New Developments on the Adenosine Mechanisms of the Central Effects of Caffeine and Their Implications for Neuropsychiatric Disorders

התפתחויות חדשות במחקר על מנגנוני אדנוזין של השפעות קפאין והשלכותיהם עבור הפרעות נוירו-פסיכיאטריות    

תקציר:

מחקרים אחרונים על יחסי גומלין בין אדנוזין סטריאטלי לדופמין ואחד היעדים העיקריים שלו, ההטרומר אדנוזין A2A  קולטן – דופמין D2   (A2AR – D2R) , סיפקו הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בהשפעות הפסיכו-סטימולטיביות של קפאין וסיפקו נתונים חדשים על מנגנוני ההפעלה הקלאסיים של ליגנדים אורטוסטריים בתוך הטרומטרים של קולטני G מצויד-חלבון. להטרומר הסטריאטלי  A2AR – D2R יש מבנה טטרמרי ומהווה חלק ממערכת אותות מורכבת הכוללת את חלבון  Gs ו- Gi ואת האפקטור אדניל ציקלאז (תת סוגAC5 ). נדמה וליעד נוסף של קפאין, לאדנוזין A1 קולטן דופמין D1 קולטן (A1R-D1R) הטרומטר, יש מבנה דומה מאוד.  בעוד תחילה חשבו שמיקומו בסטריאטום, כיום ידוע שההטרומר A1R – D1R  זוהה במוטונוראון של עמוד השדרה והוכח כי הוא מתווך את התנועה המופקת על ידי קפאין.  במחקר זה נסקור את המאפיינים שהתגלו לאחרונה בהטרומרים   A2AR – D2R ו-  A1R-D1R. מחקרינו מראים כי מערכות מורכבות אלו הם תנאי הכרחי לקיום האינטראקציה האנטגוניסטית המסורתית בין קולטן המוצמד לחלבון Gs  (A2AR או D1R)  וקולטן המוצמד לחלבון Gi (D2R או A1R) ברמת אדניליל ציקלאז, המהווה מושג חדש בתחום הפיזיולוגי והפרמקולוגי של הקולטן המוצמד בחלבון  G.  אנטגוניסטים A2AR  המתמקדים בהטרומר A2AR – D2R הסטריאטלי נחשבים כבר כגורמים טיפוליים במחלת פרקינסון. במחקר זה נסקור עדויות קדם-קליניות המצביעות על כך שניתן להשתמש בקפאין ובאנטגוניסטים שלA2AR    לטיפול במוטיבציה של תסמיני דיכאון והפרעת קשב וריכוז, בזמן שאנטגוניסטים A1R המכוונים באופן סלקטיבי אל ההטרומר A1R – D1R בעמוד השדרה יכולים לבוא לידי שימוש בשיקום פגיעות בחוט השדרה.

מבוא

ההשפעות הפסיכו-ממריצות של קפאין מיוחסות מסורתית ליכולתו לפעול כאנטגוניסט לא סלקטיבי של קולטני אדנוזין. באופן יותר ספציפי, ההשפעות מחזקות הסטימולנטים שלו על התפקוד הפסיכומוטורי יוחסו בעיקר ליכולתו לחסום קולטני אדנוזין סטריאטלים A2A (A2AR), בעוד שהשפעותיו המעוררות נקשרו בעיקר לחסימה של קולטני A1 (A1R) המתווכים את בקרת השינה ההומאוסטטית של קפאין ואדנוזין. אף על פי כן, מדובר כאן בפשטנות יתר, מכיוון ש- A1R מעורבים גם בהשפעות הפסיכו-מוטוריות של קפאין ו- A2AR מעורבים גם בבקרת השינה בתיווך אדנוזין. נתוני ניסויים שהצטברו בשני העשורים האחרונים הוכיחו כי A2AR סטריאטלי יוצר הטרומרים עם קולטני דופמין D2 (D2R), הממוקמים באופן ספציפי באחד משני הנוירונים הסטריאטלים המוליכים, הנוירון הסטריאטופלידלי. למרות הפרשנות הראשונית של המנגנונים לפיה השפעתו של קפאין על איתות A2AR סטריאטלי היה כתוצאה מעיכוב תחרותי של קשירת אדנוזין ל- A2AR, מחקרים אחרונים מצביעים על תלות באינטראקציה אלוסטרית לא צפויה בתוך ההטרומר .A2AR – D2R.4

מחקרים אלה הציעו גם מבנה רבעוני ספציפי של ההטרומר, הטרורמר A2AR – D2R, מושג שלאחרונה אושר והורחב לקיומו של קומפלקס המוצמד מראש הכולל גם את האפקטור, אדניליל ציקלאז תת סוג  5 .(AC5) כמתואר להלן, ממצא מושגי חשוב ממחקר זה היה ההדגמה שתרכיב מקרומולקולרי זה מספק את המסגרת ההכרחית הדרושה לאינטראקציה המסורתית של Gi-Gs ברמת ה- AC, שמירה על היכולת של קולטן Gi-coupled (D2R) כדי לפעול נגד הפעלת AC המתווכת על ידי קולטן מצומד Gs  .(A2AR)תחילה הונח כי שתי אוכלוסיות משנה של A2AR סטריאטלי, היוצרות ולא יוצרות הטרומרים עם D2R , היו נחוצות כדי להסביר כמה ממצאים פרמוקולוגיים. מחקרים אחרונים, לעומת זאת, אפשרו לבחון מחדש את ההשערה הזו ולטפל מחדש בהשפעות הביוכימיות וההתנהגותיות של ליגנדים A2AR במסגרת אוכלוסייה עיקרית אחת של A2AR סטריאטלי, תרכיב ההטרוטטרמר A2AR – D2R – AC5 , הממוקם בנוירון הסטריאטופאליד.

עם זאת, קפאין לא נקשר רק אל התרכיב הסטריאטלי A2AR-D2R-AC5, אלא גם אל ה Gi-coupled A1R הממוקם בנוירון הסטריאטוניגראלי, היוצר הטרומרים עם Gs מוצמד קולטן דופמין D1  (D1R) ובנוסף, קפאין נקשר להטרומרים של A1R – A2AR מקומי בטרמינלים הגלוטמטרגים הקורטיקוסטריאטליים. לכן, מטרות סטריאטליות נוספות אלה תורמות גם להשפעות התרופתיות של קפאין. בצורה מעניינת, ה- A1R – D1R לאחרונה נמצא באזור אחר של מערכת העצבים המרכזית, בחוט השדרה, שם הוא ממלא תפקיד חשוב במודולציה של הרגישות הפנימית של המוטונוירון בחוט השדרה (MN).  באופן מובהק, כפי שנסקר במחקר זה, ההטרומר A1R – D1R ממלא תפקיד מרכזי בלוקומציה של חוט השדרה הנוצרת על ידי קפאין.

מחקרי תרגום ראשוניים על טיפול אפשרי באמצעות קפאין ואנטגוניסטים סלקטיסיים ל- A2AR המייעדים את A2AR סטריאטלי היו מכוונים לטיפול באקינזיה במחלת פרקינסון. מחקרים אלו לוקחים במובלע בחשבון הטרומרים A2AR-D2R הממוקמים בסטריאטום הגבי, בעוד שמספר רב של מחקרים נוספים הראו את אותה נוכחות של A2AR ו-D2R בגרעין האקומבנס, בנוירון הסטריאטופאליד הגחוני, המצביעה על הטרומרים A2AR-D2R בהיבטים מוטיבציוניים נוספים של גרעיני הבסיס. כפי שנסקר במחקר זה, עם יעד נוסף זה, היישום הקליני האפשרי של קפאין ואנטגוניסטים A2AR מתרחב ל”אדישות “, או” א-נרגיה”, סימפטום שלילי משמעותי של מספר הפרעות נוירו-פסיכיאטריות, הכוללות דיכאון, סכיזופרניה, הפרעות בשימוש חומרים, וגם מחלת פרקינסון. לבסוף, תוצאות ניסויים אחרונים אצל חולדות היפרטנסיביות ספונטנית (SHR), המהווה מודל ל-ADHD  גרם לנו לחזור אל לתפקיד התרפויטי האפשרי של קפאין ושל אנטגוניסטים  A2AR לשם טיפול בהפרעה זו.

מנגנונים מולקולריים של ההשפעות הפסיכו-סטימולנטיות של הקפאין: התרכיב הסטריאטלי

A2AR-D2R Heterotetramer-AC5

מחקרים אחרונים על אינטראקציות בין אדנוזין סטריאטלי ודופמין ואחד היעדים העיקריים שלו, הטרומר A2AR – D2R, לא שיפרו את ההבנה של המנגנונים המעורבים בהשפעות הפסיכו-סטימולנטיות של קפאין, אבל הם כן הביאו נתונים חדשים ואפילו קונטרה-אינטואיטיביים על המנגנונים של הפעלת ליגנדים אורתוסטריים קלאסיים בתוך הטרומרים של קולטן המצומד חלבון  G (GPCR). ראשית, יש את ההדגמה של המבנה ההטרוטטרמרי של ההטרומר A2AR – D2R המשתמש בכמה טכניקות ביו-פיזיות ומבוססות נוגדנים בהעברת תאים יונקיים מועברים ותאים סטריאטלים בתרבית. ההטרומר A2AR – D2R  מורכב מ-הומודימרים מסוג A2AR ו-D2R  כאשר ארבע יחידות הקולטן (פרוטומרים) יוצרות תצורה ליניארית; שני פרוטומרים  פנימיים, A2AR ו- D2R,  יוצרים את הממשק ההטרומרי ושני החיצוניים מזדווגים ליחידת משנה אלפא של כל אחד מחלבוני ה-G שלהם בהתאמה (חלבון G אחד להומודימר), Gs  (ליתר דיוק Golf) עבור ה- A2AR ו- Gi עבור ה- .D2R סידור זה מאפשר צימוד מראש של הטרוטרמר עם האפקטור AC5 וכאמור לעיל, מספק את המסגרת לאינטראקציה האנטגוניסטית של האגוניסטים A2AR ו- D2R ברמת ה- AC (איור 1) .

הטופולוגיה של AC5 כוללת תחום מסוף N ארוך (NT), אשר ידוע להיקשר ליחידות משנה בתא-גמא של חלבוני G, שני תחומים קטליזים ציטופלזמיים גדולים כמעט זהים (C1 ו- C2), הנקשרים זה לזה ויוצרים את הליבה הקטליטית בממשק שלהם, ושני תחומי קרום, M1 ו- M2, כל אחד מהם עם שישה תחומי טרנס-ממברניים (TMs). יחידת המשנה -Gsאלפא  יכולv להיקשר ל- C2, מה שמגביר את הזיקה בין C1  ו- C2, מקדם קטליזה, ואילו Giאלפא נקשרת ל C1  ויש לה את ההשפעה ההפוכה. הסידור הכמעט סימטרי  של C1 ו- C2 מאפשר קישור בו זמנית של Gsאלפא ו- Giאלפא, לכן האינטראקציה האנטגוניסטית המסורתית. השימוש בפפטידים סינתטיים עם רצף חומצות אמינו של כל ה- TM של ה- A2AR, D2R, ו- AC5, עם יכולתם להפריע לאינטראקציות בין-מולקולריות (ממשקים), סיפק כלי יסודי כלי להדגים, ראשית, את המבנה הרבעוני של מתחם התרכיב ההטרוטטרמרי  AC5 A2AR – D2R במצבו הלא פעיל. הצלחנו להדגים, בפעם הראשונה, את התפקיד הפונקציונלי של ה- AC5 TMs : יכולתם לבסס אינטראקציות בין מולקולריות עם .GPCR   TMs

דגמים ממוחשבים הצביעו על כך שעל מנת לאפשר את האינטראקציה המסורתית, על התרכובת הפונקציונאלית המינימאלית של A2AR-D2R-AC5 להכיל לפחות שתי מולקולות של הטרוטטרמרים המתחלפים בשתי מולקולות של AC5 (איור 1 א). באופן זה, במצב הלא פעיל של מתחם תרכובת ההטרוטטרמרAC5- A2AR – D2R  קובע אינטראקציות ישירות של TM עם קולטן אחד ואינטראקציות תוך תאיות עקיפות עם הקולטן האחר דרך צימוד NT ליחידות משנה בתא-גמא. שנית, נוכל גם להדגים את השינויים הדינמיים הנגרמים על ידי הליגנד של מבנה רבעוני זה. בעיקרון, האגוניסט אינו גורם לשינוי בממשקים ההומודימרים  וההטרודימרים, ובכך מותיר את המבנה הרבעוני של ההטרוטטרמר A2AR – D2R שלם. מצד שני, ליגנדים גורמים לסידור מחדש משמעותי של ממשקי הקולטנים עם AC5, המאפשר אינטראקציה בו זמנית של יחידות המשנה אלפא של Gs ו- Gi עם התחומים הקטליטיים המקבילים של AC5 (איור 1B) . הסידור מחדש משתלב עם התנועה היחסית הנגרמת על ידי הליגנד של בתא-גמא מיחידות המשנה של חלבון G. לפיכך, יחידות המשנה בתא-גמא בדרך כלל חוסמות את אתר האינטראקציה של יחידת המשנה עם התחום הקטליטי המתאים של AC5, והתנועה של בתא-גמא משחררת את אתר האינטראקציה ובו זמנית מושכת ומקרבת את  AC5  ליחידת המשנה אלפא.

ברמה כללית יותר, ההתקדמות בידע שלנו של המבנה המולקולרי הדינמי של ההטרוטרמר A2AR – D2R  מייצג את  ה”קידום” של המשמעות התפקודית של הטרומרי הקולטן. מסורתית, הונח שאינטראקציות בין קולטנים ברמת AC שייכות לאינטראקציות במורד הזרם, הנקראות גם אינטראקציות ” רמת השליח השני.” תוצאות אלו מרמזות על כך שהאינטראקציה המסורתית של Gi – Gs ברמת AC היא תכונה פונקציונלית של הטרומר GPCR . למעשה, פפטידים TM המערערים באופן מיוחד את ההטרומריזציה של A2AR – D2R  ביטלו לחלוטין את האינטראקציה המסורתית, היכולת של אגוניסטים D2R להתנגד להפעלת AC בתיווך A2AR.

ממצא פרמקולוגי פורץ דרך נוסף במסגרת ההטרומר A2AR – D2R הייתה להבין את היכולת של קפאין ואנטגוניסטים A2AR  לנטרל כמה השפעות ביוכימיות והתנהגותיות של אדנוזין, או ליתר דיוק, אגוניסטים מסוג A2AR אינם תלויים בתחרות הקלאסית לאותו אתר אורטוסטרי ב- A2AR. באופן מפתיע, פעולת הנגד תלויה בתפוסה הבו-זמנית של שני האתרים האורטוסטרים של דימר A2AR של ההטרוטרמר A2AR – D2R.  בעת ביצוע ניסויי בקרה עם קשירת-רדיוגנדים, מצאנו כי אנטגוניסטים מסוג A2AR, כולל קפאין, הם בעלי תכונות אלוסטריות זהות לאגוניסטים מסוג A2AR על קשירת אגוניסט D2R. אותו דבר אשר נמצא תחילה עבור אגוניסטים ,A2AR  גם קפאין ואנטגוניסטים A2AR מיקמו מחדש את הקשירה של אגוניסט D2R  טריטיאדי מהכנות ממברנה תאים יונקיים מועברים אם סטריאטום יונקי, מה שהפחית את הזיקה שלו.  פירוש הדבר הוא שכל ליגנד, אגוניסט או אנטגוניסט A2AR, גורם לאפנון אלוסטרי שלילי של אגוניסטים D2R בהטרומר .A2AR – D2R

אך פרשנות זו אתגרה את ההיפותזה שניסחנו קודם לכן  של מעורבות המפתח של אפנון אלוסטרי שלילי בין A2AR ל- אגוניסטים D2R בהשפעות הדיכאוניות המוטוריות של  אגוניסטים A2AR וההשפעות המפעילות-מוטורית של קפאין ואנטגוניסטים מסוגA2AR . מכאן שעלינו לצפות באופן הגיוני שאגוניסטים ואנטגוניסטים A2AR יראו תוצאות ביוכימיות הפוכות. למעשה, בניסויי patch-clamp   זיהינו נוירונים סטריאטופאלידים, הראינו כי אנטגוניסט A2AR חוסם את היכולת של אגוניסט A2AR  כדי לנטרל עיכוב הנגרם על ידי אגוניסט D2R של התרגשות העצבית. עם זאת, השגנו ממצא מעודד בלתי צפוי: כאשר מיושמים יחדיו, אגוניסטים אנטגוניסטים של A2AR פעלו נגד ההשפעות של האחר.  בריכוזים נמוכים, קפאין ואנטגוניסטים מסוג A2AR נגדו את ההשפעה של אגוניסט A2AR על קשירת אגוניסט D2R, אך עם ריכוזים גבוהים הם גם גרמו לירידה משמעותית בקשירת אגוניסט D2R.

תוצאות הניסוי יסכימו לחלוטין  עם נוכחותן של שתי מולקולות קשורות של A2AR, הומודימר של A2AR, בהטרומר של A2AR-D2R, אשר יכול לקיים אפנון הומומרי אלוסטרי שלילי בין אגוניסט אורטוסטרי A2AR ו אנטגוניסט אורטוסטרי A2AR. תפיסת המקום של ההומודימרA2AR  עם אגוניסט או אנטגוניסט גורם לאפנון הטרומרי אלוסטרי שלילי של האגוניסט D2R  ומפחית את יכולת הקשירה וההשפעה שלו. אבל תפיסת מקום משולבת של ההומודימר A2AR  עם אגוניסט ואנטגוניסט, בגלל האפנון ההומומרי אלוסטרי השלילי בין שני הליגנדים A2AR , מונע האפנון ההטרומרי אלוסטרי.

האפנון האלוסטרי ההומומרי השלילי בין אגוניסטים A2AR ואנטגוניסטים, ולכן האופי הדימרי של ה- A2AR, אושר באמצעות ניסויי דיסוציאציה עם אנטגוניסט A2AR טריטיאדי בתכשירי קרום סטריאטלי. אגוניסט A2AR, אך לא קפאין או אנטגוניסט A2AR, שינה באופן משמעותי את קצב הדיסוציאציה של האנטגוניסט, המציין את נוכחותה של אינטראקציה אלוסטרית ספציפית בין אגוניסט A2AR ואנטגוניסט A2AR טריטיאדי. נוכל גם להדגים את המשמעות התפקודית של האפנון האלוסטרי ההומומרי השלילי באמצעות אותה גישה לניסויי patch-clamp השמשה בעבר להדגמת האפנון האלוסטרי ההטרומרי השלילי בין אגוניסטים A2AR ו- D2R בנוירון סטריאטופלידי . לפיכך, אותו אנטגוניסט A2AR  אשר מנגד את השפעתו של אגוניסט A2AR, כשהוא מיושם לבד, גם נוגד עיכוב הנגרם על ידי אגוניסטD2R  של התרגשות הנוירון הסטריאטופלידי.

התוצאות שלנו מצביעות אפוא על כך שקפאין אנטגוניסטים סלקטיביים מסוג A2AR מייצרים אפקטים פסיכו-סטימולנטים, לא רק על ידי התחרות עם אדנוזין על קשירת A2AR, אך גם על ידי הפעלת אפנון אלוסטרי שלילי בתוך הומומר ה- A2AR של ההטרוטרמר A2AR – D2R. בתנאים רגילים, באמצעות אפנון אלוסטרי הטרומרי שלילי, אדנוזין אנגוני מעכב בצורה טונאלית בתיווך הפעלה פסיכו-מוטורית על ידי הפעלה טונית של D2R על ידי דופמין אנדוגני. קפאין, באמצעות אפנון הומומרי אלוסטרי שלילי, נוגד את השפעת האדנוזין ומייצר הפעלה פסיכו-מוטורית.

ידוע כי מינונים גבוהים של קפאין מייצרים דיכאון פסיכו-מוטורי. על פי המודל שלנו, זה נובע מיכולתו של קפאין לעקור לחלוטין אדנוזין אנדוגני ולגרום לאפנון הטרומרי אלוסטרי שלילי של קשירת דופמין אנדוגנית ל- D2R. נוכל להדגים את ההשערה שלנו עם ניסויים של פעילות תנועתית בחולדות עם ניהול משותף של אגוניסט A2AR CGS 2180 ואנטגוניסט  A2AR , KW-6002 (istradefylline), בוא נעשה שימוש במחלת בפרקינסון. מינונים נמוכים של KW-6002 ייצרו תנועה לוקומוטיבית, ואילו מינונים גבוהים ייצרו דיכאון תנועתי. באופן משמעותי, כפי שציפינו, מנה של CGS 21680 המייצרת דיכאון כאשר ניתנת לבד נגדה את הדיכאון התנועתי שנגרם מהמינון הגבוה לדיכאון תנועתי של KW-6002.

תנועה המופקת באמצעות קפאין הנוצרת בעמוד השדרה:

Heteromer השדרה A1R – D1R

אדנוזין משמש גם כמאפנן פנימי הנחשב כבעל תפקיד חשוב ביצירת תנועה ריתמית ספינלית. הוכח  שאדנוזין הנובע בגליאל (glial) יכול לווסת רשתות מוטוריות בעמוד השדרה בעכברים על ידי הכלה של עיכוב העברה עצבית. במחקר זה, יישום אדנוזין הביא להפחתה בתדירות הפעילות התנועתית שנרשמה בשורשים ונטראליים. מצד שני, היישום של אנטגוניסט קולטן אדנוזין לא סלקטיבי תאופילין או אנטגוניסט A1R סלקטיבי, אך לא A2AR סלקטיבי אנטגוניסט, גרם לעלייה בתדירות התפרצות התנועה, מה שהדגים את כך  אדנוזין נגזר אנדוגנית מפעיל A1Rs במהלך פעילות רשת התנועה. מאחר שההשפעה של תאופילין נפגעה על ידי רעלים גליאליים, מחקר זה הצביע על כך שאיתותים פורינרגיים אנדוגמיים גליאליים (באמצעות הפעלת A1R) חשובים לאפנון הפנימי של תדר המחזור של פעילות תנועתית ביונקים.

אותה קבוצת מחקר בחנה את השפעות היישום של אדנוזין לאינטרנוירונים (INs) ו- MNs של החוט המותני של העכבר. על ידי פעולה בעיקר דרך A1R, INs שעברו היפרפולריזציה אדנוזינית הפחיתו את התדירות והחוזק של הקלט הסינפטי שלהם.  מצד שני, יישום האדנוזין גרם לדה-פולריזציה של MNs תוך הפחתת התדירות והחוזק של הקלטים הסינפטיים. תוצאות אלה הציעו השפעה דיפרנציאליות של A1R בתיווך אדנוזין בחוט השדרה של העכבר, עם פעולת דיכוי כללית על INs קרן גחון היכולה לשמור התרגשות MN. הוצע כי השפעות דיפרנציאליות אלה בINs ו- MNs עשויות לאפשר התאמה של דפוס התנועה שנוצר על ידי רשתות פנים עצביות תוך כדי עזרה להבטיח שמירה על תפוקה מוטורית כוללת.

לאחרונה ביצענו ניסויים בקפאין וליגנדים A1R סלקטיביים להבנת המנגנונים הספציפיים של אפנון A1R על מחולל התבנית המרכזי  (CPG). תוספת של קפאין או אנטגוניסט A1R על גבי תנועה פיקטיבית מתמשכת הגדיל משמעותית את תדירות המחזור תוך צמצום משך פרץ תפוקת MN. תוצאה זו  הציעה כי ה- A1R הוא היעד העיקרי של השפעות האפנון הספינלי של קפאין. כמו כן, קפאין ואנטגוניסט  A1R  לא הצליח לעורר פעילות תנועתית מתמשכת בהיעדר דופמין או בנוכחות אנטגוניסט D1R , אשר תומך במנגנון תלוי  A1R – D1R של פעולה. קפאין ואנטגוניסט ה- A1R הסלקטיבי לא הצליחו לעורר קצב תנועה מתמשך בנוכחות מעכב של חלבון תלוי   cAMP kinase A  (PKA). בסך הכול, תוצאות אלו הציעו השפעה ממריצה של קפאין על בקרת ה- CPG המותני על תנועה בגפיים האחוריות באמצעות עיכוב של A1Rs והפעלה לאחר מכן של D1R דרך מנגנון אינטרה-תאי תלוי PKA.

מחקר זה הוביל לניסויים האחרונים שלנו, אשר הוכיחו כי ההטרומריזציה של ה- Gi-coupled A1R עם  ה-  Gs- coupled D1R  התרחש ב MNs הספינלים של עכברים נאונטלים. המיקום התאי של קולטני ההטרומרים הפוטנציאלים אושר לראשונה באמצעות נוגדנים המכוונים לכיוון A1R ו- D1R פוסטנטלי פרוסות חוט השדרה המותני של העכבר  0–5 (P0 – P5) פוסטנטלי, לוקליזציה של הרשת השולטת בתנועת הגפיים האחוריות. שכבת-על של החיסון A1R ו- D1R אישרה שתיוג משותף של שני הקולטנים נמצא בעיקר בתוך MNs המותניים, שזוהו חזותית לפי המיקום, הגודל והאשכול שלהם.

מחקרים קודמים כבר קבעו כי קולטנים דמויי D1 (D1R ו- D5R) וקולטנים דמויי D2 (D2R, D3R, ו- D4R) מופרדים בעיקר בחוט השדרה ושהם ממלאים תפקידים מאפננים  מנוגדים על CPG ספינלי של תנועה. למרות שיש הבדלים בין המינים, בעכבר, קולטנים דמויי D2 באים לידי ביטוי גבוה בלמינה I – II של הקרן הגבית, שם הם מתווכים אפקטים מעכבים. מצד שני, קולטנים דמויי D1 מקבלים ביטוי גבוה בקרן הגחון, בלמינה IX, כולל ה- MNs, שם הם מתווכים השפעות מעוררות.

עם סדרת ניסויים מקבילים תוך שימוש בטכניקות ביו-פיזיות מבוססות נוגדנים בהעברת תאי יונקים נוכל להוכיח כי A1R ו- D1R יוצרים הטרומרים עם חלבוני G המשויכים שלהם, ובכך תומכים בתכונות מבניות ופונקציונליות דומות מאוד המאפיינות את ההטרומרים A2AR – D2R. למעשה, ניסויים אלה הראו אינטראקציה ברמת ה- AC, שכן היכולת של Gi-coupled A1R לנטרל הפעלת AC Gs+coupled D1R בשילוב D1R יכולה להיתקל בהתנגדות על ידי פפטיד TM שערער ממשק הטרומר A1R – D1R (עם רצף חומצות האמינו של TM 5, אך לא TM 7 של ה;D1R TM5  ו- פפטידים TM7, בהתאמה).

עדויות נוספות להיווצרות הטרומר A1R – D1R בתאי העברה הכוללים TM 5 של D1R סופקו באמצעות proximitz legation assay (PLA). טכניקה זו אפשרה זיהוי ישיר של אינטראקציות מולקולריות בין A1R אנדוגני (לא מועבר) ו- D1R. הביטוי של הטרומרים A1R – D1R בחוט השדרה המותני הודגם עם PLA בפרוסות מחוטי עמוד השדרה של עכבר ניאונטלי (אזור מותניים) מ P4, P6,  ו- P11  בעלי חיים. תרכיבי A1R – D1R זוהו באופן סלקטיבי ללא קשר בתקופה לאחר הלידה בתאים מ lamina IX, בהתאמה ל MNs. חשוב לציין, טיפול מקדים בפרוסות חוט השדרה עם TM5, אך לא עם TM7, נוריד משמעותית כתמי PLA, ולכן זיהה הטרומרים של A1R – D1R ב- MNs בעמוד השדרה של העכבר.

לאחר הקמת הלוקליזציה האנטומית של ההטרומרים A1R – D1R ב- MN הספינלי, תפקודם וחשיבותם התרופתית אושרה על ידי הקלטות patch-clamp אלקטרופיזיולוגי אינטרה-תאי. השימוש בקפאין או אנטגוניסט A1R, בנוכחות דופמין או D1R אגוניסט, הגביר את ההתרגשות הפנימית של עמוד השדרה ב- MNs אך לא ב- INs. ניתן להסביר תוצאות אלו באמצעות היכולת של קפאין או אנטגוניסט A1R לחזק את השפעות הדה-פולריזציה של דופמין בתוך ההטרומרים של A1R – D1R בMN הספינלים. זה הודגם בניסויים באמצעות פפטידים משבשים. בניסויים אלה, יישום של קפאין ואגוניסט D1R לא הגביר את הסטימולציה המהותית של ה- MNs המותני כאשר מיושם בנוכחות TM5 אך לא .TM7 מחקר זה מדגים כי הטרומרים A1R – D1R משחקים תפקיד משמעותי בשליטה על הסטימולציה של MNs בעמוד השדרה. באופן ספציפי יותר, A1R– D1R הממוקם ב- MNs הספינלי  מתווך את היכולת של אדנוזין להפעלת אפנון טוני מעכב עליות סטימולציה עצבית  תלויות D1R מתווכות דופמין.

השפעות בתיווך A1R של אדנוזין הוכחו לא רק כמווסתות את רשת התנועה של עמוד השדרה בעכבר, אלא גם כמדכאות מוות של תאי עצב הנגרם על ידי איסכמי NsMNs הספינלי של החולדה.  מה שמרמז כי אגוניסט A1R ישפר, בעוד שאנטגוניסטים A1R וקפאין יחמירו את הניוון מתווך-דלקת של פגיעות בעמוד השדרה (SCI) ומצבים תלויי דלקת ספינלית נוספים. למעשה, הוכח כי קפאין מחמיר את הניוון תלוי הדלקת המשני של SCI ניסיוני. מצד שני, מחקרים in vivo עם אגוניסטים ואנטגוניסטים דופמין על ייצור תנועה בגפיים אחוריות בעכברים עם חוט שדרה חתוך לחלוטין שהועבר ברמת החזה הנמוכה מצאו כי ביישום של D1R, אך לא D2R, אגוניסטים גורמים לעלייה חדה בתנועות דמויות-לוקומוטוריות וא-לוקומוטוריות בבעלי חיים לא מאומנים וללא חישה שנחשפו לסטימולציה.

לכן, העברה עצבית דופמינרגית בעמוד השדרה, ובאופן ספציפי יותר D1R, נחשבים ליעדים פוטנציאליים חדשים לקידום התאוששות פונקציות תנועה בעקבות SCI. ליתר דיוק, המחקרים שלנו מצביעים על כך שיש להתייחס אל ההטרומר MN A1R – D1R כאל מטרה עיקרית ולכך שקפאין ואנטגוניסטים A1R, לבד או בשילוב עם אגוניסטים D1R, יכולים להועיל במהלך שלבים שאינם דלקתיים של SCI. גורם חשוב שיש לקחת בחשבון במסגרת ההטרומרים של GPCR היא היכולת שלהם לשנות את מאפייני הליגנד בהשוואה ל GPCRs כאשר אלה לא יוצרים הטרומרים. הוכחת המושג באה מהדגמה של זיקה שונה באופן משמעותי של אנטגוניסט A2AR (SCH442416) כאשר מתבטא יחד עם ה- A2AR בלבד או עם ה- A2AR, שניהם בתאי יונקים מועברים או בסטריאטום של מכרסמים. ליונקים או בסטריאטום המכרסמים (תוך כדי השוואה של סוגים-פראיים עם עכברי נוקאאוט מותנים A2AR סטריאטלי). לכן, אנטגוניסטים A1R בעלי זיקה מועדפת להטרומרים  A1R – D1R יכולים להיות שימושיים מבחינה תרפויטית לטיפול בהשפעות מזיקות של SCI.

קפאין ואנטגוניסטים A2AR סלקטיביים ככלים טיפוליים חדשים לסימפטומים מוטיבציה של דכאון

אם כי בדרך כלל דיכאון נחשב כמערב תסמינים רגשיים, כמו עצב ואפקט שלילי, חשוב גם להדגיש כי דיכאון מאופיין בתפקוד לקוי של מוטיבציה כגון אדישות או אנרגיה, עיכוב פסיכו-מוטורי,  שימוש מופחת במאמץ, עייפות, וחוסר כללי בהפעלה התנהגותית. תסמיני המוטיבציה האלו של דיכאון מגבילים וקשה מאוד לטפל בהם. לדוגמא, אם כי מעכבי ספיגה בררניים של סרוטונין (SSRI) הם טיפולי התרופות הנפוצים ביותר לדיכאון, והם שימושיים מאוד לטיפול בתסמינים הקשורים לחרדה ומצב רוח, הם יחסית מוגבלים בטיפול בתפקוד לקוי של מוטיבציה. יתר על כן, תפקוד לקוי של מוטיבציה בפסיכופתולוגיה אנושית אינם מוגבלים לדיכאון; אנשים עם סכיזופרניה ומחלת פרקינסון מראים גם תסמינים שליליים, חוסר באנרגיה ועייפות. מכל הסיבות הללו, חשוב לפתח מודלים מבעלי חיים לסימפטומים פסיכיאטריים של אקטיבציה ומאמץ.

בשנים האחרונות מחקרים על התנהגות בחירה הקשורה למאמץ פותחו כמודלים רשמיים של תסמיני מוטיבציה של דיכאון. מטלות בחירה מבוססות מאמץ מאפשרות לאורגניזמים לבחור בין מחזק מועדף שיהיה ניתן להשיג אותו רק דרך מאמץ מוגבר, לעומת אופציה מאמץ נמוך/ערך פחות. במכרסמים, פעילויות המאמץ הגבוה כוללות דברים כמו לחיצה על מנוף בלוחות הזמנים, טיפוס על מחסום, או ריצה בגלגל ריצה. רוב הראיות מצביעות על כך שהתנאים הקשורים עם תפקוד לקוי של מוטיבציה בבני אדם, כולל את אלו הקשורים במיוחד לדיכאון, מייצרים הטיה במאמץ נמוך (כלומר, ירידה בבחירה של אפשרת higheffort), למרות שאותם תנאים אינם משפיעים על צריכת המזון או על העדפתם בין המחזקים השונים במבחני האכלה חופשית. למשל, אנטגוניסטים דופמין, כגון הלופרידול, ותנאים הקשורים למצבי דיכאון אצל בני אדם, כגון לחץ או החלה של מעכב הובלת מונואמין tetrabenazine, משנים את התנהגות הבחירה על ידי הקטנת הבחירה של אפשרויות המאמץ הגבוה והגדלת הבחירה של אופציות המאמץ הנמוך.

בנוסף, על ידי מתן ציטוקינים דלקתיים, הוכח כי אינטרלוקין (IL) 1b ו- IL-6 גורמים להטיה לכיוון בחירה במאמץ נמוך, מה שעולה בקנה אחד עם מחקרים המראים כי ישנם היבטים הקשורים לדלקתיות בסימפטומטולוגיה דיכאונית. השימוש במטלות-בחירה-קשורות-מאמץ-במכרסמים כמודל של תסמיני דיכאון, מאומת על ידי דיווחי מחקר, לפיהם אנשים עם הפרעת דיכאון חמורה מגלים גם נטייה לכיוון בחירה במאמץ-נמוך במבחני-מבוססים-בחירה על בסיס מאמת אצל בני אדם. מחקרים בתחום הפרמקולוגיה מצאו כי הנטייה לעבר בחירה במאמץ נמוך הנגרמת על ידי tetrabenazine אינו מתהפכת על ידי SSRIs fluoxetine ו citalopram, אלא על ידי תרופות החוסמות ספיגת  קטכולאמין, או חוסמות באופן ספציפי תעבורה של DA.

מחקר נוסף בתחום זה התמקד בהשפעות של תרופות הפועלות על אדנוזין. מתן אדנוזין A2AR אגוניסט CGS 2168 ישירות לתוך גרעין האקומבנס יוצר הטיה למאמץ נמוך ומפחית הוצאת מאמץ במשימות לחיצה על מנופים. יתר על כן, אנטגוניסטים מסוג A2AR כגון istradefylline, MSX-3, MSX-4 ו- Pradenadenant מסוגלים להפוך את ההטיה לעבר בחירה במאמץ נמוך הנגרמת על ידי אנטגוניסטים D2R, הלופרידול ואטיקלופריד, ואת האחסון הוסיקולרי של אנטגוניסט טטרבנזין. בניגוד לתופעות אלה של אנטגוניזם A2AR, עצירת ה- A1R אינו הופך את ההשפעות של אנטגוניזם DA ב- D1R או ב- D2R.  השפעות ההיפוך הגדולות ביותר נראות כאשר אנטגוניסט A2AR משמש כדי להפוך את ההשפעות של אנטגוניסט D2R , מה שעולה בקנה אחד עם נתונים אנטומיים על הקולוקליזציה הנרחבת של שני קולטנים אלה, ואת האינטראקציות המולקולריות שלהם בסטריאטום.

יתר על כן, מחקרים על מפלי איתות מטבוטרופי פוסט סינפטי מדגימים כי אנטגוניסטים מסוג A2AR מסוגל להפוך את הביטוי של c-fos ופוספורילציה של DARPP-32  (Thr34) על ידי אנטגוניסטים D2R וטטרבנזין. המחקרים האחרונים מספקים סמן תאי לאינטראקציה A2AR – D2R המתרחשת במינונים התנהגותיים רלוונטיים של תרופות הפועלות על קולטנים אלו. אנטגוניזם A2AR הופך גם את המאמץ ההטיה לכיוון הבחירה במאמץ נמוך הנגרמת על ידי ציטוקינים דלקתיים.  תצפיות אלו במודלים של בעלי חיים עולות בקנה אחד עם מחקרים קליניים בבני אדם המדווחים כי אנטגוניסט A2AR istradefylline יכול גם לשפר את תסמיני העייפות בחולי פרקינסון.

בנוסף הוכח כי אנטגוניסטים לא סלקטיביים לאדנוזין, קפאין ותאופילין, משפיעים על מבחני בחירה מבוססי מאמץ.  קפאין ותאופילין הפכו את ההשפעות של אנטגוניזם D2R על בחירות קשורות מאמץ. בחולדות שלא היו מוגבלות גישה למזון, קפאין (5 או 10 מ”ג / ק”ג) הגדיל את תפוקת לחיצת המנוף בחולדות שנבדקו במשימת בחירת המזון בהדרגה / יחס האכלה, אך רק בקרב מגיבים נמוכים. יחדיו, מחקרים אלו מצביעים על כך שתרופות הפועלות על קולטני A2A, כמו גם אנטגוניסטים אדנוזינים שאינם סלקטיביים, עשויים להיות שימושיים לטיפול בתפקוד לקוי של מוטיבציה אצל אנשים בדיכאון.

קפאין ואנטגוניסטים A2AR סלקטיביים ככלים טיפוליים לקוגניטיביים ורגשיים ליקויים בהפרעות קשב וריכוז

הפרעת קשב וריכוז היא אחת מההפרעות הפסיכיאטריות הכרוניות הנפוצות ביתר, עם אומדן שכיחות גלובלי של 5.9-7.1% בקרב ילדים / מתבגרים ו- 1.2-7.3% בקרב מבוגרים . ADHD נמשך במקרים רבים גם לבגרות, והופעתה קשורה לרוב עם ליקויי קשב, היפראקטיביות ו / או אימפולסיביות קוגניטיבית. תפקיד עיקרי של הפרעות  העברה עצבית דופמינרגית פרונטוקורטיקלית ב ADHD הוא הבסיס לטיפול התרופתי הנוכחי עם פסיכו-סטימולנטים, בדרך כלל מתילפנידאט. עם זאת, הבנת ההשפעה המודולריות של קולטני אדנוזין על העברה עצבית של דופמין גדל בשנים האחרונות. לפיכך, יש מספיק ראיות לכך שקולטני האדנוזין מייצגים יעד לפיתוח תרופות לטיפול במגוון הפרעות הקשורות לבעיות בוויסות העברה עצבית של  דופמין, לרבות ADHD.

אם כי השפעות מועילות של קפאין על תסמיני ADHD תוארו לראשונה על ידי Schnackenberg בשנת 1973, בארבעת העשורים האחרונים השימוש הקליני בקפאין כמעט ולא נחקר בצורה משמעותית.  כמה מחברים הדגימו שיפור תסמיני הפרעת קשב וריכוז בקפאין, ואילו אחרים לא מצאו השפעות חיוביות משכנעות. הפערים לכאורה ככל הנראה מיוחסים להבדלים מתודולוגיים. זו הסיבה שהתפיסה הכללית בשטח היא לא לשלול את השימוש בקפאין נלווה לטיפול בהפרעות קשב וריכוז, אבל   בלי שזה יוכל להוות תחליף בר קיימא לחזית הטיפול בהפרעות קשב וריכוז, כגון מתילפנידאט.

במחקר מטא-אנליזה Leon  דיווח כי מספר המחקרים הקטן, גודל המדגם הקטן (14.4 נבדקים / המחקר), והשונות הגדולה במינון הקפאין הם גורמים מגבילים עיקריים ויש להתייחס אליהם בזהירות יתר. על כן, אין הסכמה בספרות על מינון הקפאין האופטימלי להפקת יתרונות מתסמיני ADHD. כמה חוקרים דיווחו כי מינונים נמוכים של קפאין יעילים יותר בהפחתת ליקויי התנהגות ב- ADHD, הנמצאים בסתירה עם התיאורים המוקדמים של Schnackenberg,  לפיהם היתרונות של קפאין נצפו במינונים גבוהים מ- 200 מ”ג יומי. חוסר עקביות וחוסר הסכמה בנושא מינון “אופטימלי” של קפאין יכול להיות קשור באופן כללי לחוסר היכולת לפקח על פולימורפיזם הגן A2AR הממתן את צריכת הקפה והקפאין.

מצד שני, מחקרים רבים הראו כי טיפול קפאין שיפר את הזיכרון ואת ליקויי הקשב וגם תפקוד דופמינרגי מנורמל אצל מתבגר ומודל  SHR מבוגרים, מודל בעלי חיים מאומת של ADHD. טיפול ניכר בקפאין שיפר את הזיכרון החברתי, הזיכרון לזיהוי אובייקטים, וליקוי למידה מרחבית שהוצגו על ידי SHR מבוגרים בפרדיגמות התנהגות שונות. שיפור בזיכרון החברתי לטווח הקצר הושג גם לאחר מתן ניכר של אנטגוניסט  A2AR סלקטיבי, אך לא עם אנטגוניסט A1R  סלקטיבי.

בעל חשיבות רבה היא העובדה שלטיפול כרוני בקפאין יתרונות קוגניטיביים ארוכי טווח ב- SHR. מתן קפאין כרוני בגיל ההתבגרות אפשר לשפר את יכולת ההכרה לטווח הקצר ב- SHR למבוגרים, את הזיכרון ואת ליקויי הקשב, וגם לנרמל תפקוד דופמינרגי על ידי הפחתת ספיגת דופמין חוזרת בסטריאטום ובקליפת המוח הקדמית של SHR. לאחרונה, Nunes et al.  השווה את ההשפעות של צריכת קפאין חופשית מילדות ועד גיל ההתבגרות על ההתנהגות על גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF) המאותת מעבר בSHR זכרים ונקבות. המחברים ציינו כי צריכת קפאין שיפרה ליקויי זיכרון הכרתי בשני המגדרים. עם זאת, הזיכרון המרחבי שופר רק ב- SHR נקבה. בנוסף, קפאין נירמל BDNF אצל גברים וקולטן TrkB קטום בשני המינים. תוצאות אלו יתאימו עם האינטראקציות שהוכחו היטב בין אדנוזין מתווך A2AR ומפלי אותות BDNF מתווכי TrkB.

לבסוף, לאחרונה חקרנו את ההשפעות של צריכת קפאין כרוני ופעילות גופנית על ליקויים רגשיים שנצפו ב- SHR. הוגשו SHR זכרים, מגיל ההתבגרות (בן 30 יום) לבגרות, על מנת לקשר בין צריכת קפאין (0.3 מ”ג / מ”ל ​​בשתייה מים) עם ובלי פעילות גופנית מרצון בהפעלת במכונות ריצה למשך 6 שבועות. לאחר מכן, התנהגויות דיכאוניות ואנהדוניות הוערכו בבדיקות אילוצי שחייה והתזה. התוצאות מצביעות על השפעות אנטי דיכאוניות משמעותיות ועצמאיות מצריכת קפאין כרוני ופעילות גופנית ב- SHR ללא שינויים בהתנהגויות אנהדוניות. ממצאים אלה מספקים עדות ראשונה להשפעות מועילות של צריכת קפאין כרונית על לקויות רגשיות שנצפו במודל בעלי חיים של ADHD. בסך הכול, הסקירה של מחקרים קליניים ופרה-קליניים על קפאין והפרעת קשב וריכוז ממליצה על פנייה מחדש לתפקיד הטיפולי האפשרי של קפאין בהפרעות קשב וריכוז ועל ביצוע מחקרים מבוקרים יותר (כולל בקרה על פולימופריזם גנטי A2AR).

הערות לסיום

הטרומר GPCR מוגדר כיום כ-קומפלקס מקרומולקולרי המורכב מלפחות שתי יחדות קולטן שונות (פרוטומרים) עם תכונות ביוכימיות שונות מאלו של מרכיביו האינדיבידואליים. הטרומרים של GPCR יכולים לספק מאפיינים ייחודיים לליגנדים ספציפיים, המספקים אפיקים חדשים עבור פיתוח תרופות. לאחרונה, היינו מעוניינים במיוחד בהטרומרים של GPCR עם אחד הפרוטומרים מצומד לחלבון Gs והשני לחלבון Gi. השערת העבודה שלנו הייתה שיש להטרומרים אלה מבנה טטרמרי, וזה יוצר הטרוטטרמר GPCR עם שני הומודימרים, כל אחד יחד עם חלבון G המועדף עליו. מבנה זה יספק את המסגרת המספיקה לאינטראקציה המסורתית בין קולטן מוצמד Gs וקולטן מוצמד Gi ברמת AC, היכולת של קולטן Gi coupled לנטרל את הפעלת AC על ידי בו סימולציה בו-זמנית של קולטן מוצמד Gs. ההשערה שלנו הודגמה למעשה עבור היעד של קפאין, ההטרוטטרמר A2AR – D2R הסטריאטלי.

לכן הטרוטטרמר A2AR – D2R הסטריאטלי מהווה מטרה אמתית יותר לאינטראקציות החזקות שהודגמו קודם לכן בין אדנוזין סטריאטלי ודופמין. נוכחותם של אינטראקציות אלה בסטריאטום הגבי הביא לרציונל לפיו אנטגוניסט A2AR ניתן לחולי פרקינסון. עם זאת, ההטרומר A2AR – D2R ממוקם גם בסטריאטום הגחוני, ומעורב בהיבטים מוטיבציוניים נוספים של התנהגות.

כפי שנסקר במחקר זה, הדבר מרמז על השימוש באנטגוניסטים מסוג A2AR וקפאין בהפרעות נוירו-פסיכיאטריות נוספות, כגון דיכאון והפרעות קשב וריכוז. בנוסף הראנו כי יעד נוסף של קפאין, הטרומרA1R  D1R, מקיים גם את מקיים גם את האינטראקציה האנטגוניסטית המסורתית Gi-Gs ברמת AC, מה שמרמז על מבנה הטרוטטרמרי. באופן משמעותי, A1R – D1R זוהה לאחרונה בחוט השדרה, שם הוא משחק תפקיד חשוב באפנון ההתרגשות של ה-MN הספינלי.  המאפיינים הפרמקולוגיים שלו מצביעים על כך כי הטרומר A1R – D1R הספינלי יכול להוות יעד תרפויטי עבור SCI.