשמש באופן נפוץ עבור מבדקים התנהגותיים. התפקודים הפסיכיאטריים והמנגנונים הנוירו-פיזיולוגיים נקבעו in vivo באמצעות מבחן tail suspension (TST), ומדידת רמות הקטקולמין והקורטיקוסטרון, בעוד שהשפעה על ההתמיינות העצבית נקבעה באמצעות הפעילות של האצטילכולין-אסטראז (AChE) וההתארכות העצבית בתור אינדיקאטורים, In vitro. ההשערה שלנו היא כי ה- ROEO מגביר אקטיבית את הפעילות העצבית אצל העכברים באמצעות עידוד התמיינות תאים.

שיטות

הכנת דגימות של שמן אתרי

עלי הרוזמרין הרפואי שנאספו ממטמטה, תוניסיה, ושימשו להפקת ה- ROEO במחקר זה, אושרו על ידי פרופ. מוחמד נפאטי. ה- voucher specimens של דגימות עלי הרוזמרין (UT-ARENA-00323) ששימשו במחקר זה הופקדו במחלקת Alliance for Research on North Africa של אוניברסיטת Tsukuba ביפן. ה- ROEO הופק מעלים יבשים בשיטת הידרודיסטילציה, ונשמר בחשיכה בטמפרטורה של 4oC עד השימוש. ה- EO הטהור של לבנדר (Lavandula angustifolia) (LAEO) ושמן שקדים (Prunus dulcis) (AL) נרכשו מ- Sigma (סט.לואיס) ו- Wako Pure chemical Industries (אוסאקה, יפן), בהתאמה.

רכיבי ה- ROEO נותחו בעזרת כרומטוגרף גז Agilnet 6890 N Network (GC) המצויד עם ספקטורמטר מסה HPMS 5973 עם עמודת סיליקה HP-5MS (30 m X 0.25 mm ID, עובי פילם 0.25 μm, והגז הנשא היה הליום המותאם למהירות ליניארית של 34 cm/s). תכנית טמפרטורת התנור הייתה זהה לזו ששימשה עבור עמודת ה- HP-5 בניתוח ה- GC-FID; טמפרטורת המקור הייתה 230oC, טמפרטורת ה- quadrupole הייתה 150oC, טמפרטורות האינג’קטור והגלאי היו 250oC ו- 280oC, בהתאמה. הדגימות (0.1 μl) הוזרקו עם יחס פיצול של 1:1000. ההרכב של ה- ROEO זוהה בעזרת GCMS והרכיבים העיקריים של ה- ROEO זוהו כקמפור (20.42%), אלפא-פינן (10.49%), ובטא-פינן (10.21%) (טבלה 1).

בעלי החיים

עכברי ICR זכרים בני 6 שבועות שימשו במחקר זה (מעבדות Charles River, יפן) ושוכנו בנפרד בכלוב פולי-קרבונט מרופד בנייר עם מכסה פלדת אל-חלד. העכברים קיבלו מים ומזון באופן חופשי במחזור 12/12 שעות של אור/חושך, במתקן עם בקרת טמפרטורה ולחות במרכז המחקר הגנטי של אוניברסיטת Tsukuba. לפני תחילת הניסויים, העכברים עברו התאקלמות לתנאי המעבדה במשך שבוע אחד, והוקצו לקבוצות הניסוי באופן אקראי. כל אחד מהעכברים הוקרב באמצעות דיסלקציה של עמוד השדרה הצווארי. הדם נאסף, וסרום הדם נאסף באמצעות צנטריפוגה של 2000Xg במשך 10 דקות. דגימות המוח נאספו ונשטפו עם PBS(-), ומיד לאחר מכן הושרו בחנקן נוזלי ונשמרו בטמפרטורה של -80oC עד השימוש. הניסויים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת Tsukuba.

טבלה 1: ניתוח GCMS של רכיבי השמן האתרי של R. officinalis (ROEO).

שיטת האינהלציה של EO

ה- EOs טופטפו על פיסת כותנה שהונחה על החלק העליון של הכלוב לפני שהעכברים הונחו בתוכו (30 cm X 23 cm X 15 cm) ושאפו את ה- EO במשך 30 דקות. עכברי קבוצת הבקרה (n = 6) הונחו בכלוב ללא EO. הנפח של ה- EOs שעברו דיפוזיה בכלוב הם כדלקמן: 100 μl LAEO (n = 8), 100 μl AL (n = 8), ו- 50 μl ROEO (n = 8) או 100 μl ROEO (n = 8). ה- AL שימש כבקרה שלילית בעוד שה- LAEO שימש כבקרה חיובית. העכברים שאפו את ה- EOs כל יום, במשך 14 ימים. אף אחד מהעכברים לא נחשף ל- EO לפני מחקר זה.

מבחן tail suspension (TST)

ה- TST, שיטה מקובלת ונפוצה לבחינת נוגדי-דיכאון או אנקסיוליטים במכרסמים, בוצע באופן דומה לזה שתואר על ידי Cavanagh ועמיתיו. לאחר האינהלציה של ה- EO, העכברים נתלו במשך 6 דקות על ידי הדבקת הזנב לוווים היורדים מתקרת המתקן (30 X 15 X 50 cm; L x W x H) וזמן האי-מוביליות שלהם ב- 4 הדקות האחרונות של המבחן תועד, כפי שתואר בניסויים קודמים. מדידת זמן האי-מוביליות החלה כאשר העכבר לא זז כלל וללא עיוותים ביציבה. ה- TST  בוצע בכל יומיים במשך שבועיים, כאשר הסדר של הטיפולים והניסויים בוצע באופן אקראי עד השלב בו כל העכברים טופלו או נבחנו.

ניסוי סרום קורטיקוסטרון

רמת הסרום קורטיקוסטרון (ng/ml) נקבעה בעזרת ערכת AssayMax Corticosterone (סט. צ’ארלס, ארה”ב) לפי הוראות היצרן. הסרום הוכן כפי שתואר במחקרים קודמים. בקצרה, הדם עבר צנטריפוגה של 2000Xg במשך 10 דקות בכדי לאסוף דגימות סרום שאוחסנו בטמפרטורה של -80oC לפני הניתוח. רמת הקורטיקוסטרון חושבה בהתבסס על העקומה הסטנדרטית שהוכנה בעזרת ריאגנט הקורטיקוסטרון הסטנדרטי שנכלל בערכה.

ניסוי דופמין (DOP), נוראדרנלין (NAD) ואדרנלין (ADR)

מוחות העכברים נאספו, ונלקחו חתכים של 100 mg מההיפוקמפוס וקליפת המוח לצורך ניתוח. על מנת להכין את הדגימות לניתוח, הוספו 100 μl של מים מזוקקים לכל דגימה, ולאחר מכן בוצעה הומוגניזציה על קרח במשך דקה אחת. עבור ניתוח רמות הדופמין, הנוראדרנלין והאדרנלין, השתמשנו ב- 3-CAT Research ELISA (גרמניה) בהתאם להוראות היצרן.

הכנת תרביות התאים והדגימות

תאי ה- PC12 נשמרו בתווך Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) עם תוסף 5% סרום בקר עוברי (FBS) שעבר אינאקטיבציה בחום (ארה”ב), 10% סרום סוסים (HS) שעבר אינאקטבציה בחום (ניו זילנד), ו- 50 U/ml פניצילין, 50 μg/ml סטרפטומיצין (ארה”ב) ועבר אינקובציה ב- 37oC באינקובאטור מחולל לחות עם 5% CO2. התאים בין מעברים 3 ו- 8 שימשו בניסויים. ה- ROEO עבר סטריליזציה באמצעות סינון (פילטר 0.22 μm) ועבר אמולסיפיקציה בתווך גדילה, דולל עם 10% נפח של אתנול, ועבר הומוגניזציה על קרח לפני השימוש. גורם הגדילה העצבי 7 s  (NGF) (Sigma) דולל בתווך הגדילה ב- 50 ng/ml.

אומדן ויאביליות התאים

ויאביליות התאים נאמדה בעזרת נוהל 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl), 5-diphenyltetrazolium bromide (MMT). תאי ה- PC12 נזרעו ב- 1X105 cells/ml לתוך פלטות 96-well מצופות poly-L-lysine. לאחר אינקובציה במשך הלילה, התאים טופלו עם וללא ROEO ב- 5, 10, 50 ו- 100 μg/ml במשך 48 שעות. נוהל ה- MMT בוצע לאחר מכן על ידי הוספת 10 μl של תמיסת MMT (יפן) והכנסת התאים לאינקובציה במשך 24 שעות נוספות ב- 37oC בחשכה, ולאחר מכן הוספת 100 μl של 10% SDS (Wako) ואינקובציה של 24 שעות. הספיגה ב- 570 nm נקבעה בעזרת קורא מיקרו-פלטה מולטי-דטקציה (יפן). הויאביליות של תאי ה- PC12 חושבה בתור אחוז של הבקרה.

ניסוי אצטילכולין-אסטראז (AChE)

תאי PC12 ממוינים מסנתזים נוירוטרנסמיטורים בהם ניתן להשתמש כמארקרים של התמיינות עצבית. תאי ה- PC12 תורבתו כפי שתואר מעלה, וטופלו עם וללא NGF, הבקרה החיובית, או 10 μg/ml ROEO ועברו אינקובציה במשך 48 שעות. ההשפעה של ROEO על ההתמיינות העצבית, באמצעות נוהל AChE, נבדקה בשיטות שתוארו במחקרים קודמים.

קביעת רמות הכולין (Ch) והאצתילכולין (ACh) התוך-תאיות

הריכוז התוך-תאי של ACh ו- Ch בתאי PC12 נמדד בעזרת Ultimate 3000 Dionex HPLC יחד עם גלאי אלקטרו-כימי (ECD). תאי ה- PC12 נזרעו ב- 1X105 cells/ml לתוך צלחת 10 cm ועברו אינקובציה במשך הלילה. לאחר מכן התאים טופלו כפי שתואר מעלה ונשטפו עם PBS(-) פעמיים ונאספו על ידי טריפסיניזציה. התאים עבור הומוגניזציה ב- 15% חומצה פורמית באצטון ועברו צנטריפוגה ב- 12,000Xg, 4oC במשך 15 דקות. הסופרנטנט עבר נידוף באמצעות צנטריפוגת ואקום (SCRUM, יפן) והמשקע הומס ב- 100 μl של מי milliQ וסונן ונותח למציאת הרמות התוך-תאיות של ACh ו- Ch באמצעות עמודת AFpack ACH-494 (4.6 mm ID X 10 mm L) (יפן). כמות ה- ACh וה- Ch נמדדה כפי שתואר בעבר.

מדידת ביטוי הגן הגורם הקשור בגדילה 43 (Gap43)

על מנת לחשוף את ההשפעה של ROEO על ההתמיינות העצבית ברמת השעתוק, כומת הביטוי של גן Gap43 באמצעות PCR בזמן-אמת. תאי ה- PC12 נזרעו וטופלו כפי שתואר מעלה. לאחר הטיפול, התאים נשטפו עם PBS(-) פעמיים והופרדו באמצעות גירוד עדין של התאים. ה- RNA נאסף באמצעות ISOGEN (NIPPON GENE CO. Ltd) לפי הוראות היצרן. השעתוק לאחור בוצע בעזרת ערכת רוורס-טרנסקריפטאז Superscript III (Invitrogen, ארה”ב) והוגבר באמצעות 2720 Thermal Cycler (ארה”ב). תגובות הגברת ה- PCR בזמן-אמת בוצעו בעזרת מערכת AB7500 Fast בזמן-אמת, לפי תנאי המחזור הבאים: שתי דקות ב- 50oC, 10 דקות ב- 95oC, ו- 40 מחזורים של 15s ב- 95oC/1 min ב- 60oC. חלבון 43 (Gap43) (Rn01474579_m1) ו- Gapdh (Rn01775763_g1) הספציפיים לגדילת עכברים נרכשו מ- Applied Biosystems.

השפעת ה- ROEO על תאי-עצב ממוינים

על מנת לקבוע את ההשפעה של ROEO על תאי העצב, תאי ה- PC12 טופלו עם 50 ng/ml NGF על מנת לעורר את התאים להתמיין בזמן שתאים ללא טיפול שימשו בתור בקרה. התאים עברו לאחר מכן אינקובציה נוספת במשך 24 שעות, ולאחר מכן עברו טיפול עם (NGF + ROEO) או ללא 10 μg/ml ROEO במשך 48 שעות. רמת ה- AChE, המצביעה על פעילות האינדוקציה של ההתמיינות העצבית של תאי PC12, כומתה לאחר מכן באמצעות נוהל ה- AChE. פעילות ה- AChE נאמדה באמצעות הפרוטוקול שתואר מעלה.

ניתוח סטטיסטי

כל התוצאות בוטאו בתור ממוצע ± סטיית תקן. הניתוח הסטטיסטי בוצע בעזרת מבחן סטודנט t. ההשוואות בין הקבוצות נערכו באמצעות ניתוח חד-כיווני של ההשתנות (ANOVA) ולאחר מכן השוואת זוגות באמצעות תוכנת JMP Statistical Discovery גרסא 13.2.0 של SAS. תוצאה של P ≤ 0.05 נחשבה כבעלת מובהקות סטטיסטית.

תוצאות

ROEO מפיג דחק הנוצר מ- TST in vivo

על מנת לאמוד את ההשפעה של אינהלציה של ROEO על התנהגות העכברים, במיוחד בכל הנוגע לדחק, בוצע TST. ה- TST מהווה שיטה מוכרת ונפוצה למדידת דחק אצל עכברים ואת תגובותיהם לנוגדי-דיכאון, כאשר זמן האי-מוביליות נחשב כמדד התנהגותי של יכולת העכברים להתמודד עם גירויים מעוררי דחק. כפי שנתין לראות באיור 1a, טיפול של ROEO ב- 50 μl/day ו- 100 μl/day הפחית את זמן האי-מוביליות ל- 20.13 s ו- 8.92 s, בהתאמה, בהשוואה לקבוצת הבקרה (76.17 s). זמן האי-מוביליות הממוצע של קבוצת שמן השקדים (AL) לא היה שונה באופן מובהק בהשוואה לבקרה (61.75 s) בעוד שה- LAEO הפחית אותו ל- 17.36 s. ניתוח ההשוואה הזוגית חשף כי ה- LAEO, הבקרה החיובית, לא היה שונה באופן מובהק מ- 50 ו- 100 μL ROEO (P = 0.59 ו- 0.53, בהתאמה). ניתוח השונות הראה הבדלים מובהקים בזמן האי-מוביליות בין קבוצות הטיפול (P = 0.0076). משקל הגוף והמצב הבריאותי הכללי של העכברים וכמות המזון שנצרך נמדדו במהלך המחקר ולא נמצאו הבדלים מובהקים בקרב כל הקבוצות.

איור 1: ההשפעות של ROEO על זמן האי-מוביליות של עכברים ב- TST, ועל רמת הסרום קורטיקוסטרון. a) ההשפעה של ROEO על זמן האי-מוביליות של העכברים ב- TST. העכברים שאפו את ה- EOs 30 דקות כל יום, במשך שבועיים. הנפח של ה- EO בכל ניסוי היה 100 μl עבור AL ו- LAEO, ו- 50 או 100 μl עבור ROEO. במהלך האינהלציה בת השבועיים של EO, ה- TST בוצע בכל יומיים ומדד את זמן האי-מוביליות ב- 4 הדקות האחרונות של סשן ה- TST שנמשך 6 דקות. הנתונים מייצגים את התוצאה הממוצעת של ה- TST שבוצע ביום האחרון של הניסוי. כל תוצאה מייצגת את הממוצע ± סטיית תקן (n = 5). * P ≤ 0.05. ** P ≤ 0.01 מול הבקרה. b) ההשפעה של ROEO על רמת הסרום קורטיקוסטרון בעכברים. בסוף תקופת השבועיים של אינהלציה של EO, העכברים הוקרבו ונאסף הסרום. רמת הסרום קורטיקוסטרון כומתה בעזרת ערכת ELISA כפי שתואר בחומרים ושיטות. הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן (n = 3). * P ≤ 0.05. ** P ≤ 0.01 מול הבקרה.

ה- ROEO מאפנן את הפעילות של ציר HPA ורמת הקטקולמין במוח in vivo

לאחר שהבחנו בהפחתה של זמן האי-מוביליות, רצינו לוודא האם מדובר בתוצאה של השפעות כלשהן של ה- ROEO על פעילות ציר ה- HPA. רמת סרום קורטיקוסטרון גבוהה באופן כרוני מצביעה על היפר-אקטיביות של ציר ה- HPA, העשויה לגרום להתנהגויות דמויות-דיכאון, המגבירות את זמן האי-מוביליות ב- TST. קורטיקוסטרון הוא הורמון הקשור בדחק המופרש כאשר ציר ה- HPA עובר אקטיבציה. רמות הקורטיקוסטרון של קבוצות העכברים שטופלו עם 50 μl/day או 100 μl/day של ROEO היו 33.8 ng/ml ו- 35.3 ng/ml בהתאמה (איור 1b). ההשפעה הייתה בלתי מובהקת עבור קבוצת ה- AL (43.1 ng/ml) בהשוואה לקבוצת הבקרה (44.2 ng/ml). עבור קבוצת ה- LAEO, רמת הקורטיקוסטרון הייתה 31.38 ng/ml. עכברים ששאפו 50 μl/day ו- 100 μl/day של ROEO ו- LAEO הציגו רמת קורטיקוסטרון נמוכה באופן מובהק בהשוואה לקבוצת ה- AL. ה- ROEO בטיפול של 50 μl/day הציג רמת קורטיקוסטרון נמוכה יותר בהשוואה ל- LAEO והיה האפקטיבי ביותר מבין קבוצות אלו. רמות הדופמין, הנוראדרנלין והאדרנלין במוחם של העכברים היו גבוהות אף הן, ומוצגות בטבלה 2.

טיפול של ROEO ב- 50 μl/day ו- 100 μl/day הציג רמת DOP משופרת באופן מובהק בהשוואה לבקרה (333.86 ng/100 mg). ל- AL לא הייתה השפעה מובהקת על רמות הנוירוטרנסמיטורים. בדומה ל- ROEO, ה- LAEO שיפר גם הוא את רמת ה- DOP. בהשוואה ל- LAEO (792.03 ng/g) שתי קבוצות הטיפול ב- ROEO הציגו ריכוז DOP נמוך יותר (653.56 ng/100 mg ו- 765.53 ng/100 mg עבור 50 μl/day ו- 100 μl/day, בהתאמה). בנוגע לרמות ה- NAD, לא נצפתה השפעה מובהקת בקבוצת ה- ROEO (507.36 ng/100 mg ו- 46.64 ng/100 mg ב- 50 μ/day ו- 100 μl/day, בהתאמה) אך נצפה שיפור מובהק בקבוצת ה- LAEO (55.29 ng/100 mg) בהשוואה לקבוצת הבקרה (44.31 ng/100 mg). בנוגע ל- ADR, קבוצת ה- ROEO לא הציגה שינוי מובהק (0.35 ng/100 mg ו- 0.34 ng/100 mg ב- 50 μl/day ו- 100 μl/day ROEO, בהתאמה) בדומה לקבוצת ה- LAEO (0.44 ng/100 mg LAEO) בהשוואה לקבוצת הבקרה (0.33 ng/100 mg). שתי קבוצות טיפול ה- ROEO הציגו רמה נמוכה יותר של ADR בהשוואה ל- LAEO. אינהלציה של ROEO (50 μl/day ו- 100 μl/day) הובילה להשפעות מובהקות על רמת ה- DOP סרום מוח. תוצאות ה- ANOVA הראו הבדלים מובהקים ברמות ה- DOP בין שתי הקבוצות (טבלה 2).

טבלה 2: רמות הקטקולמין, דופמין (DOP), נוראדרנלין (NAD) ואדרנלין (ADR) במוח העכברים (רקמת מוח ng/100 mg).

הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן. * P ≤ 0.05. ** P ≤ 0.01 מול הבקרה. a P ≤ 0.01 הבדל מובהק בין הקבוצות. b אין הבדל מובהק בין הקבוצות (ANOVA).

ROEO מעודד פעילות AChE ואפרגולציה של ביטוי Gap43 mRNA בתאי PC12

רמות קורטיקוסטרון ודופמין משופרות, העשויות לנבוע מהתמיינות עצבית, נצפו בעקבות אינהלציה של ROEO. על מנת לוודא כי ה- ROEO הוביל להתמיינות העצבית, נקבעה פעילות ה- AChE והביטוי של Gap43 mRNA בתאי PC12. ראשית, נקבע הריכוז הנון-ציטוטוקסי של ה- ROEO באמצעות נוהל MTT. תאי ה- PC12 טופלו עם וללא ROEO (0, 5, 10, 50 ו- 100 μg/ml) במשך 48 שעות. תוצאות ה- MTT הראו כי ה- ROEO היה בלתי ציטוטוקסי בריכוזים נמוכים (5 ו- 10 μg/ml) אך היה ציטוטוקסי במקצת ב- 50 ו- 100 μg/ml, וגרם להפחתת ויאביליות התא ל- 97% ו- 81.41% עבור 50 ו- 100 μg/ml ROEO, בהתאמה.

הסינתזה וההפרשה של נוירוטרנסמיטורים הם אירועים משמעותיים הקשורים בהתמיינות עצבית. בתאי PC12, ההפרשה של ACh מתעוררת עקב אינדוקציה של התמיינות תאי PC12. טיפול של μg/ml ROEO הגביר את פעילות ה- AChE ב- PC12 (124.16%( בהשוואה לבקרה (100%) ול- 50 ng/ml NGF (116.36%( (איור 2b). מכיוון ש- ACh מופק מכולין מעוכל (Ch) ומכולין ממוחזר בסינפסה, קבענו לאחר מכן את הריכוז התוך-תאי של ACh ואת הסובסטרט Ch שלו באמצעות HPLC-ECD. כפי שניתן לראות בטבלה 3, ה- ROEO מגביר את רמת ה- ACh וה- Ch התוך-תאית ל- 11.88 ng/mg ו- 2645.49 ng/mg, בהתאמה. כפי שצפינו, ה- NGF הגביר את רמת ה- ACh (11.99 ng/mg) וה- Ch (2660.6 ng/mg) התוך-תאית בהשוואה לבקרה. הבקרה הציגה רמות ACh ו- Ch של 9.51 ng/mg ו- 2156.21 ng/mg, בהתאמה.

בכדי להמשיך ולחקור את ההשפעות של ROEO על ההתמיינות העצבית, נקבעו רמות ביטוי הגנים של חלבון 43 הקשור בגדילה (Gap43). תוצאות PCR בזמן-אמת כמותיות הראו כי טיפול NGF הפחית באופן מובהק את ביטוי ה- Gap43 ב- 38% באמצעות ROEO וב- 57.37% בהשוואה לבקרה (איור 3a). טיפול ROEO (10 μg/ml) וטיפול NGF (50 ng/ml) עורר את תאי ה- PC12 לעבור התארכות תולדה עצבית, כפי שניתן לראות באיור 3b. על מנת לאמוד את ההשפעה של ROEO על התמיינות תאי PC12 in vitro, תאים בהתמיינות NGF טופלו עם ROEO וההשפעה שלו על ביטוי ה- AChE נאמדה. נוהל ה- AChE הראה כי בהשוואה לבקרה (תאים ללא טיפול), תאים ממוינים (+NGF) שטופלו עם 10 μg/ml ROEO הגבירו באופן מובהק את פעילות ה- AChE ב- 40.7%, בעוד שטיפול ב- NGF לבדו או טיפול ROEO הגבירו את פעילות ה- AChE ב- 12.9% ו- 21.5% בלבד, בהתאמה (איור 4).

איור 2: ההשפעה של ROEO על שגשוג תאי PC12 ופעילות האצטילכולין-אסטראז. a) ההשפעה של ROEO על ויאביליות תאי PC12. תאי ה- PC12 נזרעו על פלטות 96-well בדחיסות של 1X105 cells/ml. לאחר אינקובציה במשך הלילה, התאים טופלו עם 0, 5, 10, 50 או 100 μg/ml ROEO במשך 48 שעות ו-ויאביליות התאים נאמדה בעזרת נוהל MMT. הנתונים מוצגים כאחוז של הבקרה ומייצגים את הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים ± סטיית תקן. * P ≤ 0.05 מול הבקרה. b) ההשפעה של ROEO על פעילות האצטילכולין-אסטראז (AChE) בתאי PC12. תאי ה- PC12 נזרעו על פלטות 96-well בדחיסות של 1X105 cells/ml. לאחר אינקובציה במשך הלילה, התאים טופלו עם 50 ng/ml של NGF או 10 μg/ml של ROEO במשך 48 שעות. הבקרה מציגה תאים שעברו אינקובציה במשך 48 שעות ללא טיפול NGF או ROEO. פעילות ה- AChE מתבטאת כאחוז של הבקרה. הנתונים מייצגים ממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים ± סטיית תקן. * P ≤ 0.05. ** P ≤ 0.01 מול הבקרה.

טבלה 3: רמת האצטילכולין (ACh) והכולין (Ch) התוך-תאית בתאי PC12 (ng/mg).

הנתונים מייצגים ממוצע ± סטיית תקן. * P ≤ 0.05. ** P ≤ 0.01 מול הבקרה.

דיון

הביקוש לתרופות תרפויטיות לריפוי ומניעה של מחלות נוירולוגיות ומנטאליות עלה לאחרונה בעיקר עקב העובדה כי רוב התרופות הנצרכות אוראלית כוללות תופעות לוואי שליליות. אחד הטיפולים החלופיים הזוכה לפופולאריות רבה הוא אינהלציה של שמנים אתריים וחומרי ריח, אשר על פי הדיווחים מציגים פוטנציאל להשפעות תרפויטיות על ההתנהגות, ועל רמות הסרום קורטיקוסטרויד והנוירוטרנסימטורים במוח. במחקר הנוכחי, נאמדו ההשפעות של ROEO על מערכת התגובה לדחק, כולל ציר ה- HPA והנוירוטרנסמיטורים במוח. נמצא כי רוזמרין רפואי גורם לאקטיבציה של פעילות כולינרגית, בנוסף להשפעות נוירו-פרוטקטיביות ונוגדות-דיכאון. תוצאות ה- TST חשפו כי ה- ROEO מסוגל להפחית באופן מובהק את זמן האי-מוביליות של עכברים ב- 50 שניות לפחות, בהשוואה לעכברי הבקרה (איור 1a). השפעה דומה נצפתה אצל העכברים שנחשפו לאחת מהבקרות החיוביות, LAEO (17.36 שניות), והשפעה זו יוחסה ללינאלול(-), אחד הרכיבים האקטיביים שלו המסוגל להפחית את זמן האי-מוביליות של העכברים ב- TST. ה- TST ומבחן שחייה כפוי (FST) הם מבחנים התנהגותיים מוכרים לאומדן פעילות נוגדת-דיכאון. ה- TST נבחר בכדי לאמוד את ההשפעות של ROEO מכיוון שהוא כולל מספר יתרונות בהשוואה ל- FST. ב- FST, ההבדלים ביכולת השחייה של כל עכבר עלולים להשפיע על התוצאות, ובנוסף עלולה להיגרם היפותרמיה. באמצעות ה- TST, מספר תרופות נוגדות-דיכאון או תרופות אנקסיוליטיות נמצאו כמפחיתות את האי-מוביליות ועודדו התנהגות הקשורה בבריחה. זמן האי-מוביליות המופחת שנצפה בעקבות אינהלציה של ROEO ו- LAEO מלמד כי הם כוללים בנוסף השפעות נוגדות-דיכאון.

ציר ה- HPA הינו מערכת תגובה עיקרית כנגד סטרסורים הממלאת תפקיד מרכזי בפתופיזיולוגיה של מחלות מנטאליות הקשורות בדחק. דחק כרוני נובע מרמות גבוהות של גלוקוקורטיקואידים כאשר ההיפר-אקטיביות של ציר ה- HPA מפעילה מספר מנגנוני רגולציית משוב אדפטיבית פסיכולוגיים. ה- ROEO הפחית את רמת הסרום קורטיקוסטרון בדומה ל- LAEO (איור 1b) ותוצאה זו מלמדת כי ROEO מדכא את הפעילות של ציר ה- HPA שגברה בעקבות דחק ה- TST.

ה- ROEO ויסת את רמת הקטקולמין במוח, והגביר באופן מובהק את רמת ה- DOP בלבד, בעוד שה- LAEO הגביר את רמות ה- DOP, NAD וה- ADR (טבלה 2), ממצא עקבי לדיווחים קודמים על LAEO. הפעילות של העצב הסימפטטי הינה חיונית להתמודדות עם דחק והיא מהווה חלק ממערכת התגובה לדחק. המחקרים בנושא ביססו את היחסים בין כמות הקטקולמין במוח לבין מחלות פסיכיאטריות, כשירידה ברמת ה- DOP בפרט נצפתה אצל אנשים הסובלים מדיכאון. רמות הקטקולמין במוח מלמדות כי ההשפעות נוגדות-הדחק של ROEO הן שונות מאלו של LAEO, ממצא המצביע על הבדל אפשרי במנגנון המעורב בתגובה לשמנים אלו. שיפור מובהק של הזיכרון נצפה אצל עכברים שטופלו ב- ROEO, אך לא אצל קבוצת ה- LAEO. שני השמנים האתריים, לעומת זאת, הציגו שיפור מובהק של הביצועים הקוגניטיביים ומצב הרוח אצל 144 מתנדבים בריאים. עם זאת, ההשפעה של LAEO עשויה להיות דומה יותר לזו של בנזודיאזפינים, בכך שהיא מגבירה את ההשפעות של חומצה גאמא-אמינובוטירית באזור האמיגדלה.

ניתן ליטול EOs באופן אוראלי או בזריקה תוך-צפקית, אך אינהלציה היא השיטה המועדפת בכל הנוגע לבטיחות ותועלת. חומרי ריח מגיעים למערכת העצבים המרכזית (CNS) דרך מערכת הנשימה והריח, ומציגים את התרופה באמצעות העברה אקסונלית או פעילות של הערוצים הפרינוירליים. תרופות אוראליות כוללות בדרך כלל טוקסיות אוראלית חמורה.

אפנון התפקוד של תאי עצב, כמו הולכה עצבית ופלסטיות סינפטית, קשור באופן ישיר לרגולציה של מערכות התגובה לדחק, וכתוצאה מכך מונע מחלות נוירולוגיות הקשורות בדחק. הפרשת-יתר של קורטיקוסטרון, לעומת זאת, מדכאת את הייצור של הגורמים הנוירוטרופיים NGF והגורם הנוירוטרופי המוחי (BDNF). ה- NGF וה- BDNF ידועים כמעוררי התמיינות עצבית אך אינם מסוגלים לחצות את המחסום דם-מוח (BBB) בקלות, ולפיכך, עוברים מטבוליזם על ידי פפטידאזות כאשר הם נצרכים באופן היקפי. עם זאת, כאשר הם נשאפים, חלק מהרכיבים הנמצאים ב- EOs יכולים להגיע ל- CNS, ממצא המלמד על אפשרות של אינהלציה של EOs בתור טיפול חלופי מוצלח יותר במחלות נוירולוגיות. חלק מהרכיבים הפעילים של ה- EOs העיקריים מסוגלים לפי המחקרים לעבור את ה- BBB, כולל האלפא-פינן הנמצא ב- ROEO. שאיפה של אלפא-פינן מביאה להשפעות אנקסיוליטיות אצל עכברים, ובתור אחד הרכיבים הפעילים ב- ROEO, אלפא-פינן תורם להשפעות הנצפות של שאיפת ROEO, אך עבור שאר התרכובות, ייתכן ואפקט סינרגטי של מספר תרכובות ב- EO תרם להשפעה.

ידוע כי תאי PC12 מתמיינים לתאים אוטונומיים דמויי-עצב, ומתפקדים בתור מפיקי נוירוטרנסמיטורים ומאריכי התולדה העצבית כאשר הם מטופלים בעזרת NGF או חומרים דמויי-NGF. במחקר זה, ה- PC12 שימש לאומדן ההשפעה של ROEO על ההתמיינות העצבית. ה- ROEO הגביר באופן משמעותי את רמות ה- ACh וה- Ch (טבלה 3). ה- ACh המופרש היה גבוה יותר אצל תאי PC12 ממוינים לאחר טיפול ROEO, ממצא המלמד כי הפעילות האנזימית של AChE נבעה מטיפול ה- ROEO (איור 2b). יש לציין בנוסף כי בתאי PC12 לא-ממוינים ה- ACh הוגבר על ידי ה- ROEO, גם ללא NGF המעורר התמיינות, ממצא המספק תמיכה נוספת בהשפעה מעוררת ההתמיינות שלו, המוצגת באיור 3b. בנתיב סינתזת ה- ACh, הספיגה של Ch, המווסתת על ידי הפעילות של כולין אצטיל-טרנספראז (ChAT), מהווה את הצעד מגביל המהירות (rate limiting step). הודגם כי פעילות ה- AChE מושפעת במודל בעלי-חיים של דחק, כך שעלייה ברמת ה- Ch וה- AChE התוך-תאית, לאחר אקטיבציה של AChE, הסינתזה וההפרשה המוגברת של ה- ACh נגרמו בשל השאיפה של ROEO (איור 2b).

חלבון 43 הקשור בגדילה (Gap43) הינו מארקר של התארכות התולדה העצבית מכיוון שהביטוי שלו קשור בהתמיינות עצבית, נוירו-פלסטיות והתארכות התולדה העצבית. ה- ROEO גורם לאפרגולציה של ביטוי ה- Gap43 ולפיכך, סיפק ראיה נוספת ליכולות שלו לגרום לאינדוקציה של התמיינות עצבית (איור 4). בנוסף, פעילות ה- AChE בתאי PC12 ממוינים גברה באופן מובהק לאחר טיפול ROEO, ממצא המצביע על יכולתו לעודד תפקוד כולינרגי בעקבות התמיינות עצבית. ה- ROEO קרוב לודאי גורם לאפקט דומה ל- NGF וניתן להניח כי המנגנון של ההשפעה של ROEO על תאי העצב ייתכן וקשורה לנתיבי תקשורת בתיווך-NGF, כמו ERK 1/2, PI3K/AKT, וחלבון קינאז C (PKC) שפעילותו נמצאה קשורה בהישרדות של תאי עצב קיימים והתמיינות תאי עצב. למרות שהתוצאות מראות שיפור מובהק ברמות הדחק של העכברים לאחר אינהלציה של ROEO, ניתן לשפר את יעילות תהליך הצגת ה- EOs על ידי שימוש במכשירים דמויי-מסכה על מנת להבטיח כי העכברים ייחשפו לכמות גדולה יותר של EOs.

איור 3: ההשפעה של ROEO על התארכות התולדה העצבית של תאי PC12. תאי ה-PC12 נזרעו על פלטות 96-well בדחיסות של 1X105 cells/ml. לאחר אינקובציה במשך הלילה, התאים טופלו עם 50 ng/ml של NGF או 10 μg/ml של ROEO במשך 48 שעות. תאי הבקרה עברו אינקובציה במשך 48 שעות ללא טיפול NGF או ROEO. a) ביטוי הורמון 43 הקשור בגדילה (Gap43) mRNA כומת באמצעות PCR בזמן-אמת ועבר נורמליזציה לביטוי Gapdh mRNA. הנתונים מייצגים ממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים ± סטיית תקן. * P ≤ 0.05. ** P ≤ 0.01 מול הבקרה. b) מורפולוגיה של תאי PC12 שטופלו ללא (בקרה) ועם 50 ng/ml NGF (NGF) או 10 μg/ml ROEO (ROEO). הצילומים נלקחו 48 שעות לאחר טיפול הדגימה והחצים מצביעים על תאים עם מורפולוגיה דנדריטית. צילומי התאים בהגדלה של 200X נלקחו בעזרת מיקרוסקופ ניגוד פאזות המצויד עם מצלמת DFC 290 HD. קנה המידה מייצג 50 μm.

איור 4: ההשפעה של ROEO על פעילות האצטילכולין בתאי PC12 ממוינים. תאי ה-PC12 נזרעו על פלטות 96-well בדחיסות של 1X105 cells/ml ועברו טרום-טיפול עם 50 ng/ml NGF במשך 24 שעות לפני הטיפול עם 10 μg/ml של ROEO במשך 48 שעות ללא (ROEO) או עם 10 ng/ml NGF (RO + NGF). פעילות ה- AChE מתבטאת כאחוז של הבקרה. הנתונים מוצגים כאחוז של הבקרה ומייצגים את הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים ± סטיית תקן. * P ≤ 0.05. ** P ≤ 0.01 מול הבקרה.

מסקנות

תוצאות מחקר זה מלמדות כי אינהלציה של ROEO מפיגה דחק על ידי הפחתת הסרום קורטיקוסטרון והגברת רמת ה- DOP במוח in vivo, ממצא המלמד כי ROEO מסוגל לווסת את הפעילות של ציר ה- HPA ומערכת העצבים הסימפטטית. בנוסף, in vitro, ה- ROEO מאפנן את פעילות הנוירוטרנסמיטורים במוח, וגורם לאפקט נוירו-פיזיולוגי הקשור לפעילות של הסינתזה וההפרשה של ACh, ומביא לאינדוקציה של התמיינות עצבית. העלייה בביטוי של Gap43 mRNA, בנוסף לעלייה בתגובה לדחק ובפלסטיות העצבית, מצביעות גם הן על התפקיד של ציר ה- HPA בהשפעות נוגדות-הדחק של ROEO. מבחנים קליניים עשויים להועיל באומדן התוקף של התוצאות בכל הנוגע לדיכאון קליני. התוצאות המוצגות כאן מראות כי ל- ROEO יש פוטנציאל לשימוש כטיפול חלופי בטוח בהפרעות מצב רוח הקשורות בדחק.