רגנרציה אפידרמיס (סיכום) Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells (summary)

רגנרציה של כלל האפידרמיס האנושי באמצעות תאי גזע טרנסגניים

 אפידרמוליזיס בולוזה מסוג junctional (JEB) (תמס בועתי של העור) הינה מחלה גנטית חמורה, קטלנית לעתים קרובות, הנגרמת ממוטציות בגנים המקדדים את רכיב ממברנת הבסיס למינין-332. חולי JEB מפתחים פציעות כרוניות בעור ומוקוזה, הפוגעים באיכות חייהם ועשויים להוביל לסרטן עור. מאמר זה מראה כיצד תרביות קרטינוציטים אוטולוגיות טרנסגניות הביאו לרגנרציה של אפידרמיס מלא ותפקודי אצל ילד בן 7 הסובל ממקרה חמור של JEB. דפוס האינטגרציה הפרו-ויראלית השתמר in vivo וההתחדשות של האפידרמיס לא גרמה לסלקציה קלונאלית כלשהי. ההתחקות הקלונאלית הראתה כי האפידרמיס משתמר על ידי מספר מוגבל של תאי גזע ארוכי-חיים, שזוהו כ- holoclones, בעלי יכולת התחדשות-עצמית In vitro ו- in vivo המייצרים פרוגניטורים המחדשים קרטינוציטים שעברו התמיינות טרמינאלית.

מחלת ה- JEB מאופיינת בחולשה מבנית ומכאנית של האינטגומנטים. שלפוחיות ופציעות בעור ומוקוזה מתרחשות בתוך השכבה השקופה (lamina lucida) של ממברנת הבסיס בתגובה לטראומה. פציעות כרוניות בעור גורמות לזיהומים, צלקות, וסרטן העור. ה- JEB נגרמת ממוטציות בשלושה גנים – LAMA3, LAMB3 ו- LAMC2 – המקדדים את למינין-332 (חלבון הטרוטרימרי, ידוע גם כלמינין 5, המורכב משרשראות α3, β3 ו- γ2) ובגנים המקדדים את קולגן XVII ואינטגרינים α6β4. מוטציות שליליות הגורמות למחסור בלמינין-332 בדרך כלל גורמות למוות בגיל צעיר. במקרים לא-קטלניים של JEB, הלמינין-332 קיים בכמויות מזעריות, וההמידסמוזומים הם בסיסיים או חסרים. ה- JEB היא חשוכת מרפא, ומעל 40% מהחולים נפטרים לפני גיל ההתבגרות. הטיפולים הקיימים מסוגלים להפחית את הסימפטומים בלבד.

ההתחדשות והתיקון של האפידרמיס משתמרים בעזרת תאי גזע אפידרמליים, המייצרים מושבות הנקראות holoclones, שבתורן מחוללות תאים מייצרי meroclone ו- paraclone, המתפקדים כפרוגניטורים מגבירי חלופה. תרביות אפיתליאליות הנושאות תאים מייצרי-holoclones מסוגלות לתקן פגמים בעור ובראייה. המחקרים מראים כי השתלות מקומיות של תרביות אפידרמליות טרנסגניות מסוגלות לייצר אפידרמיס תקין, המוביל לתיקון קבוע של לזיות עור אצל חולי JEB. עם זאת, בשל הכמות הקטנה של האזורים המטופלים (0.06 m2 בסה”כ) הטיפול לא שיפר את איכות החיים של המטופל באופן משמעותי. הביקורת העיקרית על גישה טיפולית זו הייתה כי היא אינה מתאימה ללזיות גדולות המאפיינות JEB כללית. במחקר זה אנו מדגימים רגנרציה של כל האפידרמיס (כ- 0.85 m2) באמצעות תרביות קרטינוציטים אוטולוגיות טרנסגניות. האפידרמיס נותר איתן ועמיד בפני לחץ מכאני, ללא שלפוחיות או ארוזיה במהלך 21 חודשי המעקב. אפידרמיס זה משתמר בזכות מספר מוגבל של תאי גזע אפידרמליים טרנסגניים (holoclones) המתחדשים-עצמית in vitro ו- in vivo.

המטופל

המטופל אושפז במחלת הכוויות ב- 2015. הוא נושא מוטציית אתר שחבור acceptor הומוזיגוטית (C1977-1G > A, IVS 14-1G > A) באינטרון 14 של LAMB3. המטופל סבל משלפוחיות על כל גופו, בעיקר בגפיים, בגב ובצידי הגוף. מצבו התדרדר כ- 6 שבועות לפני האשפוז, עקב זיהום staphylococcus aureus ו- pseudomonas aeruginosa. לאחר האשפוז, החולה סבל אובדן איפדרמלי כולל של כ- 60% משטח פני הגוף הכולל (TBSA). כל הגישות הטיפוליות כשלו והפרוגנוזה הייתה גרועה. לאחר הסכמת ההורים, אושר טיפול גנטי ותאי ex vivo. בזמן הניתוח הראשון, החולה סבל מאובדן אפידרמוס מלא בכ- 80% מה- TBSA (איור 1a, b).

איור 1: רגנרציה של האפידרמיס הטרנסגני. a) המטופל מציג אובדן אפידרמלי מאסיבי. b) ייצוג סכמטי של התמונה הקלינית. העור הפגוע מסומן באדום; שלפוחיות בירוק. אזורים בצבע עור מייצגים עור ללא שלפוחיות. שתלים טרנסגניים יושמו על האזורים האדומים והירוקים. c) התחדשות האפידרמיס, להוציא מספר אזורים בירך ימין, הישבן, כתפיים/צוואר ושחי שמאל (עיגולים לבנים, סה”כ ≤ 2% מה- TBSA). d) אלסטיות ותפקוד נורמאלי של העור. e) היעדר שלפוחיות באתרים מהם נלקחו ביופסיות פוסט-ניתוח (חץ).

רגנרציה של האפידרמיס באמצעות תרביות טרנסגניות

ביופסיה של 4 cm2 שנלקחה מאזור נטול שלפוחיות במפשעה שימשה לביסוס תרביות קרטינוציטים ראשוניות, שלאחר מכן עברו התמרה (טרנסדוקציה) עם וקטור רטרו-ויראלי המבטא את LAMB3 cDNA המלא תחת בקרה של רצף טרמינאלי ארוך (LTR) של וירוס מולוני לוקמיה (MLV-RV). שתלים אפידרמליים בגודל 0.85 m2 הונחו על מיטת פצע דרמאלית (איור 2a, extended data). הגפיים, צידי הגוף והגב טופלו באמצעות שתלים.

תירבות קרטינוציטים על סובסטרט פיברין מקל על הכנת השתלים והשתלתם ומונע הצטמקות אפידרמלית, ומאפשר הכנת שתלים גדולים יותר מאותו מספר של תאים קולונוגניים הדרושים להכנת שתלים בתירבות פלסטיק. מכיוון שדגרדציה של פיברין לאחר השתלה מעולם לא נאמדה על מיטת פצע של חולה JEB, הניתוח הראשון כלל השוואה בין שתלים בתירבות פיברין מול תירבות פלסטיק (שיטות, איור 1 extended data).

זרוע שמאל קיבלה שתלים בתירבות פלסטיק (איור 2b extended data, כוכבית). לאחר הסרת הגאזה (10 יום לאחר ההשתלה, איור 2c extended data, חצים), ניתן לראות קליטה של השתלים האפידרמליים (כוכביות). חודש אחד לאחר ההשתלה, הרגנרציה הייתה יציבה ושלמה (איור 2d extended data). רגל שמאל קיבלה שתלים בתירבות פלסטיק ובתירבות פיברין (איור 2e extended data, כוכבית וחץ, בהתאמה), ששניהם הציגן קליטה מלאה לאחר 10 יום (איור 2f extended data, כוכבית וחץ, בהתאמה) ורגנרציה אפידרמלית מלאה לאחר חודש אחד (איור 2f, inset). הנתונים היו דומים לגבי שאר האיברים. לפיכך, גבו של החולה (איור 2g extended data) טופל רק בעזרת שתלים בתירבות פיברין. נצפתה רגנרציה אפידרמלית מלאה לאחר חודש אחד (איור 2h, extended data), להוציא אזורים מסוימים (כוכביות) שחלקם הכילו איים של אפידרמיס חדש (חצים). בשבועות לאחר מכן, האפידרמיס המחודש סביב הלזיות והאיים האפידרמליים התפשט וכיסה את רוב האזורים (איור 2i extended data). לאחר מכן ביצענו השתלות בשאר האזורים הפגומים בצידי הגוף, החזה, ירך ימין, זרוע ימין והכתפיים. רגנרציה אפידרמלית הושגה במרבית אזורים אלו.

לפיכך, כ- 80% מה- TBSA של המטופל חודש באמצעות האפידרמיס הטרנסגני (איור 1c). במשך 21 החודשים הבאים (מעל 20 מחזורי חידוש של האפידרמיס), האפידרמיס המחודש נצמד היטב לדרמיס תחתיו, גם לאחר לחץ מכאני (איור 1d והסרטון), החלים באופן נורמאלי ולא גרם לשלפוחיות, גם באזורים מהם נלקחה ביופסיה למעקב (איור 1e, חץ).

בעת השחרור האפידרמיס היה יציב ואיתן, ללא שלפוחיות או גירוד וללא צורך במשחות או תרופות.

10 ביופסיות נקב (punch) נלקחו אקראית 4, 8 ו- 21 חודשים לאחר ההשתלות. האפידרמיס הציג מורפולוגיה נורמאלית, ללא שלפוחיות, ארוזיות או ניתוק של האפידרמיס מהדרמיס (איור 3a extended data). היברידיזציית in situ באמצעות גשוש t-LAMB3 ספציפי לווקטור הראתה כי האפידרמיס המחודש כלל רק קרטינוציטים טרנסגניים (איור 2a). בתחילת האשפוז כמעט ולא ניתן היה לזהות למינין 332-β3 בעורו של המטופל (איור 2b). לאחר ההשתלה, אפידרמיס הבקרה (שנלקח מפסולת רפואית) והאפידרמיס הטרנסגני ביטאו כמויות כמעט זהות של למינין 332-β3, שמוקם באופן מתאים בצומת האפידרמיס-דרמיס (איור 2b). בנוסף, ה- lamina של הבסיס הכילה כמויות נורמאליות של שרשראות למינין 332-α3 ו- γ2, שהיו מופחתות באופן משמעותי בתחילת האשפוז (איור 3b extended data). כלומר, הקרטינוציטים המותמרים שחזרו את מנגנון ההידבקות התקין (איור 3c extended data). האפידרמיס הטרנסגני הציג עובי נורמאלי והמשכיות של ממברנת הבסיס (איור 2c, ראשי חצים) ומורפולוגיה נורמאלית של ההמידסמוזומים (איור 2c, חצים). 21 חודשים לאחר הניתוח, הסרום של המטופל לא הכיל אוטו-נוגדנים שכוונו נגד אזור ממברנת הבסיס (איור 3d extended data).

לסיכום, תרביות אפידרמליות טרנסגניות חוללו אפידרמיס מתפקד ומלא אצל חולה JEB. ממצא זה הינו עקבי לשימוש המוכר בתרביות קרטינוציטים לטיפול בכוויות של 95% מה- TBSA. ניתן לטעון כי מצבו של המטופל הינו חריג וכי הניתוח האגרסיבי שבוצע אינו מקובל עבור רב החולים באפידרמוליזיס בולוזה. עם זאת, ניתן להשיג החלפה פרוגרסיבית של אפידרמיס פגוע באופן הדרגתי ופחות פולשני, או על אזורים קטנים יותר. באפידרמוליזיס בולוזה הדרמיס אינו נפגע (בניגוד לכוויות), מצב המאפשר תוצאות תפקודיות וקוסמטיות טובות. יתרון זה הינו אופטימאלי עבור חולים המאובחנים בשלב מוקדם בילדות. ניתן להשתמש במאגר של תאי גזע אפידרמליים מותמרים הנלקחים בלידה עבור טיפול מניעתי בלזיות בעודן מתפתחות, במקום טיפול בפציעות החמורות המתרחשות בהתבגרות. כיום, לא ניתן ליישם טיפול תאי וגנטי משולב ex vivo בלזיות של המוקוזה הפנימית; עם זאת, לזיות כאלו הן בדרך כלל קלות יותר לטיפול בהשוואה לעור.

איור 2: שחזור של חיבור אפידרמיס-דרמיס נורמאלי. סקציות העור הוכנו מסובייקט בריא לבקרה, עור המטופל, ועור טרנסגני 4, 8, ו- 21 חודשים במעקב. a) היברידיזציית in situ באמצעות גשוש על סקציות עור בעובי 10 μm. גשוש ספציפי ל- E-קדהרין שימש לבקרה. קנ”מ 40 μm. b) אימונופלורסנציה עבור למינין 332-β3 באמצעות נוגדנים מונוקלונאליים 6F12 על סקציות עור בעובי 7 μm. DAPI (כחול) הכתמת גרעין. קו מקווקו מסמן את צומת אפידרמיס-דרמיס. קנ”מ 20 μm. c) מיקרוסקופיית אלקטרון על סקציות עור בעובי 70 nm. ניתן לראות ממברנת בסיס רגילה (חצים) והמידסמוזומים רגילים (ראשי חצים, הגדלה ב- inset) בסקציות של העור הטרנסגני של המטופל. קנ”מ 1 μm.

איור 3: פרופיל אינטגרציה של אפידרמיס טרנסגני. a) זוהו אינטגרציות בספריות שהושגו באמצעות שני פריימרי LTR (3pIN אפור בהיר, 3pOUT אפור כהה, טבלה נספחת 1) ובסט המשולב (שחור). קווים (ציר ימני) מראים את כיסוי האינטגרציה הממוצע, שחושב לאחר הסרת שכפולי PCR. b) דיאגראמת ון, מספר האינטגרציות המשותפות בכל הדגימות. c) אחוז האינטגרציות שעברו מיפוי ל: פרומוטרים, אקסונים, אינטרונים ואזורים אינטרגניים (משמאל); פרומוטרים וזרזים אקטיביים וחלשים בהגדרה אפיגנטית, או אזורים גנומיים ללא סימנים היסטוניים (ימין). P > 0.05, מבחן פירסון X2. d) dot plot של חמשת מונחי התהליך הביולוגי המועשרים המובילים של האונטולוגיה הגנטית עבור כל דגימה. צבע הנקודות מצביע על המובהקות הסטטיסטית של ההעשרה (ערך q); גודל הנקודות מייצג את מקטע הגנים שעברו אנוטציה לכל מונח.

פרופיל האינטגרציה של האפידרמיס הטרנסגני

תרביות טרום-שתל טרנסגניות (PGc) נוצרו מתאים קולונוגניים ראשוניים בכמות של 8.7 x 106 וכללו קרטינוציטים בכמות של 2.2 x 108 (המחולקים ל- 36 מבחנות) שכ- 45% מתוכם נזרעו להכנת שתלים אפידרמליים טרנסגניים בגודל 0.85 m2 (איור 1 extended data).

על מנת לחקור את פרופיל האינטגרציה לרוחב הגנום, ריצפנו 3 דגימות PGc באמצעות 2 פריימרי LTR (3pIN ו- 3pOUT, טבלה נספחת 1) להעשרת מעבדה (n = 12). ריצוף בתפוקה גבוהה שיחזר 174.9 מיליון זוגות קריאה והספריות שהושגו באמצעות פריימרי ה- LTR הציגו מספר דומה של קריאות וספירות החדרה ברות-השוואה (Pearson R > 0.92, p < 0.005). לאחר מיזוג כל אתרי האינטגרציה משתי מערכות הפריימר העצמאיות, זיהינו 27,303 אינטגרציות ב- PGc (איור 3a) עם כיסוי ממוצע של 2.5 קריאות לכל החדרה (איור 3a וטבלה נספחת 4). אותו ניתוח בוצע על התרביות הראשוניות שנוצרו מ- 3 ביופסיות (0.5 cm2 כל אחת) שנלקחו 4 (רגל שמאל) ו- 8 (זרוע שמאל ורגל שמאל) חודשים לאחר ההשתלה (4Mc, 8Mc1, ו- 8Mc2, בהתאמה).

זיהינו 400,206 ו- 413 אינטגרציות בלבד ב- 4Mc, 8Mc1, ו- 8Mc2, בהתאמה (איור 3a).

על מנת להוציא מחשבון את האפשרות כי ההבדלים הגדולים במספר האינטגרציות בין דגימות טרום הניתוח לאלו של אחרי הניתוח נבעו מתגובות PCR הגורמות לחוסר איזון בייצוג של הגברות ספציפיות-לאירוע, או להשפעה מרחבית של ביופסיות הנקב, אמדנו את מספר האינטגרציות הצפוי של PGc, 4Mc, 8Mc1, ו- 8Mc2 באמצעות מודל לכידה-לכידה חוזרת של צ’אפמן-וילסון על הנתונים שהושגו מהספריות. ב- PGC, המודל העריך 65,030 ± 2,120 אינטגרציות (כפול ממספר ההחדרות המזוהות בפועל). אותו מודל העריך 457 ± 31, 323 ± 50 ו- 457 ± 24 אינטגרציות עצמאיות ב- 4Mc, 8Mc1, ו- 8Mc2, בהתאמה (רמת הסתמכות של 99%, α = 0.01), נתון עקבי למספר האירועים המזוהים. 58%, 43% ו- 37% מהאינטגרציות ב- 4Mc, 8Mc1, ו- 8Mc2, בהתאמה, זוהו ב- PGc (איור 3b), ממצא עקבי לאחוז (כ- 50%) ההחדרות שזוהו ב- PGc באמצעות ניתוח ריצוף מהדור החדש (NGS).

האינטגרציות עברו מיפוי לפרומוטרים (אזורי 5-kb במעלה הזרם מאתר תחילת התעתוק של גני ה- RefSeq), אקסונים, אינטרונים ואזורים אינטרגניים. בכל הדגימות לפני ואחרי השתלים, כ- 10% מהאירועים מוקמו בתוך הפרומוטרים. רוב האינטגרציות היו אינטרוניות (כ- 47%), או אינטרגניות (כ- 38%), ופחות מ- 5% נמצאו באקסונים (איור 3c, משמאל). ביצענו גם אנוטציה של אינטגרציות באלמנטי תעתוק רגולטורים בעלי הגדרה אפיגנטית. כפי שניתן לראות באיור 3c (מימין), כ- 27% מהאינטגרציות היו קשורות לפרומוטרים והזרזים (enhancers) ולא נמצא הבדל מובהק בהתפלגות של ההחדרות בין הדגימות לפני השתל ואחרי השתל (p > 0.05; מבחן Pearson X2). לפיכך, דפוס האינטגרציה השתמר in vivo והתחדשות האפידרמיס לא קבעה סלקציה קלונאלית כלשהי.

גנים המכילים אינטגרציה לא הועשרו פונקציונאלית בקטגוריות אונתולוגיית הגנים הקשורות בתהליכים קשורי-סרטן, להוציא נדידת תאים והתמרת אות קטנה בתיווך-GTPase (איור 3d וטבלה 1a extended data).

ממצאים אלו היו צפויים מכיוון שתנאי התירבות שלנו עברו אופטימיזציה עבור שגשוג ונדידה של קרטינוציטים, שימור תאים קולונוגניים ומניעת המרה קלונאלית והתמיינות טרמינאלית מוקדמת, שכולן חיוניות עבור ביצועים קליניים נאותים של תרביות שתלים אפידרמליים. לפיכך, ניתוח התפוקה הגבוהה שלנו חשף העדפת ווקטור ספציפית-לתא הקשורה לסטאטוס התא המארח במונחים של מצב הכרומטין ופעילות התעתוק בזמן ההתמרה.

הועלו מספר חששות הנוגעים לגנו-טוקסיות של ההחדרה הנובעת מהשימוש בווקטור MLV-RV; מצב זה דווח לגבי תאי גזע המטופוייטיים בהקשרי מחלה שונים. ווקטור γRV הדומה לשלנו זכה לאישור שיווק עבור טיפול גנטי ex vivo באדנוזין דאמינאזה ומחלת הכשל החיסוני המשולב הקשה ואושרה למבחנים קליניים שלב I/II במחלת RDEB.

פרופיל האינטגרציה של המטופל אישר את ההיעדרות של סלקציה קלונאלית in vitro ו- in vivo. בנוסף, לא זיהינו אירועי אימורטליזציה הקשורים לאינטגרציות פרו-ויראליות ספציפיות ברבים מהקרטינוציטים שעברו תירבות סדרתי בהתמרת MLV-RV. שני חולי JEB שקיבלו 1 x 107 קרטינוציטים טרנסגניים קלונוגניים באתרים נבחרים (מעקב של 3.5 ו- 12 שנים), והמטופל שלנו, שקיבל כ- 3.9 x 108 תאים טרנסגניים קלונוגניים בכל גופו (איור 1 extended data), לא הציגו התפתחות גידולים או אירועים שליליים אחרים. על בסיס נתוני in vivo, התדירות של אירוע טרנספורמציה בר-זיהוי בקרטינוציטים שעברו התמרת MLV-RV תהיה פחות מ- 1 מתוך 1 x 107 במהלך 12 שנות המעקב. למרות שקשה להסיק מסקנות חד משמעיות לגבי מטופל זה בשל המעקב הקצר, התדירות של אירועי מוטגנזיס החדרתי בר-זיהוי עד היום היא פחות מ- 1 מתוך 3.9 x 108. במונחי סיכון/תועלת, יש לקחת בחשבון כי מטופלים הסובלים מ- JEB  חמורה קרוב לודאי יפתחו קרצינומת תאי קשקש כתוצאה מהתפתחות המחלה.

איור 4: פרופיל אינטגרציה של תאי גזע ותאים מגבירים חולפים. a) אחוז אינטגרציות holoclone שהשתמרו באוכלוסיית PGc. b) אינטגרציות holoclones שעברו מיפוי ל: פרומוטרים, אקסונים, אינטרונים ואזורים אינטרגניים (שמאל); פרומוטרים וזרזים אקטיביים וחלשים בהגדרה אפיגנטית, או אזורים גנומיים ללא סימנים היסטוניים (ימין). c) טבלת ה- PGc מראה כי 91% מה-  meroclonesוה- paraclones (אפור) לא הכילו את אותן אינטגרציות שזוהו ב- holoclones התואמים (כחול). טבלאות ה- 4Mc וה- 8Mc1 מראות ירידה ל- 37% ו- 13% בהתאמה. TA, הגברה חולפת.

השתמרות האפידרמיס הטרנסגני באמצעות holoclones

אחוז התאים הקלונוגניים, כולל holoclones, נותר יציב למדי במהלך התרחבות התאים הדרושה ליצירת השתלים (איור 1 וטבלה 2 extended data). המטופל קיבל כ- 3.9 x 108 תאים קלונוגניים, כ- 1.6 x 107 מתוכם היו תאים מייצרי-holoclones, לכיסוי בערך 0.85 m2 מגופו (איורים 1, 4 וטבלה 2  extended data). לפיכך, כ- 4.6 x 104 cm-2 תאים קלונוגניים או כ- 1.8 x 103 cm-2 תאי גזע הושתלו בשטח הגוף של המטופל (איור 4 extended data).

אם כל התאים הקלונוגניים היו פרוגניטורים אקוויפוטנטיים ארוכי-חיים, היינו מקבלים אלפי אינטגרציות לכל cm2 של אפידרמיס מחודש, וכל התאים הקלונוגניים הנמצאים בתרביות  4Mc, 8Mc1, ו- 8Mc2 היו בעלי אינטגרציות עצמאיות, ללא קשר לסוג הקלונאלי. במקום זאת, אם האפידרמיס הטרנסגני היה משתמר באמצעות מספר מוגבל של תאי גזע ארוכי-חיים, היינו משיגים לכל היותר כמה מאות אינטגרציות לכל cm2, וה- meroclones וה- paraclones הנמצאים בתרביות 4Mc, 8Mc1, ו- 8Mc2 היו בעלי אותן אינטגרציות שנמצאו ב- holoclones התואמים.

מספר האינטגרציות שזוהו בתרביות פוסט-שתל (איור 3a) הינו עקבי למספר תאי הגזע שהושתלו (איור 4 extended data) ולפיכך תומך בהשערה המאוחרת, שאומתה באמצעות ניתוח פרו-ויראלי ברמה הקלונאלית (איור 5 extended data) על PGc, 4Mc, 8Mc1, ו- 8Mc2. בסך הכול נותחו 687 שיבוטים (41 holoclones ו- 646 meroclones או paraclones). PGc, 4Mc ו- 8Mc1 חוללו 20, 14 ו- 7 holoclones ו- 259, 264 ו- 123 meroclones או paraclones, בהתאמה. לפיכך, PGc, 4Mc ו- 8Mc1 הכילו 7.2%, 5.0% ו- 5.4% תאים מייצרי-holoclones, בהתאמה (טבלה 2 extended data). כל שיבוט עבר קולטיבציה עבור ניתוח נוסף. ספריות של צמתי ווקטור-גנום, שנוצרו באמצעות PCR בתיווך הגברה ליניארית (LAM) ולאחריו pyrosequencing, השיגו 31 אינטגרציות עצמאיות שמופו על הגנום של ה- holoclones (טבלה 1b extended data). אחד ה- holoclones (4Mc) היה ללא התמרה, ו- 28, 11 ו- 1 holoclones הכילו, 1, 2 ו- 3 אינטגרציות, בהתאמה. 11 holoclones ב- 4Mc חלקו את אותו דפוס אינטגרציה. אותו דבר קרה עבור 2 זוגות של holoclones ב- 8Mc1. מספרי העותקים של ה- holoclones אומתו באמצעות PCR כמותי עם תעתוק לאחור (RT-qPCR) (איור 6 extended data). 75% ו- 80% מהאינטגרציות שנמצאו ב- holoclones של 4Mc ו- 8Mc1, בהתאמה, הושגו ב- PGc (איור 4a), ממצא התומך בסקר מבוסס-NGS ובדגימה המייצגת. דפוס האינטגרציה שזוהה ב- holoclones מאמת את היעדר הסלקציה באינטגרציות ספציפיות במהלך התחדשות האפידרמיס in vivo (איור 4b) ומשקף את הדפוס שנמצא בתרביות האב (איור 3c), כולל ההיעדרות של גנים הקשורים בבקרת מחזור התא, מות התא, או אונקוגנזיס (איור 3d וטבלה 1a extended data).

לאחר מכן ביצענו התחקות קלונאלית באמצעות PCR, תוך שימוש בקואורדינאטות הגנומיות של החדרות ה- holoclones. כצפוי, מרבית (91%) ה- meroclonesו ה- paraclones ב- PGc לא הכילו את אותן אינטגרציות שזוהו ה- holoclones התואמים (איור 4c, PGc). אחוז זה ירד ל- 37% 4 חודשים לאחר ההשתלה (איור 4c, 4Mc). כמעט כל האוכלוסייה הקלונוגנית של תרביות הקרטינוציטים הראשוניות שהתבססו ב- 8 חודשים הכילו את אותן אינטגרציות שזוהו ב- holoclones התואמים (איור 4c, 8Mc1). לפיכך, מחצית-החיים in vivo של פרוגניטורים מגבירים חולפים היא בערך 3-4 חודשים. נתונים אלו מלמדים כי האפידרמיס המחודש משתמר רק בזכות תאי גזע ארוכי חיים (holoclones) ומחזק את התפיסה כי meroclones ו- paraclones הם פרוגניטורים קצרי חיים הנוצרים באופן תמידי על ידי ה- holoclones, גם in vitro וגם in vivo. האחוז הגבוה של אינטגרציות holoclones שהושגו ב- PGc, לצד מספר האירועים המשותפים בכל התרביות (איור 3b), מלמד כי הכיסוי הממוצע של ניתוח ה- NGS ב- PGc אפשר לנו לזהות אינטגרציות ב- holoclones ובתאים מגבירים חולפים הנגזרים מ- holoclones אלו במהלך הקולטיבציה.

ממצאים אלו מראים (איור 7 extended data) כי 1) ה- PGc הורכב מתערובת של holoclones, meroclones ו- paraclones טרנסגניים עצמאיים; 2) ה- meroclones וה- paraclones הינם פרוגניטורים מגבירים חולפים, אינם מתחדשים באופן עצמי ואובדים במהלך הקולטיבציה ובהתחדשות האפידרמלית in vivo, ולפיכך אינם תורמים לתחזוקה ארוכת הטווח של האפידרמיס; 3) האפידרמיס הטרנסגני משתמר רק בזכות תאי גזע ארוכי חיים שזוהו כ- holoclones; 4) תאי גזע מייסדים הנמצאים בתרביות הראשוניות המקוריות חייבים לעבור התחדשות-עצמית אקסטנסיבית (in vitro ו- in vivo) על מנת לשמר את האפידרמיס המחודש, מסקנה הנתמכת על ידי מספר האירועים המשותפים בכלל הדגימות וה- holoclones.