יצירת תאי T אנושיים מסוג CD19-CAR באורגניזם החי In vivo generation of human CD19-CAR T cells results in B-cell depletion and signs of cytokine release syndrome

יצירת תאי T  אנושיים מסוג  CD19-CAR  באורגניזם החי (in-vivo) גורם לדלדול תאי B ולהופעת סימנים המשויכים לתסמונת שחרור ציטוקינים

תקציר

תאי T עם קולטן לאנטיגן כימרי (CAR) מקנים יתרון משמעותי אצל חולים שיש להם תאי B ממאירים. יחד עם זאת, ייצור תאי T-CAR  (תאי T עם קולטני CAR) מצריך הליכים מורכבים אשר מפריעים  לשרשרת  האספקה הרחבה. כאן, אנו מראים הוכחה לכך שניתן לייצר תאי T אנושיים מסוג CD19-CAR באורגניזם חי (in vivo), באמצעות ויקטור לנטי-ויראלי CD80LV   שמכוון ספציפית לתאי +8CD  אנושיים. מתן תאי ראג’י- לימפומה ותאים חד גרעיניים ממקור אנושי שנלקחו מדם פריפריאלי, ברקמה ממקור עכברי ,גרמו לביטוי CAR אך ורק בתאי +8CD ולסילוק אפקטיבי של תאי B מסוג +19CD. יתרה מזאת, כתוצאה מהזרקת תאי LV – 8CD אל עכברים מושתלים בתאי +4CD אנושיים, נצפתה עלייה בתאי CAR-T וירידה בתאי +19CD- B אצל 7 מתוך 10 חיות שטופלו. יש לציין ששלושה עכברים הראו רמות גבוהות של ציטוקינים אנושיים בפלזמה. התפשטות תאי CAR-T ברקמה וחיסול מוחלט של  B- לימפוציטים בטחול משמשים כאינדיקציה לתסמונת שחרור ציטוקינים. הנתונים שלנו מראים שקיימת ישימות בתכנות מחדש של פעילות תאי  CD8+ CAR T כנגד תאי +19CD באמצעות IN-VIVO, אולם, עם תופעות לוואי אשר כיום ידועות לשמצה ברפואה.

הקדמה

מודיפיקציות גנטיות הנעשות על תאי T  עם קולטן לאנטיגן כימרי (CARs) לשם זיהוי אנטיגניים על פני תאים ממאירים, נהייתה אופציה ברת-תוקף לטיפול חיסוני לחולי סרטן (Lim & June, 2017). בשנות האחרונות, יותר מ- 200 ניסוי קליני נעשו על מנת לחקור ולהבין את השפעת תאיCAR -T   המיוצר מחוץ לגוף (ex vivo) (Chmielewski & Abken,2015 ; Hartmann et al, 2017) במיוחד, לטיפול בתאי pre-B  ותאי B ממאירים. עד כה, התקבלו תגובות מרשימות במיוחד עם תאי CAR המכוונים ל 19CD, אשר זכו לאחרונה באישור הFDA לשיווק שני מוצרים ( Sadelain, 2017& Riviere). השקעת מאמצים אינטנסיביים נמשכת על מנת להרחיב את גישת תאי ה CAR T  לכדי גידולים נוזליים ומוצקים ולזיהומים נגיפיים מתיישים (Irving et al, 2017).

קולטנים לאנטיגניים כימרים מורכבים מרכיב קושר אנטיגן, אשר לרוב מורכב מפרגמנט נוגדני חד- שרשרתי (scFv) ומדומיינים קושרים ממברנה וכאלה שחוצים את הממברנה ואחרים קשורים לאיתות תוך תאי אשר נגזרים משרשרת CD3f ו CD28 או 4-1BB. זיהויו של רכיב זה לאנטיגן וקשירתו גורמים  להפעלת  תאי CAR-T  , התפשטותם ולחיסול תאי היעד. לאחר חיסול תאי היעד ובשל מאפייני איתות פנימיים, רמות תאי CAR- Tיורדות בתפוצה רחבה. אף על פי כן, בחלק מהניסויים הקליניים, הראו שתאי  CD19-T-CAR המשיכו לתפקד בגופי החולים למשך שנים (Porter et al, 2015).

תאי T עם קולטנים לאנטיגניים כימיריים נחשבים כאמצעי לטיפול מותאם אישית. הליך היצור, מתחיל בהפקת תאי T מהחולה, אשר עוברים מודיפיקציה גנטית, לאחר מכן נותנים להם להתפשט ולהתרחב מחוץ לגוף לפני שיוחדרו מחדש לגוף Levine et al, 2017)). ביטוי יציב של CARs   הינו תנאי הכרחי בשביל לשמור על התאים ועל תפקודם.

לפיכך, ויקטורים לינטיויראלים (LV) או ϒ -רטרוויראליים נחשבים כיום בתור השיטה עם השימוש הרחב ביותר למודיפיקציות גנטיות במרפאות Schambach & Morgan, 2016)). בעוד שהקונספט הטיפולי נכנס לתוקף, הליך הייצור ושרשרת האספקה עדיין תובעניים מאוד ודורשים משאבים אינטנסיביים. קידום תהליך הייצור הנוכחי אל  מנהג רפואי שגרתי, במיוחד בהתחשב במספר הגבוה של חולי הסרטן, מתגלה כקשה במיוחד, עד כדי בלתי ניתן ליישום (Hartmann et al, 2017). לכן, נמשכים המאמצים ליצירת תאי T-CAR  אלוגרפטיים (ממקור שונה) אשר ניתנים להשתלה אצל חולים תואמים ב HLA (אנטיגן ליקוציטי אנושי)  (Qasim et al, 2017). אומנם, גם אם ניתן להשיג זאת, יצירת תאיT-CAR  ימשיך להיות הליך קשה. לחלופין, תכנות מחדש בתוך רקמה (in situ) של תאי CAR T +4CD מרעילים באמצעות הזרקה ישירה של ויקטור  שיכול לעקוף ובגדול את מגבלות אלה.

השגת מסירה יעילה וסלקטיבית של ויקטור אל תאי T באורגניזם החי, מהווה אתגר ייחודי בהשגת המטרה. חוץ מהסלקטיביות, גם מצב המנוחה הנורמלי של תאי T באורגניזם החי שאינו תואם לתנאי הובלת ויקטור באמצעות LV שגרתי, מציב עוד בעיה בפנינו (Amirache et al, 2014). מסירה מדויקת באורגניזם החי אל סוגי תאים מובחנים ספציפיים, כבר הושגה דרך הכוונת ה LV לזיהוי סממנים מובחנים מדויקים על פני שטח התא המשמשים כמו קולטני כניסה (Anliker et al, 2010; Buchholz et al, 2015). לאחרונה, דיווחנו על הנדסת ה 4CD האנושי (LV-4CD)   וויקטורי 8CD מכוונים (LV-8CD)  שיכולים למסור גנים ל +4CD ספציפיים או לתאי +8CD (Zhou et al, 2012, 2015; Bender et al, 2016). לקראת יצירת תאיT-CAR  מקומיים, כאן אנו מוודחים על כך שניתן ליצר תאי  19CD שמגיבים  לתאי T-CAR –+8CD בעכבר אנושי בעקבות מתן של CD8-LV. כצפוי, תכנות מחדש של תאי  T-CAR באורגניזם החי, בא ביחד עם חיסול סלקטיבי של תאי B. חשוב לציין, חלק מהחיות פיתחו סימנים המזכירים את תסמונת שחרור הציטוקינים (CRS) אשר נצפית באופן לא סדיר בחולים המטופלים עם תאי T-CAR (Hay et al, 2017).

תוצאות ודיון

בכדי לבדוק את ההשערה שניתן לייצר תאי T  CD19-CAR  ישירות באורגניזם החי,  ארזנו את כל המידע הגנטי של CD19-CAR יחד עם FMC63 scFv ודומיין האיתות ꭍ CD28  אל תוךLV- 8CD . בעקבות התמרה חוץ גופית (in-vitro) של PBMC אנושי, נצפה ביטוי CAR באופן סלקטיבי בתאי T – CD8+  (תרשום A1 ו A1EV). תאים אלה חיסלו את תאי B – +19CD ותאי ראג’י אבל לא את תאי הביקורת -19CD (תרשים B1EV ו C). על מנת לבדוק את השפעת ויקטור זה על תכנות מחדש של תאי CAR-T באורגניזם החי,  הושתלו עכברי NOD-scid-IL2Rcnull (NSG) בPBMC  מופעלים,אנושיים. מאחר וPBMC מופעל מכיל כמות קטנה של B-לימפוציטים, שאינם מוחדרים היטב, הוחדרו גם תאי ראג’י, כדי לשמש בתור יעד ולספק סטימולציה לאנטיגן של תאי ה CAR-T המושרים אל האורגניזם החי (תרשים B1). לאחר הזרקת חלקיקי הויקטור, נצפו רמות יותר גבוהות של תאי T – +8CD בעכברים שהוזרקו עם CD8-LVCD19CAR לעומת עכברי הביקורת, במיוחד בחלל הצפק (תרשים D1 ובנספח תרשים 1S). מתוך תאי ה +8CD אצל עכברים שהוזרק להם ויקטור, רמות תאי ה T-CAR החיוביים היו 30-50% בנוזל הצפק, 10-35% בטחול, 5-30% בדם (תרשים E1 ובנספח תרשים 2S). מספרים גבוהים אלה של תאי CAR+-T  נמצאו בקנה אחד עם מספר עותקי הויקטור (VCN) הנמצאים בדנ”א הגנומי שהופק מהרקמות (תרשים C1 ו 2EV). מאחר ולא נצפתה עלייה בסך הכל של תאי +45CD (בנספח תרשים 1S) יחד עם העובדה ששיעורי התמרה באורגניזם החי עם גן מדווח שמקודד ויקטור CD8-LVRFP נשארה מתחת ל 5%, ניתן לטעון שזה נובע מפרוליפרציה מועדפת של התאים שעברו התמרה כבר בהתחלה (תרשים E1). חשוב לציין, פחות מ 0.5% מתאי -8CD הובחנו בסביבת ה +CAR (תרשים E1). במידה ניכרת, אצל כל העכברים שקיבלו CD8-LVCD19CAR היה מחסור  בתאי +19CD במיוחד בחלל הצפק, טחול והדם (תרשים F1). מאחר ועכברי הביקורת הכילו רמות נמוכות של תאי +19CD  אך עדיין יותר גבוהות באופן מובהק, הם ודאי חוסלו על ידי תאי T  CD19-CAR שנוצרו באורגניזם החי (תרשים F1). נוזל הצפק, הדם והטחול הכילו בעיקר תאי B אנושיים, בעוד שתאי ראג’י שככל הנראה פרצו אל תוך רקמת הצפק (בנספח תרשים 3S). כדי לבדוק אם שאריות של תאי B – +19CD הנמצאים בתאי PBMC  אנושיים הם אלה שהפעילו תאי ה CAR-T  אשר נוצרו באורגניזם החי, הזרקנו אל העכברים תאי  +19CD  חסרי PBMC לפני הזרקת הויקטור. בתנאים אלה, רק 5% מתאי ה CAR אובחנו בנוזל הצפק, בעוד שהאותות בדם ובטחול היו דומים לרקע (תרשים G1). זה מסמל שאפילו רמות נמוכות של תאי B +19CD הנמצאים ב PBMC מספיקים להפעלת תאי T  + CAR+/CD8 ולקדם את התפשטותם.

בהתאם לכך, נצפה מצב פוליקנולני ברור בתאי +CAR של חלל הצפק בנוכחות תאי המטרה, בעוד שבהיעדרם או לאחר העברת גן TFP, תאי ההתמרה היו יותר אוליגוקנולאנים, מכיוון שפסים ברורים אובחנו באמצעות PCR-LM. בטחול, היה נוכח דפוס יותר אוליגוקלונלי (תרשים A3EV). ביטוי 1-PD היה גבוה בתאי T בעכברים מכל קבוצות הניסוי, דבר אשר בא עם קנה אחד עם ההפעלה המקיפה של PBMC שהושתלו (תרשים B3EV). חשוב לציין, אצל עכברים שהוזרק להם הויקטור, נצפו רמות 1-PD עוד יותר גבוהות, דבר אשר יתכן שנגרם בשל הפעילות המעוררת של scFv  ספציפי ל CD8 שנמצא על פני השטח של החלקיק (Zhou et al, 2012). סימני ההפעלה/ תשישות 3-LAG ו 3-TIM, להבדל, הוגברו בתאי T – +CAR של חלל הצפק. הבדל זה היה פחות בולט בטחול (תרשים B3EV). נתונים אלו נמצאים בקנה אחד עם התפשטות מועדפת של תאי +CAR לחלל הצפק בנוכחות אנטיגן, לאחריו נדידת חלק מתאי CAR-T פחות מותשים אל הטחול.

נתונים אלה מספקים הוכחה לכך שניתן לייצר תאי T 19CD-CAR באורגניזם החי, באמצעות LV מכוונים ל 8CD. אם כך, ביטוי   CAR הינו מוגבל לתאי T – +8CD אנושיים. כאשר תאי T-CAR אשר נוצרו באורגניזם החי זיהו +19CD, התפשטו בחלל הצפק, חיסלו תאי +19CD ונדדו אל רקמות הלימפה. מודל זה של תאי ה PBMC שאינם במקור מבעלי חיים, לא נבע מסיבה פיזיולוגית שהינה אקטיבציה תוך תאית גבוהה של  תאי T מאומצים (בין אם מבטים CAR  או לא), גורמים למחלת שתל לעומת מארח (GvHD) ומגבילים את תקופת התצפית. בנוסף לכך, הפעלה זו של תאי T שניתנת לגילוי, מאפשרת לתאי T להיות יותר חשופות להתמרה ומעניקה בכך רמות ביטוי יותר גבוהות של גנים מועברים מאשר תאי T  במצב מנוחה אשר פותחו באופן אנדוגני. זה תקף גם לגבי ביטוי מהפרומוטר של SFFV  בתאי T (Frecha et al, 2008), אשר נעשה בו שימוש בעבודה זו.

כדי לבדוק אם ניתן לייצר תאי T-CAR מתאי T במצב מנוחה, הוזרקו חלקיקי הויקטורים אל עכברים מושתלים תאי +4CD -גזע-הימאטופוטים (HSCs). בחיות אלה, תאי T אנושיים התפתחו בתימוס שלהם ונדדו והתבגרו ברקמות לימפטיות משניות (2017,Walsh et al). עכברים אנשויים הכילו 38-72% תאי +45CD אנושיים בדם, מתוכם 24-87% היו תאי B +19CD אנושיים ו 2-26% תאי +8CD אנושיים (ראה נספח תרשים 4S לפרטים והקצאה קבוצתית). לעכברים אלו, הוזרק אחד משניים PBS או CD8-LVCD19-CAR. שתי הקבוצות קיבלו הזרקות 7-IL  דרך הוריד, לפני הזרקת הויקטור לשם הפעלה הומאוסטטית של תאי T +8CD (Verhoeyen et al, 2003; Fig 2A). 7-IL הינו ציטוקין הימאוסטטי, אשר מקדם את היכולות החיוניות של התאים ודוחף T לימפוציטים אל שלב ה B1G במחזור התא, דבר אשר גורם להם להיות יותר רגישים ללנטיוירוסים (Cavalieri et al, 2003; Verhoeyen et al, 2003; Swainson et al, 2006), אשר הוחלו בבטחה אל חולים במחקרים קליניים (Rosenberg et al, 2006). 7- 18 שבוע אחרי הזרקת הויקטור, תאי T-CAR אובחנו בדם אצל 6 מתוך 10 עכברים לפי  שיטה משומשת בספירת דם (flow cytometry). חשוב לציין, ביטוי CAR נצפה באופן בלעדי באוכלוסיות תאי T +8CD אנושיים נעים בין 1.5 ו14% מסך הכל הלימפוציטים +8CD (תרשים B2). חיה אחת הייתה חסרת תאי CAR-T  באופן מוחלט. שלושה עכברים נוספים ייתכן והכילו תאי CAR-T, אבל האותות לא עברו את גבול האבחנה. הרצת PCR על דנ”א גנומי מופק ממח עצם מכל החיות היה בסך הכול תואם לתוצאות ספירת הדם, ונמצאו חיוביים ל- CAR שבעה עכברים שהוזרקו בויקטור (תרשים C2 ו D). מספר עותקי גן ה CAR היו גבוהים יותר מהמצופה בכל החיות לפי תוצאות ספירת הדם. אינטגרציות מרובות בתאים בודדים כמו גם אי-הפעלה של פרומוטר ה SFFV, שנצפו לפני (Stein et al, 2010), מציעים הסבר אפשרי לאי-ההתאמה. יתרה מזאת, חלק מתאי ה CAR-T שנוצרו באורגניזם החי ייתכן וחזרו למצב המנוחה אחרי שעברו עירוי של 7-IL. תאי T במנוחה או מופעלים במידה מועטה, לא מבטים את ה CAR ברמות המספיקות שדרושות לזיהויים בספירת הדם.

ספירת דם בטחול ובתאי מח העצם היו תאומות לערכים שנצפו בדם. עד 15% תאי +CAR מבין תאי +8CD אנושיים, חיות 16M ו 19M הראו את הרמות הכי גבוהות של תאי T-CAR מבין כל העכברים ברקמות אלו (סמנים צבועים בתרשים B2). להבדל מזאת, תאי +CAR נעדרו מתאי -8CD מבין כל החיות שהוזרקו עם הויקטור בדומה לחיות שקיבלו PBS (תרשים B2). חשוב לציין, הרמות הגבוהות של תאי CAR-T ב 16M ו 19M נצפו יחד עם העדרות מחולטת של לימפוציטים- +19CD בדם, טחול ובמח העצם (תרשים E2). בנוסף, כאשר השוו חיות ה +CAR לרמות לפני ההזרקה באותה חיה באופן נפרד, רמות תאי +19CD ירדו באופן מובהק (תרשים F2). לא נצפתה ירידה בתאי +19CD בכל אורגניזם בשלושת עכברי ה CAR- שליליים (תרשימים E2 ו F). לאחר 7 שבועות מזמן הזרקת הוירוס, חיות 16M הוקרבו בשל אובדן משקל, פרווה פרועה, אדישות, אטקסיה ותנועות מעגליות. עכבר 19M הגיע לנקודת סיום ביום 53. שני העכברים הראו ספלנומיגליה והיפוצולריות במח העצם. בעקבות התנהגות אבנורמלית, אובדן משקל, אדישות, שתי חיות נוספות הוקרבו 10 שבועות אחרי הזרקת ויקטור.

על מנת לבדוק אם דפוס CRS קשור לסימפטומים אלה, מדדנו את ריכוזי 12 ציטוקינים אינושיים בפלזמה של העכברים. שלושת עכברי +CAR, ביניהם 16M ו 19M, הראו רמות ציטוקינים גבוהות באופן משמעותי (תרשימים A3 ו 3EV) מהם: ציטוקינים הקשורים לדלקת, כמו 6-IL, אינטריפרוןϒ  (IFNϒ),  פקטור מגרה מושבת- גרנולוציטים-מקרופאגים  (CSF-GM) אשר בלטו במיוחד. נצפתה עליה בפקטור ניקרוזה (מוות בלתי מתוכנן של תאים) של  גידול a (TNFa) ב 16M ו 19M, ונראתה נטייה לכיוון רמות גבוהות של 2-IL, 10-IL, 0-1L אצל חלק מהעכברים שקיבלו ויקטור (תרשים A3). כדי לאבחן את הפתולוגיה של חיות ה 16M ו 19M, נאמדו חתכים היסטולוגים מאיברים שונים. לימפוציטים חדירים אובחנו בריאות, בכבד ובמוח של חיות 16M ו 19M (תרשימים B3 ו 4EV). להבדל מזאת, בטחול ומח העצם אובחנו סמנים ברורים של דלדול לימפוציטים ופסולת תאית (תרשימים B3 ו4EV). בעכברים שטופלו עם הויקטור 16M, נראו בריאות סמני דלקת ריאות אינטרסטיציאלית, אשר ייתכן ונגרמו כתוצאה מחדירה של תאיT  +8CD ו +4CD (תרשימים B3 ו 4EV). חלק מהלימפוציטים המסוננים נמצאו חיוביים ל MYC, למרות שאבחנה על בסיס MYC יחד עם CAR-19CD באמצעות אימונוהיסטו-כימיה בעלת רגישות מועטה (Lobbestael et al, 2010; Fig 3B). חתכי מוח אפשרו עדות ברורה לדלקת קרום המוח לימפוציטית, עם T-לימפוציטים +4CD ו +8CD, שהצטברו בעיקר בקרום, וחלק מהלמפוציטים נמצאו גם בסטריאטום ((Fig 3B; Appendix Fig S5. כמו כן, חדירות רבה של לימפוציטים- +8CD נצפו בכבד (תרשים B3). הכבד של 16M הראו צרוף של תאי אפיטולואידים קטנים גרנולמים (סוג של דלקת) ברקמה התפקודית של הכבד ובמערכת השער, אשר עולים בקנה אחד עם הפטיטיס גרנולומטי. לא נצפתה התמונה הטיפוסית של GvHD  היפאטואיטים עם נזק בצינורי המרה ודלקת אנדותלטיס  (תרשים EV5A).  כמו כן, משובות מהרקמות הראו כוכים ללא שינוי, עם שום סמן לאלומין של GvHD  (תרשים EV5B). בטחול, אזורים עשירים ב B- לימפוציטים מזכירים נבטים ראשוניים מדוללים מתאי B ומוקפים בהרבה +8CD וכמה תאי T +4CD (תרשים B3).

נלקח יחדיו, תוצאות אלו מספקים הוכחה לכך שהזרקת LV מקודדים CAR ומכוונים ל 8CD, בתור “תרופה טיפולית” יכולה לזרז התפתחות של תאי  T CAR +8CD באורגניזם החי, אשר נלחמים כנגד תאי +19CD. בעוד שזוהי הוכחה ראשונה להיווצרות תאי T CAR אנושיים באורגניזם החי, בפרסום אחר שהוצא לאור רק לאחרונה, תיאר הנדסת תאי T באורגניזם החי, בהסתמך על עירוי נאנו-חלקיקים לא ויראליים, אל העכברים (Smith et al, 2017). להשוות שתי גישות אלו הינו לאתגר קשה, מאחר והננו- חלקיקים מכילים רכיב anti-3CD, אשר ידועים להפעיל ולהטות אוכלוסיות תאי T. בנוסף לכך, הסוג החדש הזה של הויקטור המסונתז לרוב יצריך עוד הנדסה ובדיקות על מנת להסיר את הרכיב הטוקסי לפני שניתן יהיה לייחל אותו על תאי T אצל בני אדם. לגבי ויקטור ה 8CD-LV,תרגום להגדרות קליניות נראית ישר קדימה, מאחר ותאי T  מתמירים ללא צורך באותות הפעלה חזקה של תאי T אשר נלקחו מויקטורי ה LV  עבורו קיים ניסיון קליני עמוק (Naldini et al, 2016). אף על פי כן, ניסויים פרה קליניים נוספים בהכרח נדרשים כאן, שיכללו עכברים אנושיים משולבים עם גידולים מופקים מחולים וניסויים בחיות גדולות על מנת לקבוע את המינון הפרמקולוגיה- טוקסיות של מודיפיקציות גנטית באורגניזם החי של תאי T +8CD. לכן, מתן ויקטור אל בלוטות הלימפה עלולה להוות אופציה לקידום חוזק הקשרים בין חלקיקי הויקטור ותאי היעד.

תוצאה מפתיעה מהמחקר שלנו בעכברים אנושיים לחלוטין הייתה העלייה בריכוזי הציטוקינים האנושיים בפלזמה של שלושה מתוך שבעה חיות חיוביים לCAR במקביל לאפלזיה של תאי B וסמנים של נוירו-טוקסיות בעכבר אחד. מילואידים אנשויים ותאי T +4 CDמהווים מקור סביר לציטוקינים המשוחררים (Tanaka et al, 2012; Sundarasetty et al, 2017). פרופיל הציטוקינים דומה לתאי T CAR שהופקו מחולים סובלים מ CRS (Hay et al, 2017). עם זאת, בתנאים רפואיים, סמני  CRS מובחנים זמן קצר יותר לאחר מתן תאי T CAR, אשר רוב הסיכוי מתרחש בזכות המספרים הגדולים של תאי T שמופעלים מחוץ לגוף ונוכחים מיד לאחר מתן התאים בשיטת הטיפול התאי המאומצת. להבדל מזאת, לאחר קבלת גן ה CAR באורגניזם החי, תאי T CAR מתפשטים מבחינה הומאוסטטית והרמות שלהם עולות לאט יותר. בדיקות פרה- קליניות של תאיT CAR , נעשו בדרך כלל על עכברים פגועים אימונולוגית,  אשר מושתלים בשתל ממקור אנושי. בעוד שמודלים כאלו נותנים הוכחה של הפעילות נגד הגידולים של תאי ה T, התחזיות לגבי טוקסיות הינן קשות, מאחר והן מטושטשות על ידי תגובות- קסינון ו GvHD.

כאשר הוזרקו תאי  CAR- 10CD Tהמיוצרים מחוץ לגוף אל עכברים מושתלים עם HSC, נצפו סמנים שמשקפים CRS בדומה למחקר שלנו, אבל בסופו של דבר יש סיכוי שלא תאובחן המאולרו-אקטיביות בוודאות מוחלטת (Diaconu et al, 2017). בהגדרות שלנו, GvHD  מאוד לא סביר. ראשית כל, תאי T CAR שנוצרים באורגניזם החי מתאי T מפותחים ישירות בעכברי NSG מדם שהופק ממנו +34CD, מה שמונע את האלורו-אקטיביות. שנית כל, GvHD  בדר כלל אינו מתפתח בNSG מושתל-HSC. GvHD   כרוני ספרודי עם התחלה מאורחת בלבד תוארו בחלק מהעכברים, כאשר הושתלו עם תאי תורם עם אוטואימוניות (Sonntag et al, 2015). שלישית, תוצאות היסטולוגיות לא הראו שום סמן ל GvHD   כאשר ערכנו מושבה וגם בצינורות מערכת השער של הכבד, אשר מושפעים מ GvHD   (תרשים 5EV). CRS בפועל שנוצר מתאי T CAR, הינו אם כך, ההסבר הכי סביר לסימפטומים שצוינו, אשר נתמך לפי פרסום שפורסם לאחרונה, בו הדגימו CRS בעכברים מושתלים- HSC בהזרקות עם תאי T CAR שנוצרו מחוץ לגוף (Norelli et al, 2018). לכן, שווה לחקור את הגישה שלנו, במיוחד השימוש שלה במודל חיות אינפורמטיבי, שמאפשר ללמוד על המכניזם שעומד מאחורי CRS והנוירו-טוקסיות בטיפול באמצעות תאי T CAR (June et al, 2018). בדרך הזו, חשוב יהיה לבדוק את ההשלכות של אספקת ה CAR לא רק דרך +8CD , אלא גם תאי +4CD. בעוד שתאי T CAR  CD8+  לבד תוארו בתור פעילים כנגד גידולי +19CD באורגניזם החי, נוכחות תאי T CAR +4CD  בו זמנית, מגבירה את פעילותם (sommermeyer et al, 2016). הכלים של היווצרות תאי ה T CAR +4CD סימולטנית זמינים כעת (Zhou et al, 2015).

ליישומים מוצלחים של מסירת גן ה CAR באורגניזם החי בתנאים קליניים, תהיינה השלכות חשובות להתפתחות העתידית של אימונו-תרפיה, על ידי שינויו מטיפול מותאם אישית אל טיפול שניתן להחילו על המדף: (i) ניתן לעקוף את המאמצים המרובים ואת יוקרת יצור תאי T, (ii) הויקטורים יהיו ניתנים לאחסון, לאספקה, וניתנים לחולים בעת הצורך, (iii) הגמישות המוגברות עלולה להקל על התפתחות קונספטים אימונו-תרפים חדשים, כולל אינדיקציות מעבר לסרטן ולמחלות מדבקות.