חומצה גלקטורונית Galacturonic Acid Inhibits the Growth of Saccharomyces cerevisiae on Galactose, Xylose, and Arabinose

חומצה גלקטורונית מעכבת גדילה של שמר האפייה על גלקטוז, קסילוז וארבינוז

תסיסה יעילה של סובסטרטים מעורבים הינה חיונית להמרה מיקרוביאלית של חומרי גלם מדור שני, כולל מי קולחין עשירים בפקטין כמו קליפות של פירות הדר ועיסת סלק סוכר. חומצה גלקטורונית הינה מרכיב מרכזי בהידרוליזטים של חומרים אלו, העשירים בפקטין. שמר האפייה (Saccharomyces cerevisiae), המייצר העיקרי של ביו-אתנול, אינו מסוגל להשתמש בחומצת סוכר זו. ההשפעה של חומצה גלקטורונית על תסיסת אלכוהול באמצעות S. cerevisiae נחקרה בעזרת תרביות אצווה אנאירובית הגדלות על תערובת של גלוקוז וגלקטוז בריכוזי חומצה גלקטורונית שונים ועל תערובת של גלוקוז, קסילוז וארבינוז. בתרביות הגדלות ב- pH 5.0, הרבה מעל ערך ה- pKa של חומצה גלקטורונית (3.51), ההוספה של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית לא השפיעה על הקינטיקה והגדילה של תסיסת הגלקטוז. בתרביות שגודלו ב- pH 3.5, ההוספה של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית לא השפיעה באופן משמעותי על עיכול הגלוקוז. עם זאת, ברמת pH נמוכה זו, החומצה הגלקטורונית עיכבה לחלוטין את הצמיחה על גלקטוז והפחיתה את שיעור עיכול הגלקטוז ב- 87%. בנוסף, נמצא כי חומצה גלקטורונית מעכבת באופן משמעותי את התסיסה של קסילוז וארבינוז באמצעות זן ה- S. cerevisiae המהונדס IMS0010, הגורם לתסיסת פנטוז. הנתונים מצביעים על כך כי העיכוב מתרחש כאשר חומצה גלקטורונית לא-דיסוציאטיבית נמצאת מחוץ לתא ותומכים בהשערה כי שילוב של קצב ספיגת סובסטרטים מופחת הנובע מעיכוב תחרותי על Gal2p, דרישת אנרגיה מוגברת לצורך שימור הומיאוסטזיס תאי, ו/או הצטברות של חומצה גלקטורונית 1- זרחן תורמים לעיכוב זה. יש לקחת בחשבון את התפקיד של חומצה גלקטורונית כמעכבת תסיסת סוכר בעת תכנון תהליכי תסיסת שמרים המבוססים על חומרי גלם עשירים בפקטין.

השינוי שחל בביו-טכנולוגיה התעשייתית, משימוש בסירופ סוכר בזיקוק גבוה לשימוש במקורות אנרגיה ופחמן זולים וברי-קיימא, כמו הידרוליזטים של תאית עץ, מייצג בנוסף מעבר מיישום של חד-סוכרים ליישום של תערובות סובסטרט. רבים מהיישומים המקובלים של השמרים Saccharomyces cerevisiae כבר מבוססים על תערובות סובסטרט, כמו תערובת של גלוקוז ופרוקטוז בתירוש ענבים ותערובות של מלטוז, סוכרוז, גלוקוז ופרוקטוז בתירוש בירה. בדרך כלל, השמרים מעכלים תחילה את הסובסטרט המועדף עליהם, גלוקוז או פרוקטוז, על ידי דיכוי גלוקוז של הגנים המעורבים בספיגה ובעיכול של סובסטרטים אחרים. מצב זה מוביל לעיכול רציף של סובסטרטים מרובים, הידוע בתור גדילה דו-שלבית (diauxic growth).

הידרוליזטים של תאית עץ מהווים חומר גלם מבוקש עבור ייצור ביו-אתנול על ידי S. cerevisiae. הידרוליזטים אלו מכילים לא רק סוכרים תוססים, אלא גם מעכבים וסוכרים שאינם מותססים על ידי שמרים אלו. דוגמאות לחומרי גלם המכילים סובסטרטים מרובים הם עיסת סוכר סלק והידרוליזטים של קליפות פרי הדר (טבלה 1), המשמשים כיום בעיקר בתור מזון בעלי חיים. באופן חלופי, ניתן להעביר אותם הידרוליזה ולהשתמש בהם בתור סובסטרטים לתסיסה. בניגוד למקורות המקובלים של תאית עץ, כמו שאריות קני תירס, קש חיטה ודוחן, עיסת סוכר סלק וקליפות הדרים מכילים אמנם כמות קטנה יותר של ליגנין, אך במקום זאת מכילים כמות גדולה של פקטין. פקטין הינו רב-סוכר מורכב הבנוי משלד של שיירי חומצה גלקטורונית ועשוי להכיל שרשראות-צד המכילות מגוון סוכרים ניטראליים. בנוסף, ניתן להעביר את הפולימר מתיל-אסטריפיקציה ואציטלציה.

ההידרוליזטים של עיסת סוכר סלק וקליפות הדרים מורכבים בעיקר מגלוקוז, גלקטוז, ארבינוז, קסילוז וחומצה גלקטורונית (טבלה 1). הגלוקוז והגלקטוז מתעכלים ברצף על ידי זני בר של S. cerevisiae (ראה הערת שוליים 20). הגלקטוז עובר מטבוליזם דרך נתיב Leloir, המדוכא על ידי גלוקוז ומתעורר על ידי גלקטוז. חוסר היכולת של חלק מזני ה- S. cerevisiae לעבור מגדילה אנאירובית מוגבלת-גלוקוז לעיכול גלקטוז מדגימה את עלויות האנרגיה הקשורות בביטוי של האנזימים של נתיב Leloir. למרות שה- S. cerevisiae אינה מסוגלת להתסיס באופן טבעי את סוכרי הפנטוז קסילוז וארבינוז, ניתן להתגבר על מגבלה זו באמצעות מספר אסטרטגיות של הנדסת מטבוליזם. אחד ההבדלים העיקריים בין הידרוליזטים עשירים בפקטין לבין הידרולזיטים אחרים של תאית עץ, הוא הריכוז הגבוה של חומצה גלקטורונית (טבלה 1). זני בר של S. cerevisiae אינם מסוגלים להתסיס את חלק החומצה הגלקטורונית הנמצא בהידרוליזטים של עיסת סוכר סלק, ועד עתה, לא ניתן היה להשיג זאת גם באמצעות הנדסה מטבולית. כתוצאה מכך, כאשר עיסת סוכר סלק או קליפות הדרים משמשים כחומרי גלם להתססה אלכוהולית, תתקיים נוכחות של ריכוזים גבוהים של חומצה גלקטורונית בציר ההתססה.

חומצה גלקטורונית הינה החומצה האורונית של גלקטוז והיא בעלת קבוע דיסוציאציה (pKa) של 3.51. לפיכך, בערכי pH הרלוונטיים עבור תסיסת תאית עץ, גם הצורה הדיסוציאטיבית וגם הצורה הלא-דיסוציאטיבית של החומצה הגלקטורונית יהיו נוכחות. ידוע כי קיימות מספר חומצות אורגניות חלשות המשפיעות באופן שלילי על גדילת שמרים ותסיסה אלכוהולית כשהן נוכחות בצורתן הלא-דיסוציאטיבית. לפי מיטב ידיעתנו, ההשפעות המעכבות האפשריות של חומצה גלקטורונית על ביצועי השמרים טרם נחקרו בעבר. המטרה של המחקר הנוכחי היא לבדוק את ההשפעה של חומצה גלקטורונית על תסיסת סוכר באמצעות S. cerevisiae. לשם כך, תרביות אצווה אנאירוביות על תערובות של גלוקוז וגלקטוז הורצו על מגוון ריכוזי חומצה גלקטורונית, גם ב- pH אופטימאלי (pH 5.0) וגם ב- pH נמוך (pH 3.5). בנוסף, נחקרה ההשפעה של חומצה גלקטורונית על התסיסה של תערובות של גלוקוז, קסילוז וארבינוז בתרביות אנאירוביות של זן ה- S. cerevisiae המהונדס IMS0010, הגורם לתסיסת פנטוז.

טבלה 1: הרכב חלק דופן התא  של חומרי גלם עשירים בפקטיןa.

a – הנתונים הותאמו מהערת שוליים 14.

חומרים ושיטות

זנים ותחזוקה –  תרביות סטוק של זן המעבדה CEN.PK 113-7D של S. cerevisiae גודלו בבקבוקי רעד ב- 100 ml של תווך המכיל 1% (wt/vol) תמצית שמרי Bacto, 2% (wt/vol) פפטון Bacto, ו- 2% (wt/vol) גלוקוז. הזן IMS0010 מתסיס הפנטוז של S. cerevisiae גודל בתווך סינתטי המכיל 2% (wt/vol) של ארבינוז. לאחר הוספת 30% (wt/vol) גליצרול לתרביות פאזה נייחת, דגימות 1-ml אוחסנו ב- -80oC.

מדיה וגידול – גידול תווך סינתטי בבקבוקי טלטול בוצע ב- 30oC במטלטל סיבובי (200 rpm). ה- pH של התווך נקבע ל- 6.0 עם 2 M KOH לפני סטריליזציה. קדם-תרביות הוכנו על ידי אינוקולציה של 100 ml של תווך עם 1-ml של סטוק גליצרול. הגלקטוז (2%, wt/vol) שימש בתור מקור פחמן ואנרגיה עבור S. cerevisiae CEN.PK 113-7D, ו- 2% (wt/vol) של ארבינוז שימשו עבור S. cerevisiae IMS0010, אלא אם כן צוין אחרת. גידול האצוות בוצע ב- 30oC בביו-ריאקטורי מעבדה 2 ליטר, (Applikon, Schiedam, Netherlands) עם נפח עבודה של 1 ליטר. תווך סינתטי עם 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 גלקטוז או 20g ⋅ liter-1 גלוקוז, 10g ⋅ liter-1 ארבינוז ו- 10g ⋅ liter-1 קסילוז קיבל תוספת של 0.3g ⋅ liter-1 אנטי-קצף סיליקון (אנטי-קצף C; Sigma-Aldritch, St. Louis, MO) ותוספת של גורמי הגדילה האנאירוביים ארגוסטרול (0.01g ⋅ liter-1) וטווין 80 (0.42g ⋅ liter-1) שהומסו באתנול. אם התווספה חומצה גלקטורונית לתרביות, הן עברו סטריליזציית מסנן באופן נפרד. תרביות עם 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 חומצה גלוקורונית הוכנו באופן דומה; החומצה הגלוקורונית עברה בנוסף סטריליזציה באמצעות סטרילזציית מסנן. ה- pH של התרביות נשמר ב- 3.5 או 5.0 על ידי הוספה אוטומטית של 2 M KOH. התרביות עורבבו ב- 800 rpm ועברו התזה של 0.5 liters ⋅ min-1 חנקן (< 10 ppm חמצן). על מנת לצמצם את הדיפוזיה של החמצן, הביו-ריאקטורים צוידו עם צינורות נורפרן (saint-Gobain Performance Plastics, Courbevoie, France) ואטמי o-ring של Viton (Eriks, Alkmaar, Netherlands).

קביעת סובסטרטים, מטבוליטים, משקלי תרביות יבשים, ושיעורים – המשקל היבש של התרביות נמדד בהתאם לשיטות שתוארו בעבר אצל Postma ועמיתיו. בנוסף, גדילת התרביות נוטרה על ידי קריאות של הדחיסות האופטית באורך גל של 660 nm (OD660) על ספקטרופוטומטר Novaspec 2 (GE Life Sciences, Diegem, Belgium). החלקיקים הצפים נאספו על ידי צנטריפוגה של דגימות תרבית, ונותחו באמצעות ניתוח כרומטוגרפיית נוזל בלחץ גבוה (HPLC) על מכשיר HPLC Waters Alliance 2690 (Waters, Milford, MA) המכיל עמודת Bio-Rad HPX 87H (Bio-Rad, Hercules, CA). העמודה דוללה ב- 60oC עם 0.5g ⋅ liter-1 H2SO4 בקצב זרימה של 0.6 ml ⋅ min-1. הגילוי נעשה בעזרת גלאי מקדם-שבירה Waters 2410 וגלאי UV Waters 2487. בעת חישוב השיעור והניצולת של ייצור האתנול, בוצע תיקון עבור התאיידות האתנול בגזים, כפי שתואר בעבר על ידי גואדלופ מדינה ועמיתיו.

שיעורי הגדילה ושיעורים ספציפיים התבססו על סטויכיומטריה קבועה בזמן שלבי גדילה אקספוננציאליים. בשלב עיכול הגלקטוז של תסיסות האצווה עם 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית, לא נרשמה גדילה, ולא ניתן היה להיעזר בגישה שצוינה מעלה. במקום זאת, השיעורים הספציפיים הממוצעים נקבעו במהלך שלב זה.

ניתוח גזים – הגז הנפלט קורר בקונדנסר (2oC) ויובש בעזרת מייבש Permapure דגם MD-110-48P-4 (Permapure, Toms River, NJ). ריכוזי הפחמן הדו-חמצני נקבעו בעזרת אנלייזר NGA 2000 (Rosemount Analytical, Orrville, OH). שיעורי הזרימה של גז הפליטה ושיעורי הפקת הפחמן הדו-חמצני נקבעו כפי שתואר במחקרים קודמים. בעת חישוב שיעורים אלו, הספציפיים לביו-מסה, בוצע תיקון עבור שינויי נפח הנגרמים בשל הוצאת דגימות התרבית.

יכולת הקיימות של התרביות – מדידות הקיימות בוצעו בעזרת ערכת קיימות שמרים פרופידיום יודיד Fungalight CFDA (5-קרבוקסי-פלואורצאין דיאצטט) AM (אצטוקסמתיל אסטר) (Invitrogen, Carlsbad, CA) על ידי ספירת 3000 תאים על ציטומטר זרימה Cell LaB Quanta SC MPL ( Beckman Coulter, Woerden, Netherlands) בהכפלה, כפי שתואר בעבר על ידי בונדר ועמיתיו.

בדיקת פעילות אנזימים – תמציות תאים לבדיקות פעילות גלקטוקינאז הוכנו מתרביות בקבוקי טלטול בעלות גדילה אקספוננציאלית, כשהגלקטוז משמש בתור מקור פחמן, ועברו ניתוח למציאת תכולת חלבונים כפי שתואר בניסויים קודמים. הגלקטוקינאז נבדק עם תמציות תאים טריות בהתאם לשיטות שתוארו במחקרים קודמים, עם ההתאמות הקלות הבאות: הוספת 13 יחידות של פירובט קינאז ו- 14.3 יחידות של לקטט דהידרוגנאז (שניהם מ- Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). כמות של 0.5-mol ⋅ liter-1 תמיסת חומצה גלקטורונית בתוך 1 M חוצץ אשלגן זרחתי (pH 7.5) שימשה כדי למנוע שינויי pH בתערובת הבדיקה והתווספה לריכוז סופי של 5 mmol ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית.

מדידת נגזרות החומצה הגלקטורונית – שתי תרביות אצווה עצמאיות עם 10g ⋅ liter-1 גלוקוז, 10g ⋅ liter-1 גלקטוז, ו- 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית נדגמו לצורך מדידת מטבוליטים תוך-תאיים בנקודה שבה שיא ה- CO2 של שלב עיכול הגלקטוז בדיוק עבר את המקסימום שלו. הדגימות נלקחו ועובדו בהתאם לשיטות שתוארו במחקרים קודמים. הריכוזים של המטובליטים חומצה גלקטורונית 1- זרחן וחומצה גלקטורונית UDP  נקבעו באמצעות יינון אלקטרוספריי-כרומטוגרפיית נוזל-ספקטרומטריית מסה בטנדם (ESI-LC-MS/MS). הכיול בוצע עם תערובת סטנדרטית של חומצה גלקטורונית 1-זרחן וחומצה גלקטורונית UDP (CarboSource Services, Athens, GA), והפרגמנטים ב- m/z 97 ו- m/z 403, בהתאמה, שימשו לקביעת הריכוזים.

תוצאות

חומצה גלקטורונית מעכבת עיכול גלוקוז בתסיסה אנאירובית ב- pH נמוך – תרביות אצווה אנאירוביות על תערובת של גלוקוז וגלקטוז בוצעו ללא חומצה גלקטורונית, בתור רפרנס (איור 1A ו- B). תחת תנאים אנאירוביים, הגלוקוז והגלקטוז תוססים לכמויות אקוימולריות של אתנול ו- CO2. הייצור של CO2, שנוטר באופן רצוף דרך ריכוזי ה- CO2 בגז, מהווה לפיכך מידה של שיעור התסיסה. לא נרשמו הבדלים משמעותיים בקינטיקות התסיסה בין התרביות הגדלות ב- pH 5.0 (איור 1A) לבין אלו הגדלות ב- pH 3.5 (איור 1B). השיא הראשון בפרופיל ה- CO2 המייצג את שלב עיכול הגלוקוז (איור 2), הושלם תוך 11 שעות. בהמשך לכך, האינדוקציה של נתיב Leloir אפשרה עיכול מלא של הגלקטוז ב- 10 השעות הבאות, כפי שניתן להסיק מהשיא השני בפרופיל ה- CO2.

איור 1: השפעת החומצה הגלקטורונית על ביצועי ה- S. cerevisiae CEN.PK 113-7D במהלך הגדילה על תערובות גלוקוז-גלקטוז בתסיסת האצוות. התוצאות של ניסוי אצווה מייצג אחד מוצגות עבור כל מצב. ניסויים חוזרים הניבו תוצאות דומות. ביצועי התסיסה נלמדים מה- CO2 (אחוזים) בגז הפליטה של תרביות אצווה אנאירוביות של S. cerevisiae CEN.PK 113-7D, שהוצפו בגז חנקן בשיעור קבוע של 0.5 liters ⋅ liter-1 ⋅ h-1. (A) תרביות שגודלו ב- pH 5.0 על תערובת של 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 גלקטוז, עם 0g ⋅ liter-1 (∙), 5g ⋅ liter-1 (■), או 10g ⋅ liter-1 (▲) חומצה גלקטורונית. (B) תרביות שגודלו ב- pH 3.5 על תערובת של 10g ⋅ liter-1 גלוקוז, 10g ⋅ liter-1 גלקטוז, ו- 0g ⋅ liter-1 (∙),g ⋅ liter-12.5 ( ),5g ⋅ liter-1 (■),7.5g ⋅ liter-1 (⬜), או 10g ⋅ liter-1 (▲) חומצה גלקטורונית. (C) תרביות שגודלו ב- pH 3.5 על תערובת של 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 חומצה גלוקורונית (△).

על מנת לבחון את ההשפעות של חומצה גלקטורונית על התסיסה של תערובות סוכר, תרביות אצווה אנאירוביות גודלו על תערובת של גלוקוז וגלקטוז (10g ⋅ liter-1 כל אחד) עם ריכוזי חומצה גלקטורונית של לא יותר מ- 10g ⋅ liter-1. ב- pH 5.0, כאשר 97% מהחומצה הגלקטורונית נוכחים בתור האניון, ההוספה של 5 או 10g ⋅ liter-1 גלקטורונאט לא השפיעה על שלב עיכול הגלוקוז והייתה לה רק השפעה מועטה על פרופילי ה- CO2 במהלך שלב עיכול הגלוקוז (איור 1A).

איור 2: גדילה וייצור מטבוליטים בתרביות אצווה אנאירוביות של S. cerevisiae CEN.PK 113-7D ששוכפלו ב- pH 3.5 על תערובת של 10g ⋅ liter-1 גלוקוז (⬜) ו- 10g ⋅ liter-1 גלקטוז (▲) בהעדר חומצה גלקטורונית (A) ובנוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית (B). אתנול (⬤), גליצרול ( ) ומשקל ביו-מסה יבש (DW) (■) נוצרו במהלך תסיסות אלה.

טבלה 2: פרמטרים פיזיולוגיים של תרביות אצווה אנאירוביות (pH 3.5) של S. cerevisiae CEN.PK 113-7D הגדלות על תערובת של 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 גלקטוז בנוכחות ובהעדר 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית.

a – בהעדר גדילה, שיעורים ספציפיים במיצוע-זמן נקבעו במהלך שלב זה.

ב- pH 3.5, חצי מהחומצה הגלקטורונית (pKa = 3.51) תהיה נוכחת בתור חומצה לא-דיסוציאטיבית, והחצי השני יהיה נוכח כאניון. לפיכך, השוואת נתונים מניסויי הגדילה ב- pH זה, מול נתונים מניסויים שבוצעו ב- pH 5, מאפשרים בידול בין ההשפעות של שני מינים אלו. ההוספה של חומצה גלקטורונית בריכוזים של 2.5, 5.0, 7.5 או 10g ⋅ liter-1 לא השפיעה על שלב עיכול הגלוקוז ב- pH 3.5, כפי שניתן ללמוד משני השיאים הזהים כמעט לחלוטין בפרופיל ה- CO2 (איור 1B). עם זאת, בניגוד חד לניסויים ב- pH 5.0, נרשמה השפעה משמעותית של הוספת החומצה הגלקטורונית על שלב עיכול הגלוקוז ב- pH 3.5. כבר עכשיו, בריכוז של 2.5g ⋅ liter-1 החומצה הגלקטורונית האריכה את זמן שלב עיכול הגלוקוז ב- 27% (מ-11 שעות ל- 14 שעות). ב- 5g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית, המשך של שלב עיכול הגלוקוז כמעט והוכפל בהשוואה לזה של תרבית הרפרנס. עיכוב גדול אף יותר של תסיסת הגלוקוז נצפה אצל תרביות שגודלו עם 7.5g ⋅ liter-1 ו- 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית, שבהן שלבי עיכול הגלוקוז נמשכו 58 שעות ו- 81 שעות, בהתאמה. בתרביות הרפרנס, השיעור של ייצור CO2 בזמן שלב הגלוקוז ירד באופן חד לאחר שהגיע לערך המקסימאלי שלו. בתרביות שגודלו ב- pH 3.5 בנוכחות של חומצה גלקטורונית, הפחתה זו בשיעורי ייצור ה- CO2 הייתה הדרגתית בהרבה. שיעור תסיסה פוחת מסוג זה, יחד עם שיעור תסיסת גלוקוז פוחת, מצביעים על כך שהחומצה הגלקטורונית גורמת לזיקה פחותה של תאי השמרים עבור הגלקטוז.

לאחר דלדול הסוכר, כאשר ריכוזי החומצה הגלקטורונית בתרביות האצווה האנאירוביות נמדדו, לא נצפה עיכול משמעותי עבור כל אחת מהתרביות שגודלו ב- pH 5.0 או התרביות שגודלו ב- pH 3.5. ממצא זה הינו עקבי לדיווחים קודמים לגבי חוסר היכולת של S. cerevisiae לגדול על חומצה גלקטורונית.

ניתוח פיזיולוגי של עיכוב מטבוליזם הגלקטוז על ידי חומצה גלקטורונית – על מנת לקבל תובנות נוספות לגבי העיכוב הנצפה של מטבוליזם הגלקטוז על ידי חומצה גלקטורונית, עיכול הסוכר, ייצור האתנול והגדילה נקבעו בניסויי תסיסה כפולים עצמאיים עם תערובת של 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 גלקטוז, עם 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית ובלעדיה, ב- pH 3.5. הממצא מפרופילי ה- CO2 על כך שלחומצה גלקטורונית יש השפעה מינורית על שלב הגלוקוז (איור 1, 2A ו- 2B) אושש. לחומצה הגלקטורונית היה בנוסף אפקט גירוי קל על שיעור הגדילה הספציפי (μ עלה מ- 0.28 ± 0.00 ל- 0.32 ± 0.01 h-1; p < 0.06) ועל שיעור עיכול הגלוקוז (qs עלה מ- 14.4 ± 0.4 ל- 15.8 ± 0.2 mmol ⋅ g [dry weight]-1 ⋅ h-1; p < 0.09).

באופן עקבי להפחתה המשמעותית בשיעור הייצור של CO2 (איור 1), ההוספה של 10g ⋅ liter-1 חומתה גלקטורונית הפחיתה (p < 0.01) את קצב עיכול הגלקטוז מ- 4.6 ± 0.4 לקצב ממוצע של 0.6 ± 0.0 mmol ⋅ g (dry weight)-1 ⋅ h-1 (טבלה 2). בעת הנוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית, ריכוז הביו-מסה נותר קבוע לאחר שהגלוקוז עוכל לחלוטין, מה שמצביע על כך שתסיסת הגלקטוז לא הייתה קשורה לגדילה. ריכוז הגליצרול הסופי עלה (p < 0.002) מ- 14.4 ± 0.1 mM בתרביות הרפרנס ל- 16.9 ± 0.0 mM בתרביות עם החומצה הגלקטורונית (איור 2). היווצרות הגליצרול (בלחץ אוסמוטי נמוך) קשורה לרה-אוקסידציה של NADH עודף, היכול להיווצר על ידי ביו-סינתזה או מהיווצרותם של תוצרים מחומצנים, כמו חומצה אצטית. אכן, ריכוז הגליצרול הגבוה אוזן על ידי עלייה (p < 0.04) בריכוז הסופי של חומצה אצטית, מ- 0.5 ± 0.1mM ל- 3.6 ± 0.0 mM, למרות הירידה בהיווצרות הביו-מסה. בנוסף, הופקו כמויות קטנות (< 1mM) של פירובאט ולקטאט, אך לא נצפו השפעות משמעותיות של החומצה הגלקטורונית על הריכוזים שלהם (הנתונים אינן מוצגים).

בכדי לבדוק האם הפעילות המטבולית הנמוכה במהלך שלב עיכול הגלקטוז בנוכחות של 10g ⋅ liter-1  חומצה גלקטורונית נגרמה בשל קיימות מופחתת של התרבית, פרמטר זה נבדק על ידי הכתמת קיימות וציטומטריית זרימה. קיימות התרביות נותרה ב- 81% ± 8% 20 שעות לאחר תחילת שלב עיכול הגלקטוז (גיל האצווה 31.5 שעות).

חומצה גלקטורונית מעכבת תסיסת פנטוז באמצעות S. cerevisiae מהונדס – בתרביות האצווה של IMS0010, זן מהונדס של S. cerevisiae המסוגל לעכל באופן יעיל תערובת של גלוקוז, קסילוז וארבינוז, בדקנו האם החומצה הגלקטורונית מעכבת בנוסף גדילה על קסילוז ו/או ארבינוז. לשם כך, ה- IMS0010 הוכן בקדם-תרבית על ארבינוז ואופיין על ידי שימוש בתערובות של 20g ⋅liter-1 גלוקוז, 10g ⋅ liter-1 קסילוז, ו- 10g ⋅ liter-1 ארבינוז בביו-ריאקטורים אנאירוביים בנוכחות ובהיעדר  10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית ב- pH 3.5 (איור 3). בהיעדר חומצה גלקטורונית, הגדילה והמטבוליזם היו זהות למדי לאלו שתוארו במחקרים קודמים לגבי גדילה ב- pH 5.0: ראשית, הגלוקוז עוכל, ולאחר מכן הקסילוז והארבינוז עוכלו לחלוטין, בו-זמנית, בתוך 40 שעות (איור 3A). להוספת 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית למערך ניסויי זהה לחלוטין הייתה השפעה דראסטית על ביצועי התסיסה של IMS0100. למרות שקצב עיכול הגלוקוז לא השתנה באופן משמעותי, העיכול של סוכרי הפנטוז הושפע באופן דראסטי. כפי שראינו במקרה ללא החומצה הגלקטורונית, בריכוזי גלוקוז של פחות מ- 10g ⋅ liter-1, חלק מהקסילוז (28%) וחלק מהארבינוז (14%) עוכלו, בעוד שיתר הגלוקוז התכלה. באופן ראוי לציון, בנוכחות של חומצה גלקטורונית ב- pH 3.5, העיכול של קסילוז וארבינוז הופסק מיידית לאחר התכלות הגלוקוז (איור 3B), מה שמצביע בבירור על כך כי החומצה הגלקטורונית מעכבת בנוסף את תסיסת הפנטוז אצל S. cerevisiae IMS0010.

איור 3: גדילה וייצור מטבוליטים בתרביות אצווה אנאירוביות של S. cerevisiae IMS0010 שגודלו ב- pH 3.5 על תערובת של 20g ⋅liter-1 גלוקוז (⬜),10g ⋅ liter-1 קסילוז (△), ו- 10g ⋅ liter-1 ארבינוז (▼) ללא חומצה גלקטורונית (A ו- C) ועם נוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית (B ו- D). אתנול (⬤), גליצרול ( ) ומשקל ביו-מסה יבש (■) נוצרו במהלך תסיסות אלו. הנתונים מגיעים מגידולים של אצווה בודדת ומייצגים ניסויים חוזרים.

חומצה גלקטורונית אינה מעכבת תסיסת גלוקוז – חומצה גלקטורונית (pKa 3.28) הינה החומצה האורונית הנגזרת מגלוקוז. על מנת לחקור האם העיכוב הנחזה של מטבוליזם הגלקטוז על ידי החומצה הגלקטורונית משקף השפעה כללית יותר של חומצות אורוניות על מטבוליזם סוכר באמצעות שמרים, תרביות אצווה אנאירוביות גודלו ב- pH 3.5 על 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 חומצה גלוקורונית. בניסויים אלו, התאים הוכנו בקדם-תרביות על גלוקוז, מכיוון שהאינדוקציה של נתיב Leloir לא הייתה נחוצה. ב- pH 3.5, 38% מהחומצה נמצאת בצורתה הלא-דיסוציאטיבית. החומצה הגלוקורונית לא השפיעה בצורה משמעותית על מאפייני התסיסה על הגלוקוז, כפי שניתן ללמוד מפרופילי ה- CO2 הזהים כמעט לחלוטין בנוכחות ובהיעדר חומצה גלוקורונית (איור 1C).

אינטראקציות אפשריות של חומצה גלקטורונית עם הגלקטוקינאז – כאשר ריכוזי הגלוקוזה הם נמוכים, גני ה- Gal עוברים אינדוקציה גם בזני בר של תאי S. cerevisiae הגדלים על גלקטוז וגם בתאי IMS0010 הגדלים על ארבינוז. מכיוון שגלקטוז וחומצה גלקטורונית הן תרכובות קשורות מבחינה מבנית, העיכוב (התחרותי) של גלקטוקינאז (Gal1p) עשוי להסביר את ההשפעה החזקה של החומצה הגלקטורונית על עיכול הגלקטוז. על מנת לבחון השערה זו, נבדקו האנזימים הראשונים בנתיב Leloir, בתמציות תאים של תרביות בקבוקי טלטול שגדלו על גלקטוז. גם בנוכחות וגם בהיעדר של 5 mmol ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית בתערובות הבדיקה, כמות זהה לריכוז הגלקטוז, פעילות הגלקטוקינאז הספציפית בתמציות התאים הייתה 1.1 ± 0.2 U ⋅ mg protein-1. ממצא זה מדגים כי ריכוז זה של חומצה גלקטורונית אינו מעכב את פעילות הגלקטוקינאז in vitro. פעילויות זירחון של חומצה גלקטורונית in vitro, שנבדקו בעזרת בדיקת גלקטוקינאז מותאמת, נותרו מתחת לגבול הזיהוי של 0.028 U ⋅mg protein-1.

על מנת לחקור את הזירחון האפשרי in vivo של חומצה גלקטורונית, העשוי להוביל להצטברות תוך-תאית של חומצה גלקטורונית 1-זרחן, הדגימות נאספו במהלך שלב עיכול הגלקטוז של תרביות שגודלו על תערובת של 10g ⋅ liter-1 גלוקוז ו- 10g ⋅ liter-1 גלקטוז בנוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית ב- pH 3.5. בנוכחות של חומצה גלקטורונית, זוהה ריכוז תוך-תאי של חומצה גלקטורונית 1-זרחן של 1.02 ± 0.15 μmol ⋅ g(dry weight)-1, שהוא יותר מפי 50 גבוה יותר ממדידות הבקרה שנלקחו ללא נוכחות של חומצה גלקטורונית. הריכוז של חומצה גלקטורונית UDP, הנוצר בתגובה אנלוגית לתגובות נתיב Leloir שנגרמו על ידי גלקטוז-1-זרחן יורידיל-טרנספראז (Gal7p), לא היה שונה מזה של הבקרה, ונותר מתחת ל- 13 mmol ⋅ g(dry weight)-1.

דיון

מנגנון העיכוב הנוצר על ידי חומצה גלקטורונית – רמות העיכוב השונות ב- pH 3.5 וב- pH 5 מצביעות על כך שההשפעה הנצפית על מטבוליזם הגלקטוז מתרחשת כאשר חומצה גלקטורונית לא-דיסוציאטיבית נוכחת באופן חוץ-תאי. בנוסף, ההבחנה של חומצה גלקטורונית 1-זרחן חוץ-תאית מצביעה על כך שלפחות מהחומצה הגלקטורונית יכולה להיכנס לתא השמרים ב- pH 3.5. מכיוון שדיפוזיה חופשית על פני ממברנת התא של מולקולה קוטבית במיוחד כמו חומצה גלקטורונית אינה סבירה, ייתכן ופרמיאז מעורב בשינוע של חומצה גלקטורונית. חומצות אורוניות, במיוחד כשהן ללא מטען ולפני פרוטונציה, הן בעלות דמיון מבני חזק לסוכרי האלדוז התואמים. לפיכך, העיכוב התחרותי של נשא הגלקטוז Gal2p, שב-IMS0100 אחראי בנוסף לנשיאת ארבינוז, מציע מנגנון אפשרי לעיכוב חומצה גלקטורונית. העיכוב התחרותי באמצעות ריכוז קבוע של חומצה גלקטורונית אמור להיות בולט יותר כאשר הריכוז של המינים (הנישאים) האחרים פוחת בגלל העיכול שלו על ידי תאי השמרים. מצב זה אכן נצפה במהלך הגדילה האנאירובית על תערובות גלוקוז-גלקטוז בנוכחות של חומצה גלקטורונית ב- pH 3.5 (איור 1). בהתאם לכך, זן של gal2Δ שאינו מסוגל לגדול על גלקטוז או על ארבינוז ובשל כך לא נכלל במחקר זה, התגלה כפחות רגיש לחומצה גלקטורונית (לפי E. H. Huisjes ועמיתיו). לעומת זאת, העובדה כי חומצה גלקטורונית מעכבת בנוסף את התסיסה של קסילוז, שאינו נישא (רק) על ידי Gal3p, מצביעה על כך שחומצה גלקטורונית היא בעלת השפעות מעכבות נוספות.

ברגע שחומצה גלקטורונית נכנסת לציטופלסמה של S. ceverisiae (ייתכן ודרך Gal2p), מתאפשרים מנגנונים רבים נוספים של עיכוב. בציטוסול, החומצה הגלקטורונית עוברת דיסוציאציה בשל ה- pH הבין-תאי הקרוב לניטראלי, ופוטנציאלית מובילה לטוקסיות חומצה אורגנית חלשה קלאסית. מכיוון שחומצה גלקטורונית אינה יכולה לעבור מטבוליזה על ידי S. cerevisiae, האניון מצטבר, מה שיכול לעכב תהליכים תאיים, או מופרש על חשבון ATP. בנוסף, על מנת לשמר הומיאוסטזיס pH, על הפרוטון להיות מיוצא על ידי ממברנת פלסמה H+-ATPase שב- S. cerevisiae דורשת מולקולת ATP אחת. אנרגיית השימור הדרושה לגדילה אנאירובית על גלוקוז דווחה בעבר כ- 1 mmol ⋅ g(dry weight)-1 ⋅ h-1. ייצור ה- ATP הקשור בקצב עיכול הגלקטוז הנצפה ב- pH 3.5 בנוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית יהיה 1.2 mmol ATP ⋅ g(dry weight)-1 ⋅ h-1, והוא היה למעשה רק מעט מעל ערך זה. במצב כזה, דרישת האנרגיה הגבוהה יותר הדרושה לשימור הומיאוסטזיס תאי בשילוב עם שיעור ספיגת סובסטרט נמוך בשל העיכוב התחרותי של Gal2p יוביל למצב שבו אין די ATP זמין על מנת לאפשר גדילה. ממצא זה הינו עקבי להבחנה כי הגלקטוז עוכל, ורוב האוכלוסייה נותרה ברת-קיימא, אך לא התרחשה גדילה ב- pH 3.5 בנוכחות של 10g ⋅ liter-1 חומצה גלקטורונית. מכיוון שאפילו בהיעדר חומצה גלקטורונית, שיעורי העיכול של הקסילוז והארבינוז הם כבר נמוכים יותר מזה של הגלקטוז, ההשפעות של עיכוב תחרותי וטוקסיות חומצה אורגנית חלשה יהיו דרסטיות אף יותר. מנגנון עיכוב אפשרי נוסף קשור לריכוזים הבין-תאיים הנמדדים של חומצה גלקטורונית 1-זרחן (ca. 1 μml ⋅ g[dry weight]-1), שהיו באותו טווח כמו הריכוזים של הקסוז-זרחן המשמשים כמתווכים של מטבוליזם שמרים מרכזי, כמו גלוקוז-6-זרחן או פרוקטוז-6-זרחן. למרות שבעבר הן לא תוארו לגבי חומצה גלקטורונית 1-זרחן, ההשפעות המעכבות של תרכובות מזורחנות תועדו היטב. לריכוזים גבוהים של סוכרי UDP יש השפעות טוקסיות, אך ריכוז החומצה הגלקטורונית UDP הבין-תאית נותר מתחת לגבול הזיהוי של מחקר זה. בהסתכלות כללית, הניסויים שכללו גם את התערובות של גלוקוז וגלקטוז וגם את התערובת של גלוקוז, קסילוז וארבינוז, איששו את ההשערה כי שילוב של מספר מנגנונים הוא האחראי לעיכוב הנגרם על ידי חומצה גלקטורונית.

במחקר זה לא נמצאו ראיות כלשהן לעיכוב של תסיסת גלוקוז על ידי חומצה גלוקורונית. ב- S. cerevisiae, נשיאת הקסוז מתאפשרת על ידי לפחות 20 חברים שונים במשפחת ההקסוז והמלטוז. בהינתן הגיוון הרב בזיקות של נשאי הקסוז שונים עבור גלוקוז וחד-סוכריים אחרים, נראה סביר כי לפחות חלקם הם בעלי קבוע מעכב נמוך עבור חומצה גלוקורונית. בנוסף, השיעור הגבוה יותר של תסיסת ATP הנובע מההמרה המהירה של גלוקוז לאתנול עדיין יאפשר גם גדילה וגם תחזוקה תאית.

ההשפעה של חומצה גלקטורונית על מאפייני התסיסה של חומרי גלם עשירים בפקטין – התסיסה האלכוהולית היעילה של תערובות סוכר, במיוחד כאשר מדובר בסובסטרטים לא-טבעיים של S. cerevisiae כמו קסילוז וארבינוז, היא מאתגרת כשלעצמה גם ללא תרכובות מעכבות. ההשפעה החזקה והשלילית של ריכוזים נמוכים יחסית של חומצה גלקטורונית על התסיסה של גלקטוז, קסילוז וארבינוז באמצעות S. cerevisiae מייצגת אתגר שטרם היה ידוע לנו. פתרונות תכנון תהליך אפשריים כוללים הפעלת תהליכי תסיסה בערכי pH המאפשרים גדילה של S. cerevisiae בריכוזי החומצה הגלקטורונית הדרושים או הפחתה של ריכוזי הסוכר הכוללים. עם זאת, הגישה הראשונה עלולה להגדיל את הסיכוי לזיהום, בעוד שהגישה השנייה מובילה לריכוזי תוצר נמוכים ולפיכך לעלויות גבוהות של זיקוק אתנול. תצפיות קודמות לגבי ההשפעות של חומצה אצטית ב- pH נמוכים על שיעורי עיכול הקסילוז בתערובות קסילוז-גלוקוז הראו כי ניתן להתגבר על בעיה זו באמצעות הזנה מוגבלת גלוקוז, על מנת לספק את ה- ATP הדרוש בכדי להתגבר על ההשפעות הטוקסיות. אסטרטגיה תפעולית פשוטה יחסית מסוג זה עשויה גם להקל על טוקסיות החומצה החלשה של החומצה הגלקטורונית אך אינה משפיעה על העיכוב התחרותי של חומצה גלקטורונית על הנשיאה.

באופן חלופי, ניתן להתגבר על עיכוב חומצה גלקטורונית באמצעות הנדסה מטבולית או אבולוציונית. בניסויים קודמים, הנדסה אבולוציונית נמצאה כמסוגלת לשפר גם את התסיסה של תערובות גלוקוז, קסילוז וארבינוז, וגם את קינטיקות התסיסה של זנים מהונדסים עבור סובסטרט הקסילוז הלא-ילידי בנוכחות של חומצה אצטית. ייתכן וגישה כזו תניב בנוסף זני שמרים המסוגלים ליישם סובסטרטים מעורבים בנוכחות של חומצה גלקטורונית. ברור מאליו כי יהיה זה רווחי אף יותר ליצור מטבוליזציה של חומצה גלקטורונית, ועדיף לעשות זאת על ידי המרתה לאתנול. למרות שזני בר של S. cerevisiae אינם מסוגלים להתסיס חומצה גלקטורונית, קיימים יתרונות רבים ההופכים שמרים לאורגניזם המועדף עבור ייצור ביו-אתנול מחומרי גלם מדור שני, העשירים בפקטין. ההשלכות של הטמעת מסלולים מטבוליים ממיקרו-אורגניזימים אחרים המסוגלים לעכל חומצה גלקטורונית ב- S. cerevisiae באופן טבעי תוארו במחקרים קודמים. כל עוד אסטרטגיות אלו אינן מוטמעות בפרקטיקה, עיכוב על ידי חומצה גלקטורונית ימשיך לייצג סוגיית מפתח בייצור מבוסס השמרים של ביו-אתנול ומוצרים אחרים מחומרי גלם עשירים בפקטין.