אפרוציטוזיס מקרופאגים Saturated-efferocytosis generates pro-resolving CD11blow macrophages

אפרוציטוזיס רווי מחולל מקרופאגים CD11blow מעודדי רזולוציה: אפנון על ידי רזולבינים וגלוקוקורטיקואידים

במהלך שלב הרזולוציה של הדלקת, לויקוציטים אפופטוטיים עוברים אפרוציטוזיס על ידי מקרופאגים בצורה לא-פלוגיסטית, המובילה לתגובות מופחתות לבקטריות וייצור ציטוקינים אנטי-דלקתיים. רצפטור משלים 3 ומתווכי ליפידים מעודדי רזולוציה מעודדים את בליעת הלויקוציטים האפופטוטיים על ידי המקרופאגים. במחקר זה אנו מציגים ראיות להופעתם של מקרופאגים CD11blow מעודדי רזולוציה in vivo במהלך הרזולוציה של צפקת (פריטוניטיס) אצל מכרסמים. מקרופאגים אלו הם שונים מרוב המקרופאגים האחרים בצפק במונחים של פרופיל ביטוי החלבון הפונקציונאלי שלהם, יחד עם תכונות מקדמות רזולוציה כמו בליעה של לויקוציטים אפופטוטיים, אדישות לליגנדים TLR, ונדידה לאיברים לימפואידים. בנוסף, מצאנו המרה של מקרופאגים מ- CD11bhigh לפנוטיפ CD11blow בזמן האינטראקציה עם תאים אפופטוטיים ex vivo. מצאנו בנוסף כי מתווכי ליפידים מעודדי רזולוציה E1 ו- D1 והגלוקוקורטיקואיד דקסמטזון מווסתים את התפקוד של מקרופאגים מעודדי רזולוציה in vivo. רגולציה זו הובילה לפונקצית רזולוציה חדשנית, כלומר הפחתת דרישת העיכול של לויקוציטים אפופטוטיים עבור ייצור של מקרופאגים CD11blow . פנוטיפ חדש זה והמארקרים המולקולאריים מגדירים את המקרופאגים הרוויים החדשים. לפיכך, אנו טוענים כי האפרוציטוזיס מייצר מאקרופאגים CD11blow הדרושים להכלה לא-פלוגיסטית מלאה של סוכנים דלקתיים וריפוי דלקות חריפות.

מבוא

מקרופאגים הם סוג מגוון של תאים חיסוניים, אשר למרות המוצא המשותף, מסוגלים לעבור שינוי לפנוטיפים בעלי תפקוד ייחודי הממלאים תפקיד מרכזי בדלקות חריפות וכרוניות, לצד רזולוציה של דלקות ופיברוזיס. בזמן הרזולוציה הפעילה של הדלקת, אלמנטים של התגובה החיסונית עוברים חיסול. הלויקוציטים שגרמו לתגובה הדלקתית עוברים אפופטוזיס, וכתוצאה מכך, ה- PMN האפופטוטיים מטוהרים על ידי מקרופאגים ותאים פגוציטים אחרים באופן לא-פלוגיסטי. הבליעה של תאים אפופטוטיים על ידי הפגוציטים מתווכת על ידי אותות המתבטאים על פני השטח של תאים אפופטוטיים והרצפטורים התואמים שלהם, טרומובוספונדין-CD36, גלובול-EGF-פקטור 8-αvβ3-אינטגרין, ואחרים.

אופסוניזציה על ידי iC3b מובילה לבליעה מוגברת של תאים אפופטוטיים באמצעות הרצפטורים המשלימים 3 (CD18/CD11b) ו- 4 (CD18/CD11c) המתבטאים על המקרופאגים. בנוסף, ליפוקסין A4 (LX) מגביר את הספיגה של PMN אפופטוטיים על ידי מקרופאגים באופן תלוי-CD18. תאים אפופטוטיים משמשים בנוסף בתור סמני רזולוציה עבור מקרופאגים, מכיוון שהרקוגניציה שלהם גורמת לאיתות החוסם את השחרור של מתווכים מעודדי-דלקות מהמקרופאגים. שחרור זה נגרם על ידי בקטריות, והחסימה שלו, הנקראת השתקה חיסונית, כוללת בנוסף ייצור של ציטוקינים TGF-β ו- IL-10 המעודדים רזולוציה וריפוי פצעים. הבליעה של לויקוציטים אפופטוטיים על ידי מקרופאגים גורמת בנוסף לעיכוב של ביטוי NO סינתאז (iNOS) ומעוררת ביטוי של ארגינאז-1 בקו התאים של מקרופאגים RAW 264, ובכך מונעת ייצור ריאקטיבי של NO. בנוסף, הביטוי של 15-ליפוקסיגנאז (LO)-1, המעורב בייצור של מתווכי ליפידים מעודדי רזולוציה ובייצור של גורמי גדילה אנגיוגניים על ידי מקרופאגים, הוא תוצר של הספיגה של התאים האפופטוטיים. מתווכי ליפידים מעודדי רזולוציה כמו רזולבין E1 (RvE1) ו- RvD1 חוסמים את החדירה של PMN לנקבים דלקתיים. ה- RvE1 מעודד בנוסף את ההסרה של PMN אפופטוטיים על ידי מקרופאגים ואת הנדידה של לויקוציטים מחוץ לאתרים הדלקתיים במהלך הרזולוציה. גלוקוקורטיקואידים הם מערך נוסף של מתווכים מעודדי רזולוציה המתרחשים באופן טבעי, הפועלים באופן חלקי דרך שחרור של אנקסין-A1 ואקטיבציה של רצפטור LXA4, ALX/FPR2.

במחקר הקודם, זיהינו סוג-משנה של מקרופאגים המופיעים במהלך הרזולוציה של צפקת אצל מכרסמים, ומבטאים רמות נמוכות יותר של CD11b בהשוואה לרוב אוכלוסיית המקרופאגים. במחקר הנוכחי, מצאנו כי מקרופאגים CD11blow מציגים פנוטיפ ייחודי. מקרופאגים CD11blow הם שונים ממקרופאגים CD11bhigh בביטוי של חלבונים פונקציונאליים, כמו iNOS, ארגינאז-1, COX-2, 12/15-LO, ו- MMP-9. תאים אלו בלעו מספר גבוה יותר במידה מובהקת של PMN אפופטוטיים בהשוואה למקרופאגים CD11bhigh, הגיבו בצורה פחותה לאקטיבציה על ידי ליגנדים TLR שונים במונחים של הפרשת ציטוקינים וכימוקינים, איבדו את הפוטנציאל הפגוציטי שלהם, והציגו נטייה לנדוד לאיברים לימפואידיים. באופן ספציפי, חשיפה לתאים אפופטוטיים ex vivo הספיקה בכדי לגרום להמרה של מקרופאגים CD11bhigh ל- CD11blow. בנוסף, ההצגה של סוכנים מעודדי רזולוציה in vivo הגבירה באופן מובהק את ההופעה של מקרופאגים CD11blow, למרות הבליעה המופחתת של PMN אפופטוטיים, וביחד הן מגדירות את אוכלוסיית המשנה החדשה של אפרוציטים רוויים.

תוצאות

מקרופאגים CD11blow מבטאים פרופיל ייחודי של חלבונים פונקציונאליים

על מנת להגדיר את אוכלוסיות התאים אותם אנו רוצים לחקור, סיווגנו ומיינו את המקרופאגים F4/80+ לפי ביטוי ה- CD11b שלהם (איור  1A). מצאנו כי 66 שעות לאחר תחילת הצפקת, 70% מתאי האקסודציה היו מקרופאגים (איור 1B). מתוכם, 17% ביטאו רמות נמוכות של CD11b (איור 1C ו- 2A). הביטוי של CD11b על מקרופאגים CD11bhigh היה גבוה פי עשר מהביטוי שלו על מקרופאגים CD11blow (איור 1D). הכמות של CD11b בתמציות חלבונים של מקרופאגים CD11blow הייתה נמוכה יותר באופן מובהק מהכמות שלו בתמציות של מקרופאגים CD11bhigh (איור 1A, פאנל עליון). כתוצאה מכך, ערכנו ניתוח של חלבונים מסוימים הרלוונטיים לדלקות, המאופיינים על ידי הביטוי שלהם במקרופאגים עם אקטיבציה של (M1) ו- (M2) על מקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow. התוצאות שלנו (איור 1) מראות כי מקרופאגים CD11bhigh מבטאים רמות נמוכות של iNOS, רמות בינוניות של COX-2 ו- MMP-9, ורמות גבוהות של ארגינאז-1, ואינם מבטאים 12/15-LO, בעוד שמקרופאגים CD11blow מבטאים רמות נמוכות של COX-2 ו- MMP-9, רמות בינוניות של 12/15-LO, ואינם מבטאים iNOS או ארגינאז-1. בנוסף, המארקר F4/80 של התמיינות המקרופאגים הציג ביטוי גבוה יותר במקרופאגים CD11bhigh (איור 2), כלומר, תאים אלו הם שונים בהשוואה למקרופאגים CD11blow. באופן ספציפי, הליזטים של מקרופאגים CD11blow הכילו כמות קטנה יותר של אקטין בהשוואה למקרופאגים CD11bhigh (איור 1), כלומר, קיים אפנון של הדינאמיקה של שלד התא בתאים אלו. באופן נגדי, גן תחזוקה נוסף – טובולין – הציג ביטוי זהה בשתי תמציות החלבונים (איור 1), מה שמצביע על טעינת חלבונים זהה. ניתוח נוסף של ביטוי הרצפטורים של פני השטח הראה ביטוי מופחת של CD206 ו- CD163 (שניהם מארקרים של M2) על מקרופאגים CD11blow, בהשוואה למקרופאגים CD11bhigh (הבדל של פי 19 ופי 17, בהתאמה; N = 3). כלומר, מקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow מציגים פרופילי ביטוי שונים של חלבונים פונקציונאליים ומארקרים של התמיינות.

מקרופאגים CD11blow בולעים כמות גדולה יותר של PMN אפופטוטיים מאשר מקרופאגים CD11bhigh

הטיהור של PMN אפופטוטיים מאתרי הרזולוציה של הדלקת הינו חיוני עבור הרזולוציה ועבור ההומיאוסטזיס. לפיכך, בדקנו האם מקרופאגים CD11blow הם שונים מתאי CD11bhigh ביכולות האפרוציטוזיס שלהם. התוצאות המוצגות באיורים 2A ו- B מראות כי מקרופאגים CD11blow בלעו בממוצע כמות גבוהה יותר באופן מובהק של PMN מאשר מקרופאגים CD11bhigh (12.2 ± 0.2 נויטרופילים/מקרופאגים (N/M) ו- 2.2 ± 0.2 N/M, בהתאמה). הכתמה עם LysoTracker (איור 2A ואיור 3) הראתה כי ה- PMN האפופטוטיים המתבטאים במקרופאגים עברו פגוציטוזה ואינם רק מחוברים לפני השטח של המקרופאגים. למעשה, המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow היו שונים זה מזה על ידי רף בליעה של 7 PMN (איור 2C): 90.6 ± 4.2% מהמקרופאגים CD11blow בלעו 7 PMN או יותר, בעוד ש- 97.5 ± 1.2% מהמקרופאגים CD11bhigh בלעו פחות מ- 7 PMN. התוצאות המוצגות באיור 2D מראות כי ההבדלים בין CD11bhigh ו- CD11blow במונחים של בליעת PMN אפופטוטיים הינם ייחודיים לא רק בנוגע לרף הבליעה, אלא גם קיימת חפיפה מועטה מאוד בין האוכלוסיות. כתוצאה מכך, רף הבליעה קיים בטווח צר מאוד, ולכן רק מקרופאגים שבלעו 6 PMN יכולים להיות מקרופאגים CD11bhigh או CD11blow במידה זהה.

איור 1: המקרופאגים CD11blow מציגים חתימת ביטוי חלבונים שונה ממקרופאגים CD11bhigh. האקסודציה מהרזולוציה של הצפק נאספה 66 שעות לאחר הזרקת זימוסאן A (1 mg) לעכברים. התאים עברו immunostaining עבור Ly-6G, F4/80 ו- CD11b. המקרופאגים Ly-6G- F4/80+ מוינו לאוכלוסיות של CD11bhigh ו- CD11blow. המקרופאגים הומסו ותכולת החלבון שלהם נותחה על ידי SDS-PAGE ותספיג חלבון. התוצאות מוצגות ב- blots (A) וממוצע ± SE של 3 ניסויים נפרדים (B). ההבדל בביטוי חושב לפי הנוסחא הבאה: יחידות דנסיטומטריות (DU) של תמצית CD11bhigh / DU של תמציות CD11blow מהניסויים. מוצגים הבדלים מובהקים של מבחני-t בין תמציות CD11bhigh לבין CD11blow (* p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.001).

מקרופאגים CD11blow מציגים תגובות מופחתות לליגנדים TLR

הבליעה של תאים אפופטוטיים על ידי מקרופאגים מובילה להשתקה חיסונית, המונעת תגובות דלקתיות מוגזמות במהלך הרזולוציה והקטבסיס. על מנת לבדוק האם מקרופאגים CD11blow הם מושתקים חיסונית, ערכנו אקטיבציה של מקרופאגים ממוינים עם LPS, וזיהינו את רמות ההפרשה של TNF-α, IL-1β, IL-10 ו- TGF-β על ידי מקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow. התוצאות (איור 3A) מראות כי המקרופאגים CD11bhigh הפרישו כמות גדולה פי שניים של TNF-α בהשוואה ל- CD11blow, ללא LPS. בנוסף, גירוי באמצעות LPS ב- 500 ng/mL גרם לרמה גבוהה ומקסימאלית של הפרשת TNF-α על ידי המקרופאגים CD11bhigh, בעוד שהמקרופאגים CD11blow לא הגדילו את הפרשת ה- TNF-α שלהם. הגענו לתוצאות דומות כאשר בחנו את ההפרשה של הציטוקינים והכימוקינים מעודדי הדלקות IL-1β, CCL2, CCL3 ו- CCL5 (איור 3B, E-G). באופן מפתיע, ההפרשה של IL-10, ציטוקין אנטי-דלקתי, גדלה גם היא במקרופאגים CD11bhigh לאחר גירוי LPS (איור 3C). באופן ספציפי, ההפרשה של הציטוקין מעודד הרזולוציה TGF-β הייתה גבוהה יותר במקרופאגים CD11blow, אך לא עלתה לאחר גירוי LPS (איור 3D).

מקרופאגים מושתקים חיסונית מגיבים במידה פחותה לליגנדים TLR שונים במונחים של ייצור ציטוקינים מעודדי דלקות. בכדי לקבוע האם המקרופאגים CD11blow הם באמת מושתקים חיסונית, ערכנו גירוי של מקרופאגים CD11blow ו- CD11bhigh עם ליגנדים TLR3 ו- TLR9 פולי (I:C) ו- CpG-אוליגודאוקסינוקליאוטידים (CpG-ODN), בהתאמה (איור 4), וקבענו את ההפרשה של TNF-α ו- IL-1β. התוצאות מראות כי גם ההפרשה של TNF-α וגם ההפרשה של IL-1β עלו לאחר החשיפה לפולי (I:C) ו- CpG-ODN של מקרופאגים CD11bhigh, בעוד שההפרשה של ציטוקינים אלו על ידי המקרופאגים CD11blow שעברו טיפול דומה הייתה נמוכה יותר במידה מובהקת. יש לציין כי לא נמצאה הפחתה מובהקת בביטוי של TLR3, 4 ו- 9 במקרופאגים CD11blow, בהשוואה למקרופאגים CD11bhigh (N = 3). כלומר, המקרופאגים CD11blow מגיבים בצורה פחותה לליגנדים TLR במונחים של הפרשת ציטוקינים וכימוקינים, ולפיכך הם מושתקים חיסונית.

מקרופאגים CD11blow הם “רוויים”

מכיוון שמצאנו כי  CD11bהוא חיוני לבליעה של תאים אפופטוטיים שעברו אופסוניזציה של iC3b, הביטוי המופחת שלו במקרופאגים שבלעו מספר גבוה של תאים אפופטוטיים מלמד כי המקרופאגים CD11blow איבדו את התפקוד הפגוציטי שלהם. על מנת לבדוק האם המקרופאגים CD11blow ו- CD11bhigh שונים זה מזה ביכולת לגרום לפגוציטוזה של חלקיקים חיצוניים, הזרקנו דיו ירוק PKH2-PCL ספציפי לפגוציטים לעכברים עם צפקת, ו- 4 שעות לאחר מכן תאי הצפק הוסרו, עברו immunostaining, ונותחו לצורך זיהוי של רכישת PKH2-PCL. התוצאות המוצגות באיור 5 מראות כי רוב המקרופאגים CD11blow לא רכשו PKH2-PCL (איור 5A), בעוד שרוב המקרופאגים CD11bhigh רכשו כמויות גדולות יותר של PKH2-PCL (איור 5B). כתוצאה מכך, ה- MFI של PKH2-PCL היה גבוה יותר מפי עשר במקרופאגים CD11bhigh (איור 5C). באופן ספציפי, חלק קטן מהמקרופאגים CD11blow תויגו במידה זעירה עם PKH2-PCL, כלומר קיימות שאריות של פעילות פגוציטית הנגרמות מתאים אלו, או כי מקרופאגים אלו עברו המרה מ- CD11bhigh לפנוטיפ CD11blow במהלך הניסוי, וכך איבדו את היכולת הפגוציטית שלהם לאחר רכישה של כמות קטנה של PKH2-PCL. באופן ספציפי, הצימוד של מקרופאגים-PMN שזוהה על ידי ניתוח FACS בתור צמדים של Ly-6G+F4/80+ ביטא רמות גבוהות יותר של CD11b ו- F4/80 מאשר מקרופאגים CD11blow (N = 8), כלומר המקרופאגים CD11bhigh בולעים PMN אפופטוטיים באופן אקטיבי, בעוד שהמקרופאגים CD11blow אינם עושים זאת. כלומר, המקרופאגים CD11blow הם “רוויים”, כלומר הם איבדו את הפוטנציאל הפגוציטי לאחר שהגיעו לרף בליעת ה- PMN והפחתת ביטוי ה- CD11b שלהם.

איור 2: המקרופאגים CD11blow בולעים כמות גדולה יותר של נויטרופילים אפופטוטיים מאשר מקרופאגים CD11bhigh. המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow הוכתמו עם Hoechst ו- LysoTracker, נותחו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, וצולמו (A תמונות משולבות). פרפרציות דומות מוספרו עבור ספיגת PMN אפופטוטיים ונותחו לפי מספר ממוצע של נוטירופילים שנבלעו (B) לכל מקרופאג (N/M), ושיעור התאים שהגיעו לרף הבליעה (C) או בלעו את המספר המיועד של PMN אפופטוטיים (D). התוצאות מוצגות כממוצע ± SE (B ו- C) או ייצוג (A ו- D) משלושת הניסויים. מוצגים הבדלים מובהקים לפי מבחני-t בין CD11bhigh לבין CD11blow (* p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.001).

מקרופאגים CD11blow נוטים לנדוד לאיברים לימפואידים

רוב המקרופאגים המתמיינים ממונוציטים ברקמות במהלך הדלקת נודדים לקשרי לימפה מנקזים ולטחול. התוצאות שלנו מראות כי המקרופאגים CD11blow אינם פגוציטים (איור 5). לפיכך, סביר להניח כי הם אינם דרושים יותר לרזולוציה באתר הדלקת, ויכול להיות שהם ממלאים תפקיד בתקשורת של מצב הרזולוציה באופן מערכתי. לפיכך, בדקנו האם המקרופאגים CD11blow עוזבים את אתרי הרזולוציה ונודדים לאיברים לימפואידים. לשם כך, בדקנו את ההתפלגות היחסית של המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow 66 שעות לאחר תחילת הצפקת בצפק, בקשרי הלימפה המפשעתיים, ובטחול. התוצאות מראות כי המקרופאגים CD11bhigh הם המקרופאגים העיקריים בצפק במהלך השלב המאוחר של הרזולוציה, ובאותו זמן, המקרופאגים CD11blow הם המקרופאגים העיקריים בקשרי הלימפה ובטחול (איור 6A). בכדי לבדוק האם המאקרופאגים CD11blow בקשרי הלימפה ובטחול מגיעים מהצפק, ערכנו ניסויי העברה אדפטיבית שבהם בודדנו מקרופאגים בצפק ותייגנו אותם באופן פלורסנטי, ולאחר מכן העברנו אותם לצפק של עכברים עם צפקת באותו זמן (48 שעות). התוצאות המוצגות באיור 6 מראות כי ההתפלגות של המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow המתויגים בצפק, בקשרי הלימפה המפשעתיים ובטחול 18 שעות לאחר ההעברה (איור 6B) הייתה דומה להתפלגות של המקרופאגים ללא תיוג (איור 6A). כלומר, בשלב המאוחר של הרזולוציה, המקרופאגים CD11blow של הצפק נוטים לנדוד לאיברים לימפואידים וייתכן שהם מעבירים אותות של שלב הרזולוציה למערכת החיסון הנרכשת.

איור 3: המקרופאגים CD11blow מפרישים רמות נמוכות יותר של ציטוקינים וכימוקינים מעודדי דלקות, אך רמות גבוהות יותר של TGF-β, בהשוואה ל- CD11bhigh. המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow עברו אקטיבציה עם הריכוזים המוצגים (A ו- B) או 1 μg/mL של LPS (C-G). לאחר מכן נבדקו ההפרשות של TNF-α (A), IL-1β (B), IL-10 (C), TGF-β (D), CCL2 (E), CCL3 (F), ו- CCL5 (G) באמצעות ELISA סטנדרטית. התוצאות מוצגות בתור ממוצע ± SE של 4 שכפולים ממדגם מייצג של 3 ניסויים. מוצגים הבדלים מובהקים לפי מבחני-t בין CD11bhigh לבין CD11blow או בין הבקרה לבין מקרופאגים שעברו גירוי LPS (* p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.001).

אינטראקציה עם תאים אפופטוטיים גורמת להמרה של מקרופאגים מ- CD11bhigh לפנוטיפ CD11blow

התוצאות המוצגות באיורים 2 ו- 6 מראות כי המקרופאגים CD11bhigh מומרים ל- CD11blow כאשר הם עוברים אינטראקציה עם PMN אפופטוטיים ובולעים אותם. כדי לקבוע האם האינטראקציה עם התאים האפופטוטיים היא מספיקה בשביל להפחית את הביטוי של CD11b במקרופאגים, ביצענו אינקובציה של מקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow עם ובלי תאי Jurkat אפופטוטיים, וזיהינו את השינויים בביטוי השטח של CD11b. התוצאות המוצגות באיור 7 מראות כי ביטוי ה- CD11b על פני השטח של המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow פחת באופן מובהק, לאחר האינקובציה עם תאים אפופטוטיים. ראוי לציין כי רמת הביטוי של CD11b בשתי אוכלוסיות המקרופאגים לאחר האינטראקציה עם התאים האפופטוטיים הייתה נמוכה יותר מאשר רמת הביטוי שלו על המקרופאגים CD11blow שנלקחו מהאקסודציה בצפק, ולפיכך יצרנו את אוכלוסיית המקרופאגים CD11b- שנוצרה ex vivo (איור 7C). הזיהוי של מקרופאגים CD11b- ex vivo, אך לא in vivo, מראה כי ההפחתה הראשונית בביטוי של CD11b שזוהתה in vivo יכולה להספיק בשביל לגרום לעזיבה של מקרופאגים מרקמות הרזולוציה, ולפיכך המקרופאגים CD11b- אינם נמצאים בנקבי הצפק. מצד שני, העובדה כי אין נתיבי יציאה בתרביות התאים מאפשרת להפחתה של CD11b להגיע לרמות נמוכות באופן מובהק של ביטוי. מעניין לראות כי חלק מההפחתה בביטוי של CD11b במקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow התרחשה לאחר תרבית ex vivo ללא תאים אפופטוטיים, ייתכן ובגלל ההשפעה המאוחרת של אותות תוך-תאיים הנמצאים במורד הזרם של הרקוגניציה של תאים אפופטוטיים in vivo. חשוב לציין כי לא זוהתה הפחתה מובהקת בביטוי השטח של F4/80 או CD11b לאחר אינקובציה של מקרופאגים עם חרוזי לטקס (LB) או LB שעברו אופסוניזציה IgG (איור 4A). באופן ספציפי, ההשפעה של התאים האפופטוטיים עברה חיקוי חלקי על ידי ליגציה של CD11b עם נוגדנים מונוקלונאליים (איור 4A), שגרמה להפחתה בביטוי השטח של CD11b, אך לא בביטוי של F4/80, תוצאה המראה כי CD11b מעורב במפל האותות הגורם להפחתה שלו. יש לציין כי ביטוי השטח של CD206 ו- CD163 לא עבר אפנון על ידי תאים אפופטוטיים ex vivo, אלא הופחת על ידי נוגדני אנטי-CD11b (איור 4A). בנוסף, חשיפה לזימוסאן A, TGF-β או תאים חיים לא גרמה להפחתה מובהקת בביטוי השטח של CD11b (N = 2). כלומר, ההפחתה בביטוי של CD11b ex vivo היא ספציפית לאינטראקציה עם תאים אפופטוטיים, ולא ניתן להשיגה על ידי טיפול עם מטרות פגוציטיות אחרות, בקטריות מפעילות-פרוטוטיפ, או ציטוקינים מעודדי רזולוציה, ואינה נגרמת כתוצאה מסוג התא של התאים האפופטוטיים.

כדי לבדוק האם האינטראקציה של המקרופאגים עם התאים האפופטוטיים גורמת בנוסף להבדלים המובהקים בביטוי החלבונים המבדיל בין CD11bhigh ל- CD11blow (איור 1), ביצענו אינקובציה של מקרופאגים מהצפק עם תאים אפופטוטיים ובחנו את השינויים בתכולת הציטופלסמה של CD11b, ארגינאז-1, 12/15-LO, ואקטין. התוצאות (איור 7D) מראות כי המקרופאגים שעברו אינקובציה עם תאים אפופטוטיים ביטאו רמות מופחתות של CD11b וארגינאז-1, ורמות גבוהות של 12/15-LO, כפי שניתן לצפות מההמרה של CD11bhigh ל- CD11blow. מעניין לראות כי גם הרמות של אקטין מסיס בדטרגנט במקרופאגים פחתו לאחר אינקובציה עם תאים אפופטוטיים. ממצאים אלו עקביים לממצאים של איור 1, המראים רמות מופחתות של אקטין בליזטים של מקרופאגים CD11blow, בהשוואה ל- CD11bhigh. כנראה שהבדלים אלו נגרמים מהמספר הגבוה של פאגוזומים הקשורים לאקטין הנוצרים בתאים אלו. חשוב לציין כי חשיפה ex vivo של מקרופאגים לנויטרופילים מזדקנים, אך לא ל- LB או LB שעברו אופסוניזציה IgG, גרמה להפחתה מובהקת בביטוי של CD11b וארגינאז-1 (איור 4B), בזמן שהביטוי של 12/15-LO עלה במערך זה על ידי כל המטרות הפאגוציטיות. באופן כללי, תוצאות אלו מראות כי האינטראקציה עם תאים אפופטוטיים היא מספיקה בשביל לגרום להמרה של CD11bhigh למקרופאגים CD11blow.

איור 4: המקרופאגים CD11blow מפרישים רמות נמוכות יותר של ציטוקינים מעודדי דלקות בתגובה לליגנדים TLR שונים. המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow עברו אקטיבציה עם פולי (I:C) (4 μg/mL, A ו- B) או CpG-ODN (1 μm, C ו- D) וה- TNF-α (A ו- C) או IL-1β (B ו- D) נבדקו באמצעות ELISA. התוצאות מוצגות בתור ממוצע ± SE של 4 שכפולים ממדגם מייצג של 3 ניסויים. מוצגים הבדלים מובהקים לפי מבחני-t בין CD11bhigh לבין CD11blow או בין מקרופאגים שעברו גירוי עם הבקרה, פולי (I:C) או CpG-ODN (* p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.001).

איור 5: המקרופאגים CDB11low הם רוויים. הוזרק דיו PKH2-PCL ירוק לעכברים 48 שעות לאחר תחילת הצפקת. לאחר 4 שעות נאספו תאי הצפק, עברו immunostaining עבור F4/80 ו- CDb11 ונותחו באמצעות FACSCalibur. התוצאות הן plot נקודות ייצוגיים של CDb11low (A) ו- CDb11high (B), או ערכי MFI ממוצעים ± SE של 5 ניסויים (C). מוצגים הבדלים מובהקים לפי מבחני-t בין CD11bhigh לבין CD11blow (*** p < 0.001).

איור 6: המקרופאגים CD11blow נוטים לנדוד לאיברים לימפואידים. A) התאים נאספו מהצפק, קשרי הלימפה המפשעתיים והטחול של עכברים עם צפקת במשך 66 שעות. התאים הוכתמו וביטוי ה- CDb11 על המקרופאגים נמדד באמצעות ציטומריית זרימה. B) המקרופאגים מהאקסודציה של הצפק נאספו 48 שעות מתחילת הצפקת, תויגו עם CFSE, והועברו לעכברים עם צפקת במשך זמן זהה. לאחר 18 שעות, התאים מהצפק, קשרי הלימפה המפשעתיים והטחול נאספו והביטוי של CD11b על המקרופאגים המועברים נמדד. התוצאות של A ו- B הם ממוצע ± SE של 3 ניסויים, 5 עכברים בכל ניסוי. מוצגים הבדלים מובהקים לפי מבחני-t בין CD11bhigh לבין CD11blow (* p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.001).

RvD1, RvE1 ודקסמטזון מפחיתים את הדרישה האפרוציטית עבור השתקה חיסונית של מקרופאגים

ה- Rv הם מתווכים הנוצרים בשלב הרזולוציה, ונגזרים מחומצות שומן רב בלתי רוויות ω-3. הם מעודדים רזולוציה בכך שהם פועלים על PMN ומקרופאגים. גלוקוקוריטקואידים הם בעלי תכונות דומות, כמו דקסמטזון (Dex) המעכב את החדירה של לויקוציטים לאתרי הדלקת ומעודד את הטיהור של PMN אפופטוטיים על ידי המקרופאגים. כדי לבדוק האם מתווכים מעודדי רזולוציה מווסתים את ההופעה של מקרופאגים CD11blow ובכך מעודדים רזולוציה, החדרנו RvD1, RvE1 או Dex לעכברים עם צפקת, והלויקוציטים נאספו ונותחו לצורך זיהוי של מספר המקרופאגים והנויטרופילים, הביטוי של CD11b, הבליעה של PMN, והתגובה ל- LPS. התוצאות מראות (איור 8A) כי RvD1, RvE1 ו- Dex גרמו להפחתה במספר הנויטרופילים, בעוד ש- RvD1 ו- Dex, אך לא RvE1, הפחיתו גם את מספר המקרופאגים בנקבי הצפק. בנוסף, RvD1, RvE1 ו- Dex הגבירו (איור 8B) את ההופעה של המקרופאגים CD11blow (עלייה של 32.8 ± 8.8, 46.2 ± 1.8 ו- 39.9 ± 4.6% בהשוואה לביקורת, עבור RvD1, RvE1 ו- Dex, בהתאמה) באקסודציה של הצפק. באופן ספציפי, RvD1 ו- RvE1, אך לא Dex, הפחיתו את ביטוי ה- CD11b על מקרופאגים CD11bhigh (איור 8C). כדי לבדוק האם RvE1, RvD1 ו- Dex מווסתים את בליעת ה- PMN האפופטוטיים על ידי המקרופאגים במהלך הרזולוציה, תאי האקסודציה מוספרו עבור בליעת PMN ונותחו (איור 2). באופן מפתיע, התוצאות באיור 8D מראות כי RvD1, ובמידה רבה יותר RvE1 ו- Dex, מפחיתים את המספר של PMN אפופטוטיים הנבלעים על ידי מקרופאגים הנמצאים בצפק. ניתוח מפורט של הבליעה לפי רף (איור 8E) הראה כי RvE1 ו- Dex, אך לא RvD1, גרמו להופעה של מקרופאגים בעלי בליעה נמוכה בצפק, שסווגו בתור “חסרי ניסיון” מכיוון שהם גרמו לפגוציטוזה של פחות מ- 2 N/M.

כדי לאמת את השיפור בהשתקה החיסונית של מקרופאגים לאחר הטיפול עם RvD1, RvE1 ו- Dex, המקרופאגים עברו אקטיבציה עם LPS, ובדקנו את הפרשת הציטוקינים. התוצאות המוצגות באיור 8F מראות כי RvD1 ו- RvE1, ובמידה פחותה יותר גם Dex, עיכבו את ההפרשה של TNF-α ממקרופאגים ללא גירוי וממקרופאגים עם גירוי LPS. זיהינו תגובה דומה (איור 8G) עם RvD1, RvE1 ו- Dex כאשר בדקנו את ההפרשה של IL-1β ממקרופאגים לאחר גירוי LPS. ההפרשה של IL-10, ציטוקין מעודד רזולוציה הנוצר אחרי עיכול של תאים אפופטוטיים, התגברה על ידי כל אחד מהמתווכים מעודדי הרזולוציה, במקרופאגים ללא גירוי ובמקרופאגים לאחר גירוי LPS (איור 8H). לפיכך, הטיפול עם RvD1, RvE1 ו- Dex עודד את ההשתקה החיסונית של המקרופאגים, ואת ההפרשה של ציטוקינים מעודדי רזולוציה מתאים אלו.

איור 7: האינטראקציה עם לויקוציטים אפופטוטיים ממירה מקרופאגים CD11bhigh ל- CD11blow. המקרופאגים CD11bhigh (A) ו- CD11blow (B) הממוינים עברו immunostaining עבור CD11b באופן מיידי (A ו- B, קו מנוקד) או לאחר אינקובציה של 20 שעות ללא תאים (A ו- B, קו מקווקו) או עם תאי Jurkat אפופטוטיים (יחס של 1:5, A ו- B, קו רציף). לאחר מכן התאים האפופטוטיים הלא-קשורים נשטפו והמקרופאגים נאספו ועברו immunostaining עבור ביטוי ה- CD11b על פני השטח שלהם. התוצאות הן היסטוגרמות מייצגות (A ו- B, אוכלוסיות המקרופאגים) או ערכי MFI ממוצעים ± SE (C) של 3 ניסויים. מוצגים הבדלים מובהקים לפי מבחני-t בין CD11bhigh לבין CD11blow (* p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.001). D) המקרופאגים מהצפק נאספו 66 שעות מתחילת הצפקת ועברו אינקובציה עם תאי Jurkat או ללא תאים. לאחר 20 שעות, המקרופאגים נאספו ועברו המסה. תמציות החלבונים עברו הרצה עם SDS-PAGE ונותחו בעזרת תספיג חלבון לזיהוי החלבונים. התוצאות הן מערך מייצג של תספיגים מ- 3 ניסויים.

דיון

כיום, התפיסה היא שמקרופאגים מציגים שני פנוטיפים פונקציונאליים נפרדים: מקרופאגים באקטיבציה קלאסית ומקרופאגים באקטיבציה חלופית, הנקראים M1 ו- M2, בהתאמה. מקרופאגים M2 מתחלקים לתת-סוגים של M2a, M2b ו- M2c, על סמך פרופילי תגובות שונים, לאחר חשיפה למתווכי פולריזציה שונים כמו קומפלקסים חיסוניים, ציטוקינים Th2, או גלוקוקורטיקואידים. המפגש של מקרופאגים עם תאים אפופוטוטיים הוא טריגר פולריזציה נוסף הגורם לתגובות דמויות-Th2, ולביטוי של ארגינאז-1 ו- 12/15-LO. המחקר של ביסטרום זיהה מקרופאגים היברידיים בשלב הרזולוציה (rM), המפגינים תכונות של מקרופאגים M1 כמו ביטוי של iNOS ו- COX-2, ובאותו זמן מבטאים את הרצפטור מנוז וארגינאז-1 ומפרישים רמות נמוכות יותר של ציטוקינים דלקתיים ורמות גבוהות של IL-10, שהן תכונות של M2. בנוסף, ה- rM נוטים להישאר בצפק ולעודד תגובות הומיאוסטזיס ברקמות הרזולוציה. במאמר זה אנו מתארים סוג-משנה ייחודי של מקרופאגים הנמצאים במרווח הצפק באותו זמן כמו rM. עם זאת, מקרופאגים CD11blow אלו אינם מבטאים iNOS או ארגינאז-1, אך מבטאים רמות נמוכות של COX-2 ו- MMP-9 (אנזימים M1) בהשוואה ל- CD11bhigh (איור 1). חשוב לציין כי המקרופאגים CD11blow,  אך לא CD11bhigh, מבטאים את האנזים ממיר הליפידים 12/15-LO, המעורב בייצור של מתווכי לפידים מעודדי רזולוציה, כמו 15-הידרוקסידוקוסאקסיונאט, LX, פרוטקטינים ו- Rv.

למרות שהטיהור של תאים אפופטוטיים על ידי המקרופאגים, וכתוצאה מכך ההשתקה החיסונית של המקרופאגים תוארו בהרחבה במחקרים קודמים, טרם זוהתה אוכלוסיית מקרופאגים לא-פלוגיסטית in vivo. בנוסף, הראיות לדרישה כמותית של בליעת PMN אפופטוטיים על ידי המקרופאגים המובילה להשתקה החיסונית שלהם in vivo עדיין חסרות. המחקרים הקודמים מצאו כי CD11b מעורב בבליעה של תאים אפופטוטיים על ידי מקרופאגים בתיווך של המערכת המשלימה, והמחקרים האחרונים בתחום מראים כי הקשירה שלו לליגנדים שונים מובילה לדיכוי חיסוני מובהק במקרופאגים. בנוסף, הביטוי של CD11b על DC בלתי בוגרים הופחת, לאחר עיכול של תאים אפופטוטיים בתיווך iC3b. הממצאים שלנו מראים כי מקרופאגים CD11blow המופיעים באתרים דלקתיים בשלב המאוחר של הרזולוציה בולעים יותר PMN אפופטוטיים מאשר מקרופאגים CD11bhigh (איור 2) ומפרישים כמות קטנה יותר של ציטוקינים וכימוקינים מעודדי דלקות, אך לא TGF-β, בתגובה לליגנדים TLR (איורים 3 ו- 4), ובכך ממלאים את הייעוד של מקרופאגים מעודדי רזולוציה. באופן ספציפי, המקרופאגים CD11blow לא ייצרו IL-10, בהתאם למחקרים הקודמים שבדקו את התגובות של מקרופאגים לתאים אפופטוטיים in vivo.

באופן ראוי לציון, המקרופאגים CD11blow היו סוג-המשנה העיקרי של מקרופאגים F4/80+ בקשרי הלימפה ובטחול, ובמיוחד באוכלוסייה שנוצרה בצפק (איור 6), שם המקרופאגים CD11bhigh היו סוג-המשנה העיקרי, כלומר המרה מ- CD11bhigh לפנוטיפ CD11blow היא חיונית לנדידה של מקרופאגים לאיברים הלימפואידים בזמן הרזולוציה של הדלקת. מצאנו בנוסף כי אינקובציה של מקרופאגים CD11bhigh עם תאים אפופטוטיים ex vivo גרמה להפחתה מובהקת של CD11b (איור 7). הפחתה זו בביטוי של CD11b קשורה לשינויים בחתימת ביטוי החלבון האופיינית להמרה של CD11bhigh ל- CD11blow, וכך מצביעה על שינוי פנוטיפ מלא הנגרם על ידי האינטראקציה של המקרופאגים עם התאים האפופטוטיים. באופן כללי, התוצאות שלנו מראות כי מקרופאגים CD11bhigh מציגים תכונות מעורבות של M1 ו- M2, בעוד שהמקרופאגים CD11blow, למרות שהם נוצרים מאוכלוסיית ה- CD11bhigh, מציגים פנוטיפ ייחודי. כאשר בוחנים את המחקר הנוכחי מול המחקרים הקודמים שעסקו באפיון של מקרופאגים בזמן הרזולוציה, ולאור האינטראקציה שלהם עם התאים האפופטוטיים, נראה כי הפנוטיפ המוצג על ידי המקרופאגים תלוי במספר ה- PMN האפופטוטיים שאותם הוא בלע, ובסביבה שבה הוא פועל. כלומר, התרשים הפונקציונאלי המוצג באיורים 9A-C יוצא לפועל.

מכיוון שהבליעה של התאים האפופטוטיים אינה אירוע מסונכרן והמקרופאגים ממשיכים לחדור לאתרי הדלקת במהלך הרזולוציה, אוכלוסיית המקרופאגים בצפק, בכל זמן נתון, היא ככל הנראה הטרוגנית. כאשר משלבים את התוצאות של ביסטרום עם המחקר שלנו, אנו מגיעים למסקנה כי רוב המקרופאגים הנמצאים בצפק במהלך השלב המאוחר של הרזולוציה (מקרופאגים rM או CD11bhigh) הם דמויי-M1 או דמויי-M2, למרות שייתכן וקיים גם פנוטיפ היברידי או טרנזיציה של M1 ל- M2. מקרופאגים אלו הם שונים מהמקרופאגים CD11blow, שככל הנראה הם בעלי יכולת טובה יותר לנדידה לרקמות לימפואידיות והעברה של אותות רזולוציה למערכת החיסון הנרכשת.

חשוב לציין כי המקרואפגים CD11blow מאבדים את הפעילות הפגוציטית שלהם (איור 5) לאחר ההמרה מ- CD11bhigh, ולכן הם נקראים “מקרפואגים רוויים”. לפי מיטב ידיעתנו, האינדיקציה הראשונה לכך שהבליעה של תאים אפופטוטיים על ידי מקרופאגים היא בעלת הגבלה-עצמית, ולכן משמשת כמנגנון משוב המאפנן את התפקודים מעודדי הרזולוציה של המקרופאגים ואת אתר הפעולה שלהם (רקמת הרזולוציה או לימפואידים). לפיכך, ברגע שהמקרופאגים מגיעים לרף הבליעה של PMN אפופטוטיים, הם עוברים השתקה חיסונית ורוויה. כתוצאה מכך, המקרופאגים עוזבים את רקמת הרזולוציה דרך מערכת הלימפה, מכיוון שהם אינם תורמים יותר לרזולוציה באתר.

ה- RvD1 ו- RvE1 מפגינים טווח של פעולות אנטי דלקתיות ומעודדות רזולוציה. ה- Dex הוא רגולטור חזק נוסף של תגובות חיסוניות חריפות, והוא מתווך פונקציות מעודדות רזולוציה בעיקר באמצעות ייצור של פפטידים מסוג אנקסין A1, הפועלים דרך רצפטור LXA4. ה- Dex, LXA4 ו- RvE1 מעודדים את הבליעה של PMN אפופטוטיים על ידי המקרופאגים בזמן הרזולוציה של הדלקת. מחקר זה חושף פונקציה מעודדת רזולוציה חדשנית של RvE1, RvD1 ו- Dex, כלומר, הפחתה של מספר האירועים הקשורים בבליעה הדרושים להשתקה חיסונית של המקרופאגים, כפי שניתן לראות באיור 9. למעשה, RvE1 ו- Dex הפחיתו את מספר המקרופאגים שבלעו 7 PMN אפופטוטיים או יותר ב- 84.6% ו- 100%, בהתאמה, והגדילו את מספר המקרופאגים CD11blow ב- 46.2% ו- 39.9%, בהתאמה (איור 8). תפקוד זה מאפשר הגברה של ההשתקה החיסונית של המקרופאגים באתרי הרזולוציה, וייתכן והוא מעודד את העזיבה שלהם מאתרי הרזולוציה, כפי שמחקרים קודמים מצאו לגבי RvE1. בנוסף, ההופעה של מקרופאגים “חסרי ניסיון” שבלעו פחות משני PMN לאחר הייצור של RvE1 ו- Dex בנקבי הרזולוציה (איור 8E) מלמדת כי תרכובות אלו מגבירות את התחלופה של המקרופאגים באתרי הרזולוציה כדי “לפצות” על הבליעה המופחתת של כל מקרופאג, ובכך מאיצות את הטיהור של התאים האפופטוטיים. לפיכך, ההפחתה ב- PMN האפופטוטיים שנמצאה במקרופאגים בצפק בזמן הרזולוציה לאחר טיפול עם RvE1 ו- Dex כנראה נגרמת מהפעולות המצטברות של כל אחת מתרכובות אלו, הכוללות עידוד של חדירה של מקרופאגים נוספים לתוך הצפק, ועידוד של עזיבת המקרופאגים הרוויים, לאחר ההשתקה החיסונית. יש לציין כי RvE1 ו- RvD1 עיכבו את הייצור של TNF-α בגירוי LPS מהמקרופאגים בצפק במידה גבוהה יותר מאשר Dex, למרות שהמינון שלהם היה קטן פי 250, תוצאה המלמדת כי Rv יציג יכולות טובות יותר מאשר גלוקוקורטיקואידים בטיפול בפתולוגיות הקשורות ברזולוציה מופחתת.

לסיכום, המחקר שלנו חשף אוכלוסייה חדשה של מקרופאגים המציגה תכונות מעודדות רזולוציה הדרושות להשלמת רצף הרזולוציה ועבור התקשורת של החזרה להומיאוסטזיס באיברים הלימפואידים בזמן הרזולוציה של התגובה הדלקתית החריפה. בנוסף, זיהינו פעולות חדשות עבור Rv וגלוקוקורטיקואידים על המקרופאגים במהלך הרזולוציה של הדלקת, ממצא שיכול להצביע על תועלת תרפויטית חדשה עבור הפרעות דלקתיות חמורות.

איור 8: RvD1, RvE1 ו- Dex מאפננים את הביטוי של CD11b, בליעת PMN אפופטוטיים, והפרשת ציטוקינים על ידי מקרופאגים. עכברים עם צפקת קיבלו זריקות של RvD1, RvE1 (100 ng/mouse), Dex (25 μg/mouse) או בקרה 48 שעות מתחילת הצפקת. לאחר 66 שעות, תאי האקסודציה של הצפק מכל הטיפולים נאספו, מוספרו, ועברו immunostaining עבור Ly-6G, F4/80 ו- CD11b, ונותחו בציטומטריית זרימה על מנת לזהות את מספר מקרופאגים והנויטרופילים (A), שיעור המקרופאגים CD11blow (B), ורמת הביטוי של CD11b על המקרופאגים CD11bhigh (C). חלק מתאי האקסודציה הוכתמו בנוסף עם Hoechst ונמדדה הבליעה של PMN אפופטוטיים על ידי המקרופאגים (D ו- E). בנוסף, המקרופאגים בודדו מכל הטיפולים ועברו גירוי ex vivo עם LPS (500 ng/mL). לאחר 24 שעות, נמדדה ההפרשה של TNF-α (F), IL-1β (G) ו- IL-10 (H) מהמקרופאגים. התוצאות הן ממוצע ± SE של 4 שכפולים ממדגם מייצג של 3 ניסויים. מוצגים הבדלים מובהקים לפי ANOVA בין לויקוציטים ומקרופאגים מעכברים שטופלו עם הבקרה לבין מקרופאגים שטופלו עם RvD1, RvE1 או Dex (* p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.001).

חומרים ושיטות

ריאגנטים

ערכות Elisa עבור TNF-α, IL-1β, IL-10, TGF-β, CCL2, CCL3 ו- CCL5 של עכברים נרכשו מ- R&D Systems. ה- CFSE, סטאורוספורין, LPS, ערכת פלורסנט ירוק PKH2-PCL ו- Dex נרכשו מ- Sigma. הפולי (I:C) וה- CpG-ODN נרכשו מ- InvivoGen. ה- RvE1 (5S,12R,18R-טריהידרוקסי-4Z,8E,10E,14Z,16E-חומצה איקוסאפנטנואית) ו- RvD1 (7S,8R,17S-טריהידרוקסי-4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z-חומצה דוקוהקסאנואית) נרכשו מ- Cayman Chemicals וה- Rv הסינתטיים הותאמו בהתאם למחקרים קודמים.

צפקת מכרסמים

עכברי C57BL/6 זכרים (בני 6-8 שבועות) קיבלו זריקות של זימוסאן A (1 mg). לאחר 66 שעות, נאספה האקסודציה מהצפק ותאי האקסודציה הוכתמו עם Ly-6G, F4/80 ו- CD11b, ונותחו עם FACSCalibur. בחלק מהניסויים, המקרופאגים מוינו לאוכלוסיות CD11bhigh ו- CD11blow של >95% זיקוק באמצעות FACsaria, והאוכלוסיות הנפרדות שימשו לניתוח מיקרוסקופי ועבור גירוי ex vivo. בחלק מהניסויים, הוזרק לעכברים PKH2-PCL ירוק (0.25 μM, 0.5 mL) לאחר 48 שעות ותאי הצפק נאספו 4 שעות מאוחר יותר, עברו immunostaining עבור F4/80 ו- CD11b ונותחו עבור אינטנסיביות פלורוסנטית של אוכלוסיות מקרופאגים שונות. בניסויים הרלוונטיים, הבקרה, RvD1, RvE1 (100 ng/mouse כל אחד) או Dex (25 μg/mouse) הוחדרו לצפק 48 שעות לאחר תחילת הצפקת, והאקסודציה נאספה לאחר 66 שעות ונותחה.

איור 9: תרשים פונקציונאלי של המרת המקרופאגים בזמן האפרוציטוזיס של שלב הרזולוציה. המקרופאג שחודר דרך הרקמה הדלקתית מאמץ פנוטיפ דמוי-M1 (כולל ביטוי של ציטוקינים וכימוקינים דלקתיים, iNOS ו- COX-2) לפני המפגש עם ה- PMN האפופטוטיים (A). לאחר שהוא פוגש ב- PMN האפופטוטיים ומתחיל לבלוע אותם, המקרופאג מתחלף לפנוטיפ דמוי-M2 המעורב בתיקון רקמות וחזרה להומיאוסטזיס. החלפה זו כוללת עלייה בביטוי של ארגינאז-1 ו- IL-10, וירידה של ציטוקינים דלקתיים, COX-2 ו- iNOS (B). המחקרים הקודמים, שמצאו כי ציטוקינים M2 ממלאים תפקיד ברזולוציה של דלקות ואפרוציטוזיס, תומכים בחלק זה של התרשים. כאשר הבליעה של PMN אפופטוטיים על ידי המקרופאגים ממשיכה ומגיעה לרמת הסף (רוויה של אפרוציטוזיס), המקרופאג מתחלף שוב לפנוטיפ CD11blow (C) שאינו מפריש ציטוקינים וכימוקינים דלקתיים או IL-10, אך מפריש רמות גבוהות של TGF-β. המקרופאגים CD11blow אינם מבטאים iNOS או ארגינאז-1, ומבטאים רמות נמוכות של COX-2. מעניין לראות כי החלפה זו גורמת לביטוי של 12/15-LO, המתבטא אך ורק על ידי מקרופאגים CD11blow, והמחקרים הקודמים מצאו כי הוא מתבטא באופן תלוי-TGF-β, לאחר האינטראקציה של המקרופאגים עם התאים האפופטוטיים. ההחלפה השנייה גורמת בנוסף לעצירה של בליעת PMN אפופטוטיים בתיווך CD18/CD11b, ובכך מאפשרת עזיבה מהירה של מקרופאגים מרקמת הרזולוציה ונדידה לאיברים הלימפואידים. באיברי מטרה אלו, נראה כי CD11blow מייצרים מתווכי ליפידים מעודדי רזולוציה הנגזרים מ- 12/15-LO, ומעבירים אותות הומיאוסטזיס לתאים מציגי-אנטיגן ולימפוציטים. ניתן לאפנן את רווית האפרוציטוזיס על ידי מתווכים מעודדי רזולוציה, כמו RvD1, RvE1 ו- Dex (D). אפנון זה מאיץ את ההשתקה החיסונית ואת העזיבה של מקרופאגים CD11blow מעודדי רזולוציה לאיברי הלימפה, שם הם תורמים להפחתת התגובה החיסונית הנרכשת. ה- RvE1 ו- Dex מעודדים בנוסף את החדירה של מקרופאגים חדשים לרקמת הרזולוציה כדי להמשיך את הטיהור של PMN אפופטוטיים וחזרה להומיאוסטזיס.

ניתוח תספיג חלבון

תמציות חלבון של האוכלוסיות הממוינות (זיקוק >95%) של CD11bhigh ו- CD11blow הורצו תוך שימוש ב- 10% SDS-PAGE (5 μg/lane), הועברו לממבראנות ניטרוצלולוזה, ועברו תספיג חלבון עם נוגד-עכברים CD11b של עזים, נוגד-עכברים iNOS של ארנבים, נוגד-עכברים ארגינאז-1 של עזים, נוגד-עכברים COX-2 של ארנבים, נוגד-עכברים 12/15-LO של כבשים, נוגד-עכברים MMP-9 של עזים, נוגד-עכברים β-אקטין של עזים, או נוגד-עכברים טובולין של עזים. לאחר מכן הממבראנות נשטפו ועברו אינקובציה עם נוגדן ה- HRP המשני המתאים. התספיגים נשטפו ופותחו באמצעות EZ-ECL.

העברת מקרופאגים

המקרופאגים בודדו מהאקסודציה של הצפק 48 שעות לאחר תחילת הצפקת, הוכתמו עם CFSE (1 μM) והוזרקו לצפק של עכברים שעברו צפקת במשך 48 שעות. לאחר 18 שעות נוספות, תאי האקסודציה של הצפק, קשרי הלימפה המפשעתיים והטחול נאספו מהעכברים שקיבלו את הזריקות, עברו immunostaining, וזוהתה הכמות של המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow בכל אתר.

מיקרוסקופיה קונפוקלית

המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow הממוינים בודדו ונטענו עם 50 nm של דיו LysoTracker אדום במשך שעתיים בטמפרטורה של 37OC ב- RPMI. התאים קובעו עם 2% פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר והוכתמו עם Hoechst ונוגד-עכברים Ly-6G. הסליידים נשמרו בחושך ב- 4OC עד הניתוח. התמונות הקונפוקליות נאספו באמצעות חתכי-Z בעובי 1 μm. התמונות עברו עיבוד עם תוכנת Zeiss LSM Image Browser.

מספור הבליעה של PMN אפופטוטיים

תאי האקסודציה או המקרופאגים CD11bhigh ו- CD11blow הממוינים הוכתמו עם Hoechst, ומוספרו עם מיקרוסקופ פלורוסנטי. שני אזורים של שני cover slips, שכל אחד מהם מכיל לפחות 50 מקרופאגים (200 בסך הכול) עברו ניתוח, וחישבנו את המספר הממוצע של PMN שנבלעו בכל מקרופאג, יחד עם מספר המקרופאגים שעברו את רף הבליעה של PMN. בתאים הממוינים, ישויות F4/80+ Ly-6G+ (שזוהו בתור מקרופאגים המחוברים ל- PMN מבלי לבלוע אותם באופן מלא, באמצעות גרף פיזור) הוסרו מהדגימות כדי למנוע ספירה של PMN מחוברים.

תגובות ex vivo בתיווך TLR

המקרופאגים מהאקסודציה מוינו או הופרדו באמצעות חרוזים מגנטיים ועברו אינקובציה (1 x 106 תאים ב- 0.5 mL של תווך) עם LPS (0-1000 ng/mL), פולי (I:C) (4 μg/mL) או CpG-ODN (1 μm). לאחר 16 שעות, הסופרנטנטים נאספו ותכולת ה- TNF-α, IL-1β, IL-10, TGF-β, CCL2, CCL3 ו- CCL5 שלהם זוהתה בעזרת ELISA.

רגולציה של פנוטיפ המאקרופאגים באמצעות תאים אפופטוטיים ex vivo

תאי Jurkat עברו טיפול עם 1 μm של סטאורוספורין בכדי לגרום לאפופטוזיס ולאחר מכן נשטפו. המקרופאגים של הצפק או אוכלוסיות-המשנה הממוינות עברו אינקובציה עם ובלי תאי Jutkat אפופטוטיים (יחס של 1:5 מקרופאגים לתאים אפופטוטיים). בתחילת האינקובציה ולאחר 20 שעות, המקרופאגים עברו immunostaining עבור CD11b ונותחו על ידי FACS. לחלופין, תמציות חלבונים הוכנו מהמקרופאגים לאחר האינקובציה ועברו הרצה עם SDS-PAGE, ולאחר מכן בוצע ניתוח תספיג חלבון עבור CD11b, ארגינאז-1, 12/15-LO, אקטין וטובולין.

ניתוח סטטיסטי

ניסויי ex vivo ו- in vivo נערכו לפחות 3 פעמים ושוכפלו לפחות 4 פעמים. התוצאות עברו ניתוח שונות חד-כיווני (עבור מספר קבוצות) או מבחני-t (עבור השוואה בין 2 קבוצות) כאשר ערכי p של <0.05 נחשבים בתור מובהקות סטטיסטית. התוצאות מוצגות בתור ממוצעים ± SEM.