‘- Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires

ניטור אופטי של מתח חשמלי בנוירונים באמצעות מעבר אלקטרונים בחשיפה לאור דרך חוטים מולקולאריים

דימות פלורוסנטי הינו שיטה אטרקטיבית לניטור פעילות נוירונית. אחד האתגרים הכרוכים בניטור אופטי של מתח הוא פיתוח חיישנים המסוגלים לספק תגובות גדולות ומהירות לשינויים בפוטנציאל הטרנס-ממבראנה. אנו מציגים חיישנים פלורוסנטים המזהים שינויי מתח בנוירונים דרך אפנון של מעבר אלקטרונים בחשיפה לאור (PeT) מתורם אלקטרונים דרך חוט מולקולארי סינטטי לפלורופור. צבעים אלו מספקים תגובות גדולות יותר למתח בהשוואה לצבעים אלקטרו-כרומיים, וכוללים קינטיקה מהירה יותר ופחות קיבול מוסף בהשוואה לחיישנים המבוססים על אניונים הידרופוביים או תעלות יונים רגישות-למתח. מאפיינים אלו מאפשרים זיהוי באמצעות ניסוי בודד של דחף עצבי וסינפטי בתרביות נוירונים היפוקמפליים ובגנגליונים של עלוקות. ניתן לבצע אופטימיזציה רבה של PeT תלוי-מתח, אך הגשושים הקיימים כבר מהווים אינדיקאטורים מוצלחים של פעילות נוירונית.

דימות פלורוסנטי יכול למפות את הפעילות החשמלית ואת התקשורת של נוירונים מרובים ברזולוציה מרחבית, ובכך מתווסף למדידות האלקטרו-פיזיולוגיות המקובלות. דימות Ca2+ הוא הטכניקה הפופולארית ביותר בהקשר זה, מכיוון שהאינדיקאטורים מפותחים ביותר, רגישים, וברי-קידוד מבחינה גנטית, ומאפשרים חקר של ההתפלגות המרחבית של דינאמיקות Ca2+ במבנים קטנים כמו קוצים דנדריטים וגדולים כמו מעגלים פונקציונאליים. עם זאת, מכיוון שנוירונים מתרגמים דה-פולריזציה לאותות Ca2+  באמצעות סדרה מורכבת של משאבות, תעלות וחוצצים, דימות פלורוסנטי של טרנזיאנטי Ca2+ אינו מסוגל לספק תמונה מלאה של הפעילות החשמלית בנוירונים. הספייקים הנצפים של Ca2+ מהווים סינון מעביר-נמוכים טמפוראלי מהדה-פולריזציה הראשונית ומספקים מידע מוגבל בלבד בנוגע להיפר-פולריזציות ואירועים תת-ספיים. מדידה ישירה של פוטנציאל הטרנס-ממבראנה באמצעות אינדיקאטורים פלורוסנטים תספק מידע מדויק יותר לגבי התזמון והמיקום של הפעילות הנוירונית. למרות הפוטנציאל המבטיח של צבעים פלורוסנטים רגישים-למתח (VSDs), הדגמים הקודמים של VSDs סבלו משילוב כזה או אחר של חוסר-רגישות, קינטיקות נמוכות, עומס קיבולי כבד, מחסור במיקוד גנטי, או פוטו-טוקסיות. שניים מה- VSDs הפופולאריים ביותר, צבעים אלקטרו-כרומיים וצבעי FRET, ממחישים את הבעיות הקשורות בפיתוח VSDs פלורוסנטיים מהירים ורגישים.

צבעים אלקטרו-כרומיים מגיבים למתח באמצעות אינטראקציה ישירה בין הכרומופור והשדה החשמלי (סכמה 1A). אפקט סטארק זה מוביל לתזוזות אורך-גל קטנות בספקטרום הבליעה והפליטה. מכיוון שהשדה החשמלי מאפנן ישירות את רמות האנרגיה של הכרומופור, הקינטיקות של זיהוי המתח מתרחשות בפרק זמן התואם את הבליעה והפליטה, ומובילות לתזוזות היפסו-כרומיות או בתו-כרומיות אולטרה-מהירות (fs to ps) בסדרי גודל מהירים בהרבה מהדרוש לרזולוציה של אירועי ספייק מהירים ודחפים עצביים בנוירונים. תזוזת אורך-גל קטנה זו גורמת לכך שהאות הפלורוסנטי מתועד באופן הטוב ביותר בשולי הספקטרום, שם האינטנסיביות כוללת שינויים חדים כפונקציה של אורך הגל. התגובות הליניאריות הגדולות ביותר הן -28% ΔF/F לכל 100mV, אם כי הערכים הנפוצים יותר הם ~10% לכל 100 mV. גשושי Ca2+ מבוססי-PeT, כמו flou-3, מספקים ערכי ΔF/F של עד 150% עבור דחפים עצביים בתרביות נוירונים היפוקמפליים. לפיכך, למרות שצבעים אלקטרו-כרומיים מסוגלים להגיב לתנודות מתח מהירות בנוירונים, חוסר-הרגישות שלהם מגבילה את המערכות שבהן צבעים אלו מסוגלים לדווח על שינויי מתח בהצלחה.

חיישני מתח מבוססי-FRET משתמשים באניונים ליפופיליים המבצעים אינטרקלציה לתוך ממבראנת התא ומתפלגים בין העלעלים הפנימיים והחיצוניים, על בסיס פוטנציאל הטרנס-ממבראנה (סכמה 1B). ההתפלגות הנרנסטית מנוטרת על ידי פלורופור שני המקובע בצד אחד של הממבראנה, העובר FRET מועדף עם האניונים הניידים באותו צד של הממבראנה. טרנסלוקציה של האניון הליפופילי דרך הדו-שכבה הליפידית שולטת בקינטיקות של חישת המתח, היכולה להימצא בטווח של מילי-שנייה. למרות שמערכות שני-רכיבים אלו יכולות לספק שינויים גדולים באינטנסיביות (5-34%) או ביחס (80% לכל 100 mV), הטרנסלוקציה האיטית של מטענים ניידים בפלסמת הממבראנה מובילה לעומס קיבולי ופוגעת ביכולת של המדווח לנטר שינויים מהירים.

על מנת לשלב את התכונות הטובות ביותר של VSDs מבוססי-FRET ואלקטרו-כרומיים, בחנו מנגנון ייחודי של זיהוי מתח, PeT דרך חוטים מולקולאריים. בחיישני PeT אלו, מדווח פלורוסנטי מתחבר למדעיך (quencher) עשיר באלקטרונים באמצעות חוט מולקולארי, המצמצם את תלות המרחק האקספוננציאלי של מעבר אלקטרונים תוך-מולקולארי, ומאפשר מעבר אלקטרונים יעיל על פני מקטע גדול של עובי ממבראנת הפלסמה. בפוטנציאלי מנוחה או היפר-פולריזציה, השדה החשמלי של הטרנס-ממבראנה מעודד מעבר אלקטרונים מהמדעיך אל הפלורופור המעורר דרך החוט המולקולארי, ומביא לדעיכת הפלורוסנטיות (סכמה 1C). הדה-פולריזציה הופכת את השדה החשמלי, מאיטה את מעבר האלקטרונים, ומאירה פלורוסנטיות, בדיוק כפי שהתקשרות Ca+2 מבטלת את הדעיכה של אינדיקאטורים כמו fluo-3. מעבר אלקטרונים מתרחש בין פיקו-שניות ונאנו-שניות לאחר בליעת הפוטונים וחוזר למצבו הראשוני בתוך מיקרו-שנייה, אמנם מהירות איטית יותר בהשוואה למנגנון האלקטרו-כרומי אך בפועל מדובר במהירות מיידית במונחים ביולוגיים. מכיוון שמעבר האלקטרונים מתהפך במהירות ומונע על ידי בליעה פוטונית במקום על ידי שינויים בפוטנציאל הממבראנה, העומס הקיבולי הוא זניח, כפי שניתן לראות בנספח SI. מטען חשמלי מלא עובר מחסום אקטיבציה תרמית מסוג מרקוס כדי לזהות מקטע גדול של מתח הממבראנה, ומוביל לרגישות מתח גבוהה. דעיכת המדווח הפלורוסנטי באמצעות התורם העשיר באלקטרונים מאפננת את הנצילות הפלורוסנטית הקוונטית במנותק מאורך הגל, ומאפשרת שימוש ברמות אור נמוכות יותר או בריכוזי צבע נמוכים יותר. במאמר זה נפרט את התכנון, הסינתזה והיישום של סנסורים פלורוסנטים ממשפחת Volta-geFluor (VF) בתור גשושי חוטים מולקולאריים מבוססי-PeT לשם דימות מתח בנוירונים.

סגמה 1: מנגנון זיהוי המתח הפלורוסנטי. A) VSDs אלקטרו-כרומיים מזהים מתח דרך אפקט סטארק, שבו הכרומופור יוצר אינטראקציה ישירה עם השדה החשמלי. בליעת הפוטון משנה באופן משמעותי את הדיפול המולקולארי המעורר, המיוצב בפוטנציאלים של היפר-פולריזציה (משמאל). בפוטנציאלים של היפר-פולריזציה המצב ההופכי של תזוזת המטען הוא מעורער (מימין). שינויים ברמות האנרגיה של הכרומופור מובילים לתזוזות ספקטראליות קטנות בפליטת הצבע. B) חיישני מתח מזווגי-FRET משתמשים באניונים ליפופיליים (באדום) המתחלקים באופן תלוי-מתח בעלעל הפנימי או החיצוני של הממבראנה. דה-פולריזציה גורמת לטרנסלוקציה של האניון, המסוגל בשלב זה לגרום לדעיכה של הפלורוסנטיות של פלורופור מקובע (ירוק). C) PeT VSDs בחיווט מולקולארי תלויים במעבר אלקטרונים תלוי-מתח מתורם עשיר באלקטרונים (כתום) דרך חוט מולקולארי המקיף את הממבראנה (שחור), למדווח פלורוסנטי (ירוק). בפוטנציאלים של דה-פולריזציה, השדה החשמלי מתיישר באופן אנטי-מקביל לכיוון מעבר האלקטרונים, ומוביל ל- PeT יעיל ופלורוסנטיות דועכת (שמאל). דה-פולריזציה מיישרת את השדה החשמלי בכיוון של ה- PeT, מפחיתה את הקצב של מעבר האלקטרונים ומגבירה את הפלורוסנטיות (ימין).

תוצאות

התכנון והסינתזה של חיישני VF: חיישני המתח הראשוניים שלנו משלבים דיכלורופלואורסצין בתור פלורופור שאינו חודר ממבראנה, חוט מולקולארי פוליפנילן-וינילן (PPV), ו- N, N-דימתיל או דיבוטיל-אנילין בתור מדעיך עשיר באלקטרונים (סכמה 2). VF1.4.Cl כולל 2,7-דיכלורוסולפופלואורסצין המחובר דרך יחידת וינילין אחת לדיבוטיל-אנילין (לפיכך VF1.4.Cl). VF2.4.Cl מוסיף יחידת PPV שנייה, ו- VF2.1.Cl כולל את אותה קונפיגורציה, עם מתיל במקום קבוצות בוטיל.

הצבה נכונה של תורם חוט הפלורופור בתוך הממבראנה הינה חיונית לניצול האופי הווקטוראלי של השדה החשמלי של הממבראנה ומעבר האלקטרונים. ראשית, הציר האורכי של החוט המולקולארי חייב להיות נורמאלי למישור של ממבראנת הפלסמה בכדי לדגום את השדה החשמלי המלא. שנית, מולקולות הצבע חייבות להתיישר באותו כיוון בכדי למנוע ביטול של אפקט מעבר האלקטרונים. הצבת הפלורופור בעלעל החוץ-תאי של הממבראנה מבטיח הארה פלורוסנטית בעת הדה-פולריזציה; האוריינטציה הנגדית של PeT תגרום לדעיכה פלורוסנטית בעת הדה-פולריזציה.

הסולפופלואורסצין בעל המטען השלילי ימנע הפנמה של הצבע ויאלץ אוריינטציה שבה הפלורופור נבלע בעלעל החיצוני של ממבראנת הפלסמה, כשהחוט המולקולארי הליפופילי והאלקיל אנילין מתנדנדים לתוך הדו-שכבה הליפידית. בתור מרווח מתערב, חוטי PPV מולקולאריים מהווים בחירה אידיאלית בשל ערכי ההחלשה הנמוכים שלהם, הנהילות הסינתטית ויכולת ההולכה שלהם דרך דו-שכבות ליפידיות. אנילינים הינם תורמי PeT נפוצים, וקבוצות הדיאלקיל אמורות לזרז את הספיגה לתוך ממבראנת הפלסמה.

תכנון סינתטי מודולארי מאפשר היווצרות מהירה של חיישני המתח ומאפשר דריווטיזציה בעתיד (סכמה 2 ונספח SI). צימוד של יחידת סטירין 1 של החוטים המולקולאריים, הזמינה בצעד אחד מ- 4-די-בוטילאמינובנזאלדהיד, יחד עם דיכלורוסולפופלואורסצין 2 תפקוד-יוד דרך תגובת הק מופעלת-Pd מספקת VF1.4.Cl בנצילות טובה. תגובה אנלוגית עם חוט מולקולארי 3, הזמין בשני צעדים מ- 1, מספק VF2.4.Cl ב- 70% ניצולת. תגובה מקבילה המתחילה מסטירין 4 מספקת VF2.1.Cl בניצולת טובה. כל הצבעים כוללים פרופילי בליעה ופליטה האופייניים לדיכלורופלואורסצינים (VF1.4.CI: λmax = 521 nm, ε = 93,000 M-1 ⋅cm-1, λem = 534 nm, Φ = 0.24; VF2.4.CI: λmax = 522 nm, ε = 97,000 M-1 ⋅cm-1, λem = 536 nm, Φ = 0.054; VF2.1.CI: λmax = 522 nm, ε = 98,000 M-1 ⋅cm-1, λem = 535 nm, Φ = 0.057, 5 mM סודיום פוספאט, pH 9, 0.1% Triton X-100) (נספח SI, איור S1). צבעי הדיבוטיל (VFx.4.CI) מכתימים את הממבראנות של תאי HEK293 כאשר הם נטענים בריכוז של 2 μm במשך 15 דקות בטמפ’ של 37oC בחוצץ עם 0.1% DMSO כממס שותף (איור 1A, איור S2 בנספח SI). ה- VF2.1.CI דורש ריכוזי צבע נמוכים יותר (100 nM) ומספק הכתמה בהירה של ממבראנות תאי HEK, ככל הנראה כתוצאה מהמסיסות המימית הגבוהה יותר של VF2.1.CI בהשוואה ל- VF2.4.CI בתמיסה מימית (איור S2 בנספח SI). שימור הממבראנה של צבעי הדור השני (VF2.x.CI) מנוגד ל- di-4-ANEPPS, שתחת אותם תנאי טעינה מראה ספיגה מובהקת לתוך הממבראנות הפנימיות. שיעורי ההלבנה של הגשושים נבחנו בתאי HEK והושוו ל- di-4-ANEPPS. שיעורי ההלבנה של VF1.4.CI, VF2.4.CI ו- VF2.1.CI נמדדו בתור 3.9 ± 0.1 x 10-2 s-1, 1.8 ± 0.1 x 10-1 s-1, ו- 8.0 ± 0.1 x 10-3 s-1, בהתאמה. תוצאות אלו קטנות פי 2, 4 ו- 9 מ- di-4-ANEPPS, שתחת תנאי אילומינציה זהים היא בעלת שיעור הלבנה של 6.9 ± 0.1 x 10-2 s-1.

סכמה 2: סינתזה של גשושי VF.

אפיון תגובת המתח של חיישני VF: אפיינו את רגישות המתח של כל שלושת האינדיקאטורים באמצעות רישומי תרכיב תאי tight-seal של תאי HEK293 שהוכתמו עם חיישני ה- VF. התאים עברו voltage clamping בפוטנציאל החזקה של -60 mV ודורגו לפוטנציאלים של דה-פולריזציה והיפר-פולריזציה במדרגות של 20-mV (איור 1B). עבור כל שלושת הצבעים, צעדי הדה-פולריזציה הפיקו עלייה בפלורוסנטיות, בעוד שצעדי ההיפר-פולריזציה הפיקו ירידה הפלורוסנטיות, בהתאם למנגנון ה- PeT המוצע. התגובה הפלורוסנטית הינה ליניארית על פני טווח של -100 mV עד +100 mV (איור 1C), עם רגישויות מתח ΔF/F לכל 100 mV של 20 ± 1%  עבור VF1.4.CI ו- 25 ± 1% עבור VF2.4.CI. עלייה סטטיסטית מובהקת זו ברגישות המתח (p < 0.05, מבחן t סטודנטי דו-זנבי). הינה צפויה בעקבות הגדלת האורך של החוט המולקולארי, והיא ריגשה פי 2.5-4 יותר מאשר di-4-ANEPPS, אשר מספקת רגישויות של בין 6% ל- 10% ΔF/F לכל 100 mV. ה- VF2.1.CI מפגין עליית פלורוסנטיות בעת הדה-פולריזציה בדומה ל- VF2.4.CI, עם רגישות מתח של 27 ± 1% לכל 100 mV. ערך זה אינו שונה באופן מובהק מהרגישות של VF2.4.CI, ממצא המצביע על כך שרגישות המתח נקבעת ברובה על ידי אורך החוט המולקולארי וכי העלייה הקטנה ביכולת תרומת האלקטרונים של הבוטיל ביחס לקבוצות המתיל תורמת במידה קטנה בלבד לרגישות המתח של VF2.1.CI. בכדי לחקור את מהירות התגובה של גשושי ה- VF, ביצענו שוב רישומי תרכיב תא של תאים שהוכתמו עם VF2.4.CI, יישמנו צעדי דה-פולריזציה של 100-mV מפוטנציאל החזקה של -60 mV, ותיעדנו את האותות האלקטרו-פיזיולוגיים והאותות האופטיים. התאמת התיעודים האלקטרו-פיזיולוגיים והאופטיים סיפקה קבועי זמן זהים עבור תחילת הפולס וסופו (τON, phys = 139 ± 0.2 μs, τON, optical = 138 ± 14 μs, τOFF, phys = 142 ± 0.4 μs, τOFF, optical = 147 ± 19 μs), כלומר VF2.4.CI והסנסורים הקשורים אינם מציגים שיהוי גלוי כלשהו בתגובה הפלורוסנטית שלהם למתח, ממצא עקבי למנגנון מבוסס-PeT עבור זיהוי מתח (איור 2A ו- B).

התגובה הפלורוסנטית של VF2.4.CI לשינויי מתח היא נטולת-רגישות לאורך-גל העירור, מצב מוכר בגשושים מבוססי-PeT, כמו fluo-3 ו- Calcium Green 1. בחנו את תלות אורך הגל  של VF2.4.CI על ידי שינוי אורך גל העירור בצעדים של 5-nm וקבענו כי התגובה הפלורוסנטית של VF2.4.CI לדה-פולריזציה של 100-mV מפוטנציאל החזקה של -60 mV משתנה רק בכ- 15% כאשר בוחנים אורכי גל של 445 עד 500 nm (איור 2C). בהשוואה לכך, ה- di-4-ANEPPS משתנה בכמעט 100% על פני ספקטרום העירור שלה, וחיישן ה- Ca2+ מבוסס-PeT, Calcium Green-1, משתנה ב- ~20% (נספח SI, איור S3). השוואות אלו מראות כי אי-התלות באורך הגל של רגישות המתח הינה עקבית יותר עם PeT מאשר במנגנון תזוזת-אורך גל כמו אלקטרו-כרומיות או סולבטוכרומיות (תזוזת אורך גל בשל שינוי בהמסה מקומית).

חיישני חוטים מולקולאריים מבוססי-PeT אינם משפיעים על העירור הנוירוני באמצעות עומס קיבולי. הזרקנו זרם היפר-פולריזציה לתוך תאי הרציוס של גנגליונים של עלוקות, והשוונו את קבועי הזמן של צעדי מתח אלו בגנגליונים תחת תנאי טעינת צבע שונים. הגנגליונים הוכתמו בצבע בריכוז גבוה פי 3 מריכוז העבודה (VF2.1.CI או diSBA-C4-(3)) והשוונו אותם לתאים לא-טעונים. הנוכחות של צבע הטרנסלוקציה אוקסונול 413 מגדילה באופן משמעותי את העומס הקיבולי בממבראנה, כפי שנמדד על ידי העלייה בקבוע הזמן RC עבור זריקת ההיפר-פולריזציה (איור 2D). מצד שני, הגנגליונים שנטענו עם VF2.1.CI לא הציגו הבדל כלשהו בהשוואה לתאי הבקרה, ממצא המלמד כי חיישני חוטים מולקולאריים גורמים לעומס קיבולי זניח על התא (איור 2D), ומאשר את התחזיות בנספח SI.

זיהוי דחפים עצביים באמצעות VF2.4.CI בנוירונים של יונקים: בכדי לבדוק האם גשושי VF מסוגלים לזהות דחפים עצביים בניסויים בודדים, השתמשנו בתרביות נוירונים היפוקמפליים של חולדות. יישום של 2 μm VF2.4.CI הביא להכתמת תאים מוארת המוגבלת לממבראנות התאים של הנוירונים ותאי התמיכה שלהם (איור 3A). לאחר מכן הזרקנו זרם לתוך הנוירון במצב תרכיב תא patch-clamp בכדי לגרום לדחפים עצביים בודדים והשתמשנו במצלמת EMCCD בעלת מהירות גבוהה ותאורה אחורית כדי לעקוב אחר אותות אופטיים מהירים מה- VF2.4.CI, מה שאפשר לנו לבצע רזולוציה של הדחפים העצביים בנויורונים ב- sweeps בודדים (איור 2B). המסלול האופטי התאים למסלול הפיזיולוגי וסיפק עלייה של כ- 20% ΔF/F בפלורוסנטיות ויחס אות/רעש (SNR) של 16:1 בניסוי בודד. העובדה כי VF2.4.CI זיהה דחפים עצביים ללא מיצוע מתוזמן-ספייק מצביע על האפשרות למדידת דחפים עצביים ספונטניים בנוירונים באתרים הרחוקים מפיפטת התיעוד.

איור 1: אפיון חיישני VF בתאי HEK. A) דימות קונפוקאלי של תאי HEK 293 שהוכתמו עם 2 μm VF2.4.CI (קנ”מ, 20 μm). B) שינויי מקטע בפלורוסנטיות של VF2.4.CI בזמן סדרה של צעדי מתח ל- +100 או -100 מפוטנציאל החזקה של -60 mV (צעדים של 40-mV). C) שינויי מקטע בפלורוסנטיות של VF2.4.CI מ- B בהתוויה מול פוטנציאל ממבראנה עבור שינויי מתח מפוטנציאל החזקה של -60 mV. כל נקודת נתונים מייצגת 3-4 מדידות נפרדות. פסי השגיאות הם SEM.

ניטור פעילות ספונטנית בגנגליונים של עלוקות בעזרת VF2.1.CI: מבחן קפדני יותר של היעילות של VSD מבוסס-PeT הינו לקבוע האם הוא מסוגל למדוד באופן מדויק פעילות תת-ספית בתכשירים הטרוגניים. לשם כך, השתמשנו בגנגליונים של עלוקות, מכיוון שהנוירונים שלהם נחקרו לעומק בעזרת תיעודים אלקטרו-פיזיולוגיים ושיטות VSD אחרות. בודדנו גנגליון במרכז הגוף והכתמנו אותו עם VF2.1.CI במשך 15 דקות בטמפ’ של 22oC (איור 3C). החדרנו אלקטרודה חדה (25 MΩ) לתוך תא רציוס כדי לאפשר תיעוד של הפעילות הספונטנית שלו ובו-זמנית תיעדנו את האותות הפלורוסנטים מאותו תא. כאשר דגמנו בקצב של 50 Hz , התיעוד האופטי (איור 3D, קו אדום) עקב אחר התנודות התת-ספיות בתיעוד החשמלי (קו שחור). הספייקים המתועדים אופטית מוגבלים כתוצאה מתת-דגימה של האות האופטי; דגימה בקצב גבוה יותר (722 Hz) יצרה רזולוציה מלאה של הדחפים העצביים, אך יצרה בנוסף כמות משמעותית של רעש דגימה (נספח SI, איור S4). למרות תת-הדגימה של הדחף העצבי ב- 50 Hz, קיים טרנזיאנט נאמן במסלול האופטי המצביע על הזמן בו מתרחש הדחף העצבי, וברוב המקרים זה הדבר הנחוץ לנו.

ה- VSDs מבוססי-PeT מראים שיפור מובהק במהירות ובדיוק בהשוואה ל- VSDs מבוססי-FRET, ששימשו בעבר לתיעודי עלוקות, שבתורם עלו על צבעים אלקטרו-כרומיים. השיפור ברישום התנודות של פוטנציאל הממבראנה אינו נגרם מרגישות גבוהה יותר (ה- ΔF/F של צבעי ה- FRET וה- PeT הוא כ- 10% לכל 100 mV ברישומי עלוקות), אלא כתוצאה מ- SNR גבוה יותר. ה- VSD מבוסס-PeT מפיק אות בהיר יותר, הרבה מעל רמות רעש הפוטון של הצבע ורמת רעש החושך של המצלמה. הגדלת הריכוז של הצבע מבוסס-FRET אכן מגדיל את ה- SNR שלו, אך הגידול הנוצר בקיבול של התא (איור 2D) הופך את הצבע לחסר תועלת עבור תיעוד הדחפים העצביים או הפוטנציאל הסינפטי. בדיקת הטוקסיות וההלבנה של ה- VSD מבוסס-PeT באופן דומה לזו שנערכה על הצבעים מבוססי-FRET מראה כי ה- VSD מבוסס-PeT הוא בעל קצב הלבנה איטי יותר והוא פחות טוקסי מהצבעים מבוססי ה-FRET. לפיכך, על סמך כל המדידות, ה- VSD מבוסס-PeT מציג ביצועים טובים יותר בהשוואה לצבעים מבוססי-FRET.

איור 2: אפיון המהירות, רגישות אורך הגל והקיבול של התגובה הפלורוסנטית של VF2. A) שוליים עולים של צעד דה-פולריזציה 100-mV מ- -60 mV בתאי HEK שהוכתמו עם VF2.4.CI. B) שוליים נופלים של אותו צעד. הקו השחור הרציף הוא המתח המשולב שנמדד באופן אלקטרו-פיזיולוגי; הנקודות האדומות הן התיעוד האופטי. קבועי הזמן מחושבים על ידי התאמת משוואה מונו-אקספוננציאלית לכל צד של הצעד. המסלולים הם ממוצע של 100 ניסויים סדרתיים. C) רגישות מתח מול אורך גל העירור. התגובה המנורמלת של VF2.4.CI לדה-פולריזציה של 100 mV מ- -60 mV בתאי HEK מסומנת באדום, וספקטרום העירור בתאי HEK מיוצג על ידי הקו השחור המקוטע. פסי השגיאה הם SEM עבור n = 3 ניסויים. D) מדידת העומס הקיבולי בתאי רציוס של עלוקות. הקווים מציגים את ירידת המתח המנורמלת לאחר הזרקת מתח היפר-פולריזציה לתוך תאי רציוס שהוכתמו עם VF2.1.CI x3 (קו אדום), x3 אוקסונול 413 (קו שחור), או כלום (אפור). (inset) ציר זמן מורחב אינו מראה הבדלים כלשהם בין תאים שהוכתמו עם VF2.1.CI לבין תאי הבקרה.

דיון

ה- VSDs האופטימאליים כוללים תגובות מהירות וגדולות לשינויים במתח, אינם גורמים לעומס קיבולי על הממבראנה, גורמים להלבנה איטית עם נזק פוטו-דינאמי מינימאלי, והם נהילים סינתטית עבור אפנון כימי רציונאלי ומיקוד גנטי. אנו מאמינים כי משפחת ה- VF של גשושים מבוססי-PeT הם טובים יותר מסוגי VSD קודמים על סמך קריטריונים אלו. שלושת המולקולות מבוססות-PeT אותן בחנו (VF1.4.CI, VF2.4CI ו- VF2.1.CI) מציגות הכתמת ממבראנה טובה ועליות של 20-27% ΔF/F לכל 100-mV בפלורוסנטיות בעת הדה-פולריזציה בתאי HEK. מולקולות אלו מחזיקות בקינטיקות המהירות (τON/OFF << 140 μs) ורגישות מתח בלתי תלויה באורך גל העקבית למנגנון PeT לזיהוי מתח. מדידת הקיבול בנוירונים של עלוקות מראה עומס קיבולי זניח על הממבראנה. היתרונות של צבעים מבוססי-PeT על פני שיטות אלקטרו-כרומיות ומבוססות-FRET לזיהוי מתח אופטי מתוארות מטה ומסוכמות בטבלה 1. טכניקה רביעית, המיישמת חיישנים מקודדים גנטית, מהווה שיטה מבטיחה לניטור אופטי של שינויי מתח מכיוון שניתן למקד את החלבונים הפלורוסנטים לתאים ספציפיים, וכך להגביר את ה- SNR של התגובה הפלורוסנטית. עם זאת, בפרקטיקה, חלבונים פלורוסנטים המשמשים כחיישני מתח סובלים מרגישות נמוכה (0.5% עד 10% ΔF/F לכל 100 mV), תגובות לא-ליניאריות וקינטיות איטיות (עשרות עד מאות מילי-שניות). ניסיונות חדשים יותר יישמו טרנסלוקציה של פרוטונים בתוך רודופסינים בקטריאליים, אך למרות ששיטות אלו מציגות רגישות מתח גבוהה, זמן התגובה נמצא עדיין בטווח של מילי-שניות, היעילות הקוואנטית נמוכה, והביטוי שלהן מוגבל למערכות פרוקריוטיות. טרנסלוקציה מבוססת-מתח של יונים דרך הממבראנה תוסיף עומס קיבולי גדול בהשוואה לטרנסלוקציה של אלקטרונים בזמן מצבי עירור חולפים.

שימוש ב- VSDs תוך יישום גישה של חוטים מולקולאריים מבוססי-PeT אמורה להיות רגישה ביותר. מכיוון שמטען אלקטרוני מלא נע דרך מקטע משמעותי של מתח הטרנס-ממבראנה (11 Å עבור VF1.4.CI, 17 Å עבור VF2.4.CI ו- VF2.1.CI, או 37% ו- 57% מ- 30 Å של ליבת הקבוע הדיאלקטרי הנמוך של ממבראנת הפלסמה) השינוי בכוח ההנעה עבור PeT הינו גדול. לדוגמא, דה-פולריזציה של 100-mV משנה את כוח ההנעה של PeT ב- 0.05 eV (אלקטרון אחד x חצי מפוטנציאל של 100-mV, או 0.05 V). מכיוון ש- PeT הינו תהליך הנשלט תרמית, הערך של 0.05 eV הוא גדול יחסית לערך של kT ב- 300 K (0.026 eV), ומפיק טווח דינאמי גדול בין הקצב של PeT בפוטנציאל מנוחה ובפוטנציאל דה-פולריזציה. ה- VSDs מבוססי-FRET יהיו בעלי רגישויות דומות; אניונים ניידים מסיסים-בליפיד עוברים על פני מרחקים של בין 0.4 ל- 0.6 מכלל רוחב הממבראנה, ומובילים ל- ΔG של ~0.05 eV עבור דה-פולריזציה של 100-mV, בהשוואה ל- kT של 0.026 eV עבור התהליך המופעל-תרמית.

באופן מנוגד, צבעים אלקטרו-כרומיים מכילים ערכי ΔG קטנים יותר, 0.003 עד 0.02 eV, ואנרגיות השוואה גדולות יותר. מכיוון שהאינטראקציה היא תהליך הנשלט פוטו-כימית, האנרגיה של פוטון העירור הינה אנרגיית ההשוואה, שהיא 1.5-2 eV עבור צבעים בתחום הכחול-ירוק של הספקטרום. לפיכך, צבעי PeT ו- FRET כוללים שינויים גדולים באנרגיה מול אנרגיית ההשוואה (0.05 eV מול 0.026 eV), מצב המוביל לרגישויות גבוהות; צבעים אלקטרו-כרומיים כוללים שינויים קטנים בהשוואה לפוטון העירור (0.003-0.02 eV מול 2 eV), ולכן מפיקים רגישויות מתח נמוכות.

האופי של מנגנון ה- PeT מנבא בנוסף כי הקינטיקות של זיהוי המתח יהיו מהירות; מעבר אלקטרונים קדמי מתרחש בסדר גודל של ננו-שניות כאשר הפלורוסנטיות דועכת, ומעבר אלקטרונים אחורי משלים את מעגל ומתרחש בסדר גודל של מיקרו-שניות או מהר יותר, כלומר הצעד האיטי, רה-קומבינציה של אלקטרון-חור, מסתיים מהר יותר ב- 3 סדרי גודל בהשוואה לדחף העצבי. צבעים אלקטרו-כרומיים מציגים קינטיקות מהירות אף יותר, כאשר תזוזה קדמית של המטען מתרחשת יחד עם הבליעה, בסדר גודל של פמטו-שנייה, ופותרת את עצמה בעת פליטה של פוטון, ובכך מאפשרת לצבעים אלו לעמוד בקצב של הספייקים הנוירוניים המהירים ביותר. ה- VSDs מזווגי-FRET תלויים בנדידה של אניון ליפופילי דרך דו-שכבה ליפידית בלתי-מעורבבת ומציגים קינטיקות של מילי-שנייה עד שנייה, מצב המגביל את היישומיות שלהם לניטור של טרנזיאנטים איטיים בלבד.

מכיוון שה- PeT מניע את האלקטרון על פני הממבראנה וחזרה במהירות של מיקרו-שנייה או מהר יותר, בכוח של פוטונים במקום שינויי פוטנציאל בממבראנה, לא אמור להתקיים עומס קיבולי כלשהו. הדבר נכון גם לגבי צבעים אלקטרו-כרומיים, המעבירים אלקטרונים בסדרי גודל מהירים אף יותר. אחד החסרונות של צבעים אלקטרו-כרומיים הוא כי הם דורשים שכל הכרומופורים מזהי-המתח יהיו קשיחים על מנת לאפשר חפיפה היקפית π, ניצולת קוונטית, מעבר מטען יעיל, ורגישות מתח מקסימאלית. קשיחות כזו מעכבת את הסינתזה ואת מסיסות המים ועשויה להסביר מדוע צבעים אלקטרו-כרומיים אינם משתפרים על ידי הארכת הכרומופורים שלהם. גשושי PeT אינם דורשים שכל החוט המולקולארי יהיה קופלנארי באופן קשיח, ולכן קיימת היתכנות לסינתזה של חוטים ארוכים יותר.

חישת-PeT מאפשרת שימוש בכל ספקטרום הפליטה לצורך ניטור המתח, מכיוון שמנגנון הדעיכה משנה את ΦFI, מפחית את בהירות הצבע, ואינו גורם לתזוזות באורך הגל כפי שמתרחש במקרה של צבעים אלקטרו-כרומיים. מכיוון שאין בזבוז של פוטונים, שיטה זו מאפשרת שימוש באור באינטנסיביות נמוכה יותר בניסויים, להפחית את הפוטו-טוקסיות ולהאריך את הליכי הניסוי. הביצועים של צבעים אלקטרו-כרומיים חדלו להשתפר לאחר 4 עשורים של פיתוח. עירור בקצה האדום הרחוק של הספקטרום מספק רגישויות מתח של -35% עד -52% ΔF/F לכל 100 mV ; עם זאת, בשולי הספקטרום, האינטנסיביות נמוכה בהרבה מהשיא ותגובת המתח הופכת ללא-ליניארית.

קיימות מספר מגבלות לצבעי VF. נגזרות VF עדיין אינן ממוקדות גנטית. החיישנים נספגים על ידי ממבראנות התא של כל הרקמות, וגורמים לפלורוסנטיות רקע אדישה ולהפחתת ה- SNR. זו הופכת להיות סוגיה חשובה עבור תכשירים הטרוגניים כמו גנגליונים של עלוקות ופיסות מוח, ואחת השיטות לפתור בעיה זו היא באמצעות מיקוד גנטי של VSDs. חיישני VF מאפשרים דריווטיזציה כימית, וקיימים ניסיונות לבצע מודיפיקציות של גשושי VF לצורך מיקוד במעגלים נוירוניים מוגדרים גנטית.

חסרון נוסף הוא כי חיישני VF PeT אינם רגישים למתח כפי שקיווינו. הנגזרות הראשונות שלנו הציגו רגישויות של 20-27% ΔF/F לכל 100 mV, והצבע האלקטרו-כרומי הרגיש ביותר כיום מציג רגישויות של -28% ΔF/F לכל 100-mV בטווח הליניארי. למרות שמעודד לגלות כי הנגזרות הראשונות מציגות רגישויות ברמה המתקרבת לזו של הצבעים האלקטרו-כרומיים הרגישים ביותר, אנו מאמינים כי קיים חלל כימי רב לשיפור רגישות המתח של פלטפורמות חוטים מולקולאריים. מכיוון שרגישות המתח נשלטת על ידי PeT, ניתן לכוון באופן רציונאלי את היעילות של PeT על ידי שינוי זיקת האלקטרון של התורם, החוט והמקבל בכדי להשיג turn-on פלורוסנטי מקסימאלי בתגובה לדה-פולריזציה. בנוסף, הארכת החוט המולקולארי כך שיקיף מרחק גדול יותר על פני ממבראנת הפלסמה אמורה להגביר את הרגישות מכיוון שהאלקטרון המועבר דוגם יותר מהשדה החשמלי. האופי המודולארי של סינתזת ה- VF מאפשר חלופה מהירה של שותפי צימוד על מנת להרכיב ולאמוד במהירות את רגישות המתח של מערך של תשלובות.

לסיכום, אנו מציגים שיטה ייחודית לניטור מתח בנוירונים המבוססת על PeT רגיש-למתח מתורם עשיר באלקטרונים למדווח פלורוסנטי המחובר באמצעות חוט מולקולארי המקיף את כלל הממבראנה. חיישנים ממשפחת VF כוללים תגובות פלורוסנטיות גדולות וליניאריות לצעדי דה-פולריזציה (20-27% ΔF/F לכל 100 mV), קינטיקות מהירות (τ << 140 μs), ועומס קיבולי זניח. ה- VF2/4/CI מסוגל לזהות וליצור רזולוציה של דחפים עצביים בתרביות נוירונים היפוקמפליים ראשיות, ו- VF2.1.CI מסוגל לנטר ספייקים ספונטניים ופוטנציאלים סינפטיים בתאי רציוס של עלוקות עם רגישות וזמן הזהים לאות האלקטרו-פיזיולוגי המתועד. חיישני VF מספקים חלופה מעשית ל- VSDs הזמינים כיום, ונגזרות עתידיות של פלטפורמת החוטים המולקולאריים ישפרו את יכולת הניטור האופטי של הדינאמיקות הטמפוראליות והמרחביות של הפעילות הנוירונית במעגלי נוריונים מוגדרים.

איור 2: רזולוציה של דחפים עצביים בנוירונים באמצעות צבעי VF2. A) נוירונים היפוקמפליים של חולדות שהוכתמו עם 2 μm VF2.4.CI במשך 15 דקות מציגים הכתמת ממבראנה חזקה (קנ”מ 20 μm). B) ה- VF2.4.CI מזהה דחפי עצביים בנוירונים היפוקמפליים של חולדות בניסויים בודדים. הקו השחור הוא האות האלקטרו-פיזיולוגי המתועד. נקודות אינדיבידואליות מייצגות את האות האופטי מ- VF2.4.CI שנלכד על ידי מצלמת EMCCD במהירות גבוהה בקצב של 2 kH. C) דימות אופטי של פעילות ספונטנית בתאי רציוס של עלוקות באמצעות VF2.1.CI. גנגליון מרכז גוף מחוץ לנדן שהוכתם עם 200 nM VF2.1.CI במשך 15 דקות. הפיקסלים בתוך האזור הרלוונטי (עיגול אדום מסביב לגוף תא רציוס בודד) עברו מיצוע בכל מסגרת בכדי לייצר את המסלול האופטי (קנ”מ 25 μm). D) תיעודים אופטיים ואלקטרו-פיזיולוגיים סימולטניים של פעילות ספונטנית בתא מ- C. הקו האדום הוא אות VF2.1.CI לאחר מסנן מעביר גבוהים, בדגימה של 50 Hz. הקו השחור הוא התיעוד האלקטרו-פיזיולוגי, בדגימה של 10 kHz. המסלול האופטי מראה התאמה כמעט מושלמת של פוטנציאל הממבראנה התת-ספי ואות ברור וגלוי המצביע על דחפים עצביים. הדחפים העצביים כוללים אמפליטודות מגוונות במסלולים האופטיים בשל קצב הדגימה האופטית האיטי (נספח SI, איור S4).

טבלה 1: סיכום של תכונות VSD.

שיטות

הדימות, אלקטרו-פיזיולוגיה, תרביות התאים, דימות ואלקטרו-פיזיולוגיה של עלוקות וניתוח הנתונים מפורטים בנספח SI. השיקולים התיאורטיים של העומס הקיבולי מפורטים בנספח SI. סינתזת הצבעים בוצעה בהתאם להליכי סינתזה סטנדרטיים המפורטים בנספח SI.