Regulation of the anaphase promoting complex/cyclosome by the degradation of its unassembled catalytic subunit, Apc11

Volpe et al. (2019)

תקציר:

אחד האתגרים העומדים בפני מנגנוני בקרת החלבון בתא הינו הקושי להבטיח שמרכיבים זמינים בפרופורציות הנכונות. במחקר זה אנו מדגימים כיצד מערכת האוביקוויטין-פרוטוזום (UPS) מתווכת את פירוק הסובסטרטים של תת היחידה הקטליטית Apc11 (שהנו רכיב מקומפלקס לקידום אנפאזה – APC/C). מחקרי אין ויטרו קודמים הראו כיצד Apc11 – יחד עם האנזים E2 – הינם די לצורך פירוק סובסטרטים (ללא תלות בקומפלקס לקידום אנפאזה APC/C). במחקר זה אנו קובעים שזה אכן יכול להתרחש בתאי שמר חיים. אנו מדגימים כיצד ניתן לעקוף את מנגנוני הבקרה של APC/C. ספציפית, אנו מדגימים כיצד סובסטרטים עוברים הליך יוביקוויטינציה באמצעות רמות עודפות של Apc11. לפיכך, אנו מציעים כי הדגרדציה של Apc11 (המתווכת על ידי ה- UPS) הינה למעשה מכניזם המבטיח תפקוד סדיר של ה-APC/C (כלומר תפקוד המוגבל להולואנזימים שתוחמו כראוי). עוד, אנו מציעים כי חוסר פרופורציות במרכיבי החלבונים עלול לפגוע במוטציות של רווח-תפקוד (ולא רק להפרעה של סטואיכיומטריה).

מילות מפתח: מערכת האוביקוויטין-פרוטוזום, מיטוזיס, בקרת איכות החלבון, מחזור התא, קוהזיה.

KEY WORDS: ubiquitin proteasome system • mitosis • protein quality control • cell cycle • cohesion

רציונל:

מחקרי אין ויטרו קודמים הראו כיצד ה-Apc11 (תת היחידה הקטליטית של המתחם לקידום אנפאזה APC/C) מסוגל לתווך בעצמו (באמצעות אנזים E2) הרכבה וייצור של שרשראות אוביקוויטין. בהתאם, אנו משערים כי במקרים המערבים יחידות קטליטיות, כגון ה-Apc11, דרוש הליך דגרדציה כדי למנוע תהליכי אין ויוו.

שיטה:

זני שמרים: כל הזנים בהם השתמשנו במחקר הינם זנים איזוגניים ל-BY4741 או BY4742. בכל המחיקות, הסמן לבחירה החליף את אזור הקידוד של הגן הנבחר.

תנאי גידול: תאי השמר גודלו במדיום גידול סינטטי בתוספת של 2 אחוז גלוקוז או גלקטוז. התאים גודלו בטמפרטורה של שלושים מעלות צלזיוס, למשך 16-18 שעות, ואז דוללו חזרה עשרה פעמים באמצעות מדיום גידול חדש (כאשר בכל פעם הושארו למשך שעתיים נוספות). כלומר, 16-18 שעות במחזור הראשון, ושעתיים נוספות לאחר כל דילול. פרוטוזומים עוכבו על ידי הוספת 50 מ”מ של מעכב פרוטוזום בכדי למנוע את יציאת התמיסה מן התאים. מדיום YEP סטנדרטי בתוספת 2 אחוז גלקטוז או דקסטרוז שימש לצורך גידול לא-סלקטיבי. בנוסף, השתמשנו ב-2 אחוז בקטו-אגר עבור מצע קרוש. לשם קבלת עקומת גדילה, תרבויות תאים דוללו בלילה ל-0.1 O.D, ותרבויות 200 מ”ל הונחו בצלחת מיקרוטיטר מודגרות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. צפיפות התאים נמדדה כל 30 דק’.

מוטגנזה מכוונת: מוטציות (apc11-C44A) נגרמו באתרים המוגדרים אמצעות טכניקת מוטגנזה. אימות נעשה באמצעות הרצפה.

תוצאות:

רמות Apc11 מבוקרות ע”י מערכת האוביקוויטין-פרוטוזום (UPS): ממצאינו מהווים ראיה לכך שרמות תקינות של Apc11 מבוקרות ע”י מערכת האוביקוויטין-פרוטוזום (UPS). ספציפית, כאשר מנענו ביטוי יתר של Apc11 אז רמות Apc11 נפלו. לעומת זאת, בנוכחות מעכב פרוטוזום רמות Apc11 נשארו גבוהות.

הדגרדציה של Apc11 מייצג מצב בו עודף חלבון איננו משולב אל תוך קומפלקס ה-APC/C: הראינו כיצד הנוכחות של מעכב פרוטוזום גורם להיווצרות עודפת של Apc11. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-Apc11 – ברמות עודפות – עובר הליך דגרדציה. ממצא זה מרמז על כך שהליך הדגרדציה של Apc11 הינו חלק מבקרה סדירה של ה-APC/C.  

Apc11 עובר הליך יוביקוויטינציה עצמוני ודגרדציה. כלומר, ללא תלות בקומפלקס לקידום אנפאזה (APC/C): תוצאותינו מעידות על היכולת שלApc11  לתווך באופן עצמוני יוביקוויטינציה (בעזרתו של Ubc4). כלומר, פעילות זו הינה מנגנון (נפרד) לדגרדציה של עודפי תתי יחידות שלא מצליחים להיטמע ב- APC / C.

רמות עודפות של Apc11 גורמות לפירוק טבעת הקוהזיה ולהפרדת כרומוזומים מוקדמת מדי: שיערנו כי התלמה של Scc1 בתאי G2/M עם רמות עודפות של Apc11 יספק אינדיקציה ברורה להליך יוביקוויטינציה מוקדם מדי (ודגרדציה) של Pds1, מה שגורם בסופו של הליך לשחרור Eps1. ואכן, ממצאינו הדגימו מקרה התלמה של Scc1 בתאי G2/M עם רמות עודפות של Apc11. התלמה זו (שהתרחשה רק בתנאי עם רמות עודפות של Apc11) משקפת אפקט דגרדציה )דטרימנטלי( של Pds1. תוצאות אלו תומכות ברעיון שברמות עודפות של  Apc11, תת היחידה הזו מתפקדת ללא תלות ובקרה של הקומפלקס לקידום אנפאזה (APC/C).

דיון:

במחקר זה השתמשנו בתאי שמר כדי להראות כיצד מערכת האוביקוויטין-פרוטוזום מתווכת את הדגרדציה של ה-Apc11. סיפקנו ראיות לכך שדגרדציה זו מבוקרת ע”י תת היחידה הקטליטית Apc11 (יחד עם האנזים E2). ראוי לציין כי גם חשפנו כיצד הצטברותן של תתי יחידות Apc11 עלול לגרום לפירוק טבעת הקוהזיה ולהפרדת כרומוזומים מוקדמת מדי. ממצא זה מרמז על כך שחוסר פרופורציות במרכיבים עלולה לגרום לפגיעה במוטציות של רווח-תפקוד (מוטציות הפעלה) ולא רק להפרעה של סטואיכיומטריה.

אובדן הבקרה של ה-APC/C המוצג במחקר זה תואם ממצאי מחקרים קודמים שהראו כיצד Apc11 – יחד עם האנזים E2 – הינם די לצורך פירוק סובסטרטים. אין אנו יודעים מהו המכניזם שגרם לאבדן הבקרה של הקומפלקס מקדם אנפאזה APC/C. עם זאת, פקטור אחד שכנראה מעורב בכך הינו ריכוז גבוה מדי של תתי יחידות Apc11. בהחלט ייתכן שריכוז גבוה זה ביטל את הצורך לאינטראקציה בין ה-APC/C והסובסטרטים. במצב נורמלי, Apc11 משולב בתוך ה-APC/C או שעובר הליך דגרדציה. עם זאת, ל-Apc11 בריכוז עודף יש את הפוטנציאל לפעול ללא בקרת ה-APC/C. ההשלכות הפיזיולוגיות הקשות של Apc11 שפועל ללא בקרת הקומפלקס לקידום אנפאזה (APC/C) עלה לאחרונה בשני מחקרים. במחקרים אלו, מצאו עדות לריכוז גבוה (עודף) של Apc11 בסרטן המעי הגס ואדנוקרצינומה. לפיכך, בקרה על Apc11 עלולה להגן מפני הליך כרומטיד לא סדיר.