(23/04/2024) עלו היום לאתר 9 סמינריונים 2 תזות 2 מאמרים

לרכישה גלול למטה לסוף הדוגמית

Molecular fluorescence principles and applications

Key words: fluorescence, fluorophores, phosphorescent quantum yield, molecular structure, hydrocarbons, excitation spectra.  

Molecular fluorescence: principles and applications

פלורסנציה מולקולרית: עקרונות ויישומים

3.2.3

השפעת טמפרטורה

 באופן כללי, עלייה בטמפרטורה גורמת לירידה בתשואה קוונטית פלורסנטית ובזמן החיים, מכיוון שתהליכים לא-קרינתיים יותר יעילים בטמפרטורות גבוהות (התנגשות עם מולקולות תמיסה, וויברציות וסיבובים אינטרה-מולקולריים, ועוד). לרוב, ניסויים עומדים בהסכמה עם הווריאציה הלינארית:

ln(1/φF—1) versus 1/T.

כפי שהוזכר למעלה, ניתן להבחין בפוספורסנטיות תחת תנאים מסוימים בלבד, מכיוון ששלשת המצבים מבוטלים לגמרי על ידי התנגשויות עם מולקולות-תמיסה (או חמצן ולא-טהורים), מאחר וזמן החיים שלהם ארוך. ניתן להעלים את השפעות אלו על ידי תמיסה קפואה או מטריקס נוקשה (לדוגמה פולימר) בטמפרטורת החדר. העלאת התשואה הקוונטית הפוספורסנטית על ידי קירור יכולה להגיע עד לגורם של ³10, בעוד שגורם זה בדרך כלל לא יותר גבוה מפחות או יותר 10 עבור תשואה קוונטית פלורסנטית.

לסיכום, זמן חיים ותשואה קוונטית הם מאפיינים עיקריים בעלי חשיבות רבה. ברור מאליו כי ככל והתשואה הקוונטית הפלורסנטית גבוהה יותר, כך יותר קל להבחין בתרכובת פלורסנטית. יש להדגיש, שבשלב המעובה, פרמטרים רבים יכולים להשפיע על תשואות קוונטיות וזמני חיים: טמפרטורה, חומציות, קוטביות, צמיגות, קשירת מימן, נוכחות של מרווים, ועוד. יש לשים לב לאפשרות של פרשנות מוטעית היכולה לנבוע מהשפעות של כמה גורמים בו-זמנית (למשל, שינויים בצמיגות עקב ווריאציה בטמפרטורה).

3.3

פליטה וטווחי עירור  

3.3.1

אינטנסיביות פלורסנטית מצב-קבוע

טווחי פליטה ועירור נמדדים על ידי ספקטרופלורומטר (ראו פרק 6). מקור האור הוא מנורה הפולטת זרם פוטונים קבוע, כלומר כמות קבועה של פוטונים עבור יחידת זמן, בלי להתחשב באנרגיה שלהם. הבה נציין כ- No את הכמות הקבועה של מקרי הפוטונים הנקלטים, במהלך זמן נתון, ביחידת נפח של דגימה בה ריכוז הפלורופור הוא  [A] (No and [A] in mol L -1). αΝο מייצג את הפוטונים הנקלטים עבור יחידת נפח המעורבת בתהליך העירור –

(נוסחה)

הבה נזכור כי קבוע משוואת הקצב (pseudo-first order rate constant) עבור התהליך הזה גבוה מאוד (נוסחה) בעוד שהצעדים העוקבים להורדת העירור מתרחשים תחת קבוע קצב נמוך בהרבה (נוסחה), לפי

(נוסחה)  

תחת אילומינציה מתמשכת, הריכוז [1A*] נשאר קבוע, מה שאומר ש 1A* נמצא במצב קבוע. מדידות תחת תנאים אלו נקראות בהתאם, מדידות-מצב-קבוע.

קצב השינוי של [1A*] שווה לאפס:

(משוואה) (3.12)

KaαΝο מייצג את כמות הפוטונים הנקלטים עבור יחידת נפח ועבור יחידת זמן. ניתן לכתוב אותו מחדש כ αIo כאשר Iο מייצג את האינטנסיביות של מקרי האור (במולים של פוטונים/ליטר ו- /שנייה).

הריכוז הקבוע [1A*] ניתן על ידי

(משוואה) (3.12)

כמות הפוטונים הפלורסנטיים הנפלטת עבור יחידת זמן ועבור יחידת נפח, כלומר, אינטנסיביות פלורסנטית מצב-קבוע, ניתנת על ידי

(משוואה) (3.14)

ביטוי זה מראה שאינטנסיביות פלורסנטית מצב-קבוע עבור פוטון נקלט iF/αIo היא התשואה הקוונטית הפלורסנטית.

3.3.2

טווחי פליטה    

עד כה לקחנו בחשבון את כל סוגי הפוטונים הנפלטים, בלי להתחשב באנרגיה שלהם. כעת נתמקד בחלוקת האנרגיה של הפוטונים הנפלטים. מנקודת מבט זו, נוח לנו לבטא את האינטנסיביות הפלורסנטית מצב-קבוע עבור פוטון נקלט כפונקציה של אורך הגל של הפוטונים הנפלטים, שנסמן כ- Fλ(λF) dλF = ΦF, ושתספק את מערכת היחסים הבאה:

(משוואה) (3.15)

לפיה ΦF מייצג את התשואה הקוונטית המוגדרת למעלה. Fλ(λF) מייצג את טווח הפלורסנטיות או טווח הפליטה: הוא משקף את חלוקת ההסתברות של מעברים שונים בין רמת הוויברציה הנמוכה ביותר של S1 לרמות הוויברציה השונות של So. טווח הפליטה אופייני עבור תרכובת נתונה.

מעשית, אינטנסיביות פלורסנטית מצב-קבוע IF(λF) הנמדדת באורך גל λF (הנבחר על ידי מונוכרומטור עם אורך גל מסוים ΔλF) היא פרופורציונאלית ל- Fλ(λF) ולמספר הפוטונים הנקלטים באורך גל העירור λE  (נבחר על ידי מונוכרומטור). נוח להחליף את מספר הפוטונים הזה באינטנסיביות הקליטה ΙΑ(λE), המוגדרת כהבדל בין אינטנסיביות מקרה האור Io(λE) והאינטנסיביות של האור המוקרן IT(λE):

(משוואה) (3.16)

לפיכך אינטנסיביות פלורסנטית יכולה לקבל את הביטוי הבא—

(משוואה) (3.17)

גורם הפרופורציונאליות k תלוי בכמה פרמטרים, במיוחד בקונפיגורציה האופטית של התצפית (כלומר, הזווית הקונקרטית דרכה הכלי קולט פלורסנטיות, שלמעשה נפלטת לכל הכיוונים) וברוחב-הרצועה של המונוכרומטורים (כלומר, רוחב הכניסה והיציאה; ראו פרק 5).

בנוסף, ניתן לבטא את אינטנסיביות האור המוקרן על ידי חוק Beer-Lambert  (ראו פרק 2):

(משוואה) (3.18)

לפיה ε(λE) מציין את מקדם הספיגה המולרית (molar) של הפלורופור באורך-גל λE (ב L mol -1 cm -1); l מציין את הערוץ האופטי בדגימה (ב- cm); ו C מציין את הריכוז (ב- mol L-1). הכמות ε(λE)lc מייצגת את הספיגה A(λE)  באורך-גל λE.

טבלה 3.2 סטייה מליניאריות ביחס שבין אינטנסיביות פלורסנטית וריכוזים עבור ספיגות שונות  

ספיגה                                                         סטייה (%)

המשוואות (3.16) עד (3.18) מובילות ל-

(משוואה) (3.19(

מעשית, מדידות של הווריאציות ב- IF, כפונקציה של אורך-גל λF, עבור אורך-גל עירור קבוע λE, משקפות את הווריאציות ב Fλ(λF) ובכך מספקות את הטווח הפלורסנטי. מכיוון שבאופן כללי גורם הפרופורציונאליות k אינו ידוע, לערך המספרי של האינטנסיביות הנמדדת IF  אין משמעות, ובאופן כללי, ניתן לתת ביטוי ל IF  ביחידות אקראיות. במקרה של ריכוזים נמוכים, ניתן לעשות שימוש בהרחבה הבאה של משוואה (3.17):

(משוואה)

בתמיסות דלילות במיוחד, מונחים של סדר גבוה הופכים להיות זניחים. בשמירה על המונח הראשון בלבד, נוכל להשיג את:

(משוואה) (3.20)

יחס זה מראה שאינטנסיביות פלורסנטית היא פרופורציונאלית לריכוז אך ורק עבור ספיגות נמוכות. סטייה מהווריאציה הליניארית מתגברת ככל שהספיגה מתגברת (טבלה 3.2).

בנוסף, כאשר הריכוז של תרכובת פלורסנטית גבוה, השפעות סינון פנימי תלויות-תנאי-תצפית  מפחיתות את האינטנסיביות הפלורסנטית (ראו פרק 6). במיוחד, הפוטונים הנפלטים באורכי-גל המתאימים לחפיפה שבין טווחי הקליטה והפליטה יכולים להיספג מחדש (העברה קרינתית). כתוצאה מכך יש לשים לב שאינטנסיביות פלורסנטית היא פרופורציונאלית לריכוז אך ורק עבור תמיסות דלילות, וזאת כאשר נעשה שימוש בפלורומטריה להערכה כמותית של ריכוז של מין (species).

פלורומטריה היא טכניקה רגישה במיוחד—רגישה עד פי 1000 יותר מספקטרופוטומטריה. זאת מכיוון שאינטנסיביות פלורסנטית נמדדת ביחס לרמת רקע נמוכה; בעוד שבמדידה של ספיגות נמוכות, נעשית השוואה בין שני אותות גדולים השונים במקצת אחד מהשני. הודות לקדמה יוצאת מן הכלל בכל הנוגע לכלים הזמינים היום, במקרים מסוימים אפשר אפילו לזהות מולקולה פלורסנטית בודדה (ראו פרק 11).

במקרים מסוימים, ניתן לעשות שימוש בטווח פלורסנטי של תרכובת עבור זיהוי מינים, במיוחד כאשר הטווח מציג פסים וויברוניים (vibronic bands) (לדוגמא, במקרה של הידרוקרבון ארומטי); אבל, הטווחים של רוב הבדיקות הפלורסנטיות (בשלב המעובה) מציגים פסים רחבים.

המשוואות (3.15) עד (3.20) נכתבו באמצעות אורכי-גל, אבל ניתן היה לכתוב אותן גם באמצעות מספרי-גל. לדוגמא, האינטגרל במשוואה (3.15) נכתב בכמה ספרים (לדוגמא Birks, 1969, 1973) באמצעות מספרי-גל, במקום באמצעות אורכי-גל:

(משוואה) (3.21)

בה Fv(VF) מייצג את האינטנסיביות הפלורסנטית עבור יחידת מספר-גל.

יש להעיר כאן על ההשוואה התיאורטית בין משוואות (3.15) ו- (3.21). התשואה הקוונטית הפלורסנטית ΦF, כלומר מספר הפוטונים הנפלטים לאורך כל הטווח הפלורסנטי חלקי מספר הפוטונים הנקלטים, מוכרח להיות נבדל מהייצוג של הטווח הפלורסנטי בסולם אורך-הגל (משוואה 3.15) או בסולם מספר-הגל (משוואה 3.21):

(משוואה) (3.22)

ואולם, כפי שהראנו בקופסא 3.3., יש להדגיש כי Fλ(λF) אינו שווה ל Fv(VF), ויש לכך השלכות מעשיות.

מנקודת מבט תיאורטית ההשלכה החשובה של משוואה (3.22) היא, שהמרת האינטגרל מצורת מספר-גל לצורת אורך-גל מסתכמת בפשטות בהחלפת Fv(VF) ב- Fλ(λF), וdVF  ב- dλF. למרות זאת, מנקודת מבט מעשית, הכרחי שחישוב האינטגרל יעשה באמצעות צורת אורך-גל, מכיוון שכל הספקטרופלורומטרים מצוידים במונוכרומטורים מסורגים (grating). מכאן שהטווח הפלורסנטי נרשם על סולם אורך-גל לינארי בקבוע אורך-גל (constant wavelength bandpass) ΔλF (שהוא צעד האינטגרציה) (ראו קופסא 3.3).

3.3.3

טווחי עירור

הווריאציות באינטנסיביות הפלורסנטית כפונקציה של אורך-גל עירור λE עבור אורך-גל תצפית קבוע λF מייצג את טווח העירור. לפי משוואה (3.20), ווריאציות אלו משקפות את אבולוציית התוצר Io(λE)A(λΕ). אם ברצוננו לפצות על תלות אורך-הגל של מקרה האור (ראו פרק 6), המונח היחיד שעלינו לקחת בחשבון הוא A(λE), המייצג את טווח הספיגה. טווח העירור המתוקן הוא לפיכך זהה בצורתו לטווח הספיגה, בהינתן ויש מין יחיד במצב הבסיס. מנגד, כאשר מספר מינים, או כאשר מין יחיד, קיימים בצורות שונות במצב הבסיס (תלכידים, מכלולים, צורות טאוטומריות [tautomeric], ועוד), נמצא לעיתים תכופות שטווחי העירור והספיגה מספקים מידע שימושי.  

קופסא 3.3         קביעה של תשואות קוונטיות פלורסנטיות מטווחי פלורסנטיות: סולם אורך-גל או סולם מספר-גל?

תשואות קוונטיות פלורסנטיות נקבעות בדרך כלל על ידי שילוב של הטווח הפלורסנטי (ובעקבותיו נורמליזציה באמצעות סטנדרט של תשואה קוונטית פלורסנטית ידועה, על מנת להיפטר מהגורם הכלי k המופיע במשוואות 3.17 או 3.18; ראו פרק 6). מעשית, יש לשים לב לשיטת השילוב.

כאשר מונוכרומטור הפליטה של הספקטרופלורומטר מכוון לאורך-גל מסוים λF עם bandpass ΔλF, הקריאה פרופורציונאלית למספר הפוטונים הנפלטים בטווח אורך-הגל מ λF ל- λF + ΔλF, או בהתאמה, עם טווח מספר-הגל מ 1/λF ל- 1/(λF + ΔλF). מספר הפוטונים המזוהים מספק את מערכת היחסים הבאה:

(משוואה)

לפיה, ΔVF מוכרח להיות חיובי ולפיכך מוגדר כ 1/λF – 1/(λF + ΔλF). לכן,

(משוואה)

ובגלל ש- ΔλF << λF, המשוואה הזו הופכת להיות:

(משוואה)  

מה שמראה בבירור ש Fλ(λF)  לא שווה ל- Fv(vF).

אם עושים שימוש במונוכרומטור מסורג להקליט את הטווח הפלורסנטי, מסנן התדרים (bandpass) ΔλF הוא הקבוע, והסולם הוא של אורך-גל לינארי. לכן, לאחר תיקון הספקטרום (ראו פרק 6), על האינטגרל להיות מחושב באמצעות צורת אורך-הגל (משוואה 3.13). עובדים מסוימים ממירים את סולם אורך-הגל לסולם מספר-הגל לפני האינטגרציה, אבל תהליך זה הוא מוטעה. במקרים מסוימים, התוצאה יכולה להיות שחישוב התשואה הקוונטית בהשוואה לסטנדרט הפלורסנטי יהיה גדול מ1!

יש לציין שקושי זה אינו מופיע במקרה של אינטגרל טווח הספיגה, מכיוון שמקדם הספיגה פרופורציונאלי ללוגריתם של יחס העוצמות (intensity), כך ש ε (λ) = ε (v). למשל, בחישוב של עוצמת אוסילציה (הוגדרה בפרק 2), ניתן לבצע אינטגרציה או בסולם אורך-גל או בסולם מספר-גל.  

 3.3.4

היסט סטוקס (Stokes)

היסט סטוקס הוא המרווח בין מקסימום פס הספיגה הראשונה, ומקסימום הטווח הפלורסנטי (המקבל ביטוי במספרי-גל). (נוסחה) (תמונה 3.3).

הפרמטר החשוב הזה יכול לספק מידע על מצב העירור. למשל, כאשר רגע הדיפול של מולקולה פלורסנטית גבוה יותר במצב העירור מאשר במצב הבסיס, היסט סטוקס מתגבר עם קוטביות התמיסה. בפרק 7 נדון בהשלכות של דוגמא זו על הערכת הקוטביות באמצעות בדיקות קוטביות פלורסנטית.

מנקודת מבט מעשית, הזיהוי של מין פלורסנטי קל יותר כאשר היסט סטוקס גדול יותר.

3.4

ההשלכות של מבנה מולקולרי על פלורסנטיות    

3.4.1

היקף המערכת π-electron. טבע המעבר הנמוך-ביותר

רוב התרכובות הפלורסנטיות הן ארומטיות. יש מעט תרכובות אליפטיות רוויות שגם הן פלורסנטיות. באופן כללי, עלייה בהיקף מערכת הπ-electron (כלומר, רמת הנטייה) מובילה להיסט טווחי הספיגה והפלורסנטיות לאורכי-גל ארוכים יותר ועלייה בתשואה קוונטית פלורסנטית. כלל פשוט זה מתואר על ידי סדרה לינארית של הידרוקרבונים ארומטיים: נפתלין, אנתרסין, נפתסין ופנתסין פולטים פלורסנטיות באולטרה-סגול, כחול, ירוק ואדום, בהתאמה.

המעברים הנמוכים ביותר של הידרקרבונים ארומטיים הם מסוג π → π *, המאופיינים במקדמי ספיגה מולרית גבוהים, ובתשואה קוונטית פלורסנטית יחסית גבוהה. כאשר הטרו-אטום נמצא מעורב במערכת-π, המעבר π → π * עלול להיות המעבר הנמוך ביותר. מעברים כאלו מאופיינים במקדמי ספיגה מולרית קטנים ב- 10² לפחות מאלו של π → π *. לכן, לפי משוואת סטריקלר-ברג (סעיף 3.2.1), זמן חיי הקרינה τr  ארוך יותר בלפחות פי 100 מאשר זה של מעברי π → π *, כלומר בערך 10 בחזקת מינוס 6. תהליך איטי כזה לא יכול להתחרות בדומיננטיות של התהליך הלא-קרינתי; וזה מסביר את התשואות הקוונטיות הפלורסנטיות של מולקולות רבות בהן מצב העירור הנמוך ביותר הוא n—π*  בטבע. זה אכן מה שקורה אצל רוב תרכובות אזו (azo) ותרכובות נוספות המכילות קבוצות קרבוניל והטרוסייקלים של חנקן (עם חנקנים סוג-פירידין) (ראו סעיפים 3.4.2.3 ו- 3.4.3).

3.4.2

הידרוקרבונים ארומטיים מותמרים (substituents)

ההשפעה של מתמירים על מאפיינים פלורסנטיים של הידרוקרבונים ארומטיים היא מורכבת, ולכן יש לנקוט במשנה זהירות כאשר מבצעים הכללות. גם הטבע וגם המיקום של מתמיר יכולים לשנות את המאפיינים האלו.

3.4.2.1 השפעת אטום פנימי כבד  

באופן כללי, הנוכחות של אטומים כבדים בתחליפים של מולקולות ארומטיות (לדוגמא Br, Ι) מביא לרוויה פלורסנטית (השפעת אטום פנימי כבד) בגלל עליית ההסתברות של חצייה בין-מערכתית. למעשה, חצייה בין-מערכתית עומדת ביחסים טובים עם זיווג ספין-מסלול (spin-orbit). רמת היעילות של זיווג זה תלויה ב- Z בחזקת 4 (Z  הוא המספר האטומי). טבלה 3.3 מדגימה זאת היטב.

למרות זאת, השפעת האטום הכבד יכולה להיות קטנה עבור הידרוקרבונים ארומטיים מסוימים, בהינתן ו: (1) התשואה הקוונטית פלורסנטית גדולה, כך שדיכוי (de-excitation) על ידי פליטת פלורסנטיות שולטת בכל שאר תהליכי הדיכוי; (2) התשואה הקוונטית הפלורסנטית נמוכה מאוד כך שעלייה ביעילות חצייה בין-מערכתית היא קטנה יחסית; (3) אין מצב שלישוני הקרוב אנרגטית למצב פלורסנטי (לדוגמא פרילן, perylene).    

3.4.2.2 מתמירים תורמי-אלקטרונים: –OH, –OR, –NH2, –NHR, –NR2

באופן כללי, התמרה באמצעות קבוצות תורמות-אלקטרונים (electron-donating groups) גורמת לעלייה במקדם הספיגה המולרית ולהסטה גם בספיגה וגם בטווחים הפלורסנטיים. בנוסף, טווחים אלו רחבים ולעיתים תכופות חסרי מבנה בהשוואה למולקולת האם (parent), ההידרוקרבון הארומטי (לדוגמא 1- ו2-נפתול בהשוואה לנפתלין).

הנוכחות של זוגות ארוכים של אלקטרונים על אטומי החמצן והמימן לא משנה את טבע המעברים π—π* של מולקולת האם (parent). זוגות בודדים אלו אכן מעורבים ישירות בקשירת π עם המערכת הארומטית בניגוד לזוגות האלקטרונים הבודדים של מתמירי קרבוניל (ראו סעיף 3.4.2.3) או חנקן  הטרוציקלי (ראו סעיף 3.4.3). על מנת לעשות את ההבדלה בין שני סוגי הזוגות הבודדים, Kasha and Rawls הציעו להשתמש במונח ‘l orbital’ עבור מסלולי הזוג-הבודד של אמינים ופנולים ארומטיים. עבור אמינים ופנולים ארומטיים מישוריים (planar), צפוי מאפיין מעבר-מטען-אינטרה-מולקולרי משמעותי אצל המעברים הרלוונטיים; צפי זה מאושר על ידי העובדה שהטווחים הפלורסנטיים רחבים ומחוסרי מבנה.

אם בגלל סיבות סטריות (steric) קבוצת ה –NH2 מקבלת פיתול אל מחוץ למישור הטבעת הארומטית, רמת ההטיה של המסלול 1 פוחתת, אבל המעברים התואמים את קידומו של אלקטרון ממסלול 1 למסלול π* עדיין שונים (במיוחד, יותר עוצמתיים) ממעברי n → π* המערבים את הזוגות הבודדים של קבוצת קרבוניל או ניטרו. הביטוי לסטייה מהמישוריות המשותפת (coplanarity) עם הטבעת הארומטית נעשה גם בעזרת מתמירי –OR, בעוד שקבוצת –OH הינה כמעט בעלת מישוריות משותפת.

מאפייני הספיגה והפליטה של אמינים פנולים וארומטיים הם תלויי pH. נדון בהיבטים אלו בסעיף 4.5.

3.4.2.3 מתמירים נוטלי-אלקטרונים: תרכובות קרבוניל וניטרו

המאפיינים הפלורסנטיים של תרכובות קרבוניל ארומטיות מורכבים ולעיתים קרובות קשים לחזות.

אלדהיידים וקטונים ארומטיים רבים (לדוגמא בנזופנון, אנתרון, 1- ו2- נפתלדהייד) הם בעלי מצב עירור נמוך n—π* ולפיכך מציגים תשואות קוונטיות פלורסנטיות נמוכות, כפי שהוסבר לעיל. ערוץ הדיכוי הדומיננטי הוא חצייה בין-מערכתית (אשר נמצא כי היעילות שלו קרובה ל 1 עבור בנזופנון).

תרכובות קרבוניל ארומטיות מסוימות הן בעלות מצב עירור נמוך π—π* ולפיכך בעלות תשואה קוונטית הגיונית (לדוגמא 0.12 עבור פלורנון אצל אתנול ב- 77 K ו0.01 בטמפרטורת החדר). למרות זאת, אם האנרגיה של מצב  n—π*  גבוהה רק במעט, התשואה הקוונטית הפלורסנטית תלויה משמעותית בקוטביות התמיסה (השפעת קרבה). למעשה, בתמיסות מסוימות, האנרגיה של מצב ה n—π*  מוסטת לאנרגיה גבוהה יותר, בעוד שזו של מצב ה π—π* מוסטת לאנרגיה נמוכה יותר. לכן, ניתן להבחין בפלורסנטיות עוצמתית בתמיסות קוטביות ובפלורסנטיות חלשה בתמיסות לא קוטביות (לדוגמא קזנטון).

כאשר למולקולה ארומטית יש קבוצה קרבוקסילית כמתמיר, ניתן להבחין בהשפעות פוטו-פיזיות עקב שינויי קונפורמציה. למשל, כאשר חומצת אנתרסין-9-קרבוקסילית מציגה טווח פלורסנטי רחב, משולל כל פסים וויברוניים   נראים, בניגוד לטווח הספיגה שלה, ובניגוד לטווחי הספיגה והפלורסנטיות של הבסיס המוטה (בדומה לטוח האנתרסין). ניתן להסביר את ההבדל הזה בטווחי פלורסנטיות של צורות בסיסיות-חומציות במונחים של קונפורמציה בין קבוצת הקרבוקסיל  –COO—, אשר עומדת ביחס של זווית ישרה לטבעת, כך שההפרעה למערכת π של טבעת האנתרסין זניחה. מנגד, הקבוצה הקרבוקסילית –COOH  עשויה להיות בעמדה קרובה למישוריות המשותפת של הטבעת; האינטראקציה הנובעת מכך גורמת למאפיין מעבר-מטען אינטרה-מולקולרי למעבר ה π—π*. פסי מטען-מעבר פלורסנטיים אכן לעיתים תכופות רחבים ומחוסרי מבנה. למרות זאת, מכיוון שטווח הספיגה של הצורה החומצתית מציג פסים וויברוניים, הגיוני שהרוטציה של ה –COOH  תיגרם כתוצאה ממעבר אלקטרונים (photoinduced).

באופן כללי, הפלורסנטיות של הידרוקרבונים ארומטיים המחזיקים במתמיר –NO2 לא ניתנת לזיהוי. קיומו של מעבר π—π* ברמה-נמוכה מסביר את יעילות תהליך החצייה הבין-מערכתית (לדוגמא, עבור 2-ניתרונפתלין, התשואה הקוונטית עבור חצייה בין-מערכתית היא 0.83 אצל תמיסת בנזן בטמפרטורת החדר). ניטרוארומטיים רבים הם אכן פוספורסנטיים. ולמרות זאת, במקרים מסוימים, התשואה הקוונטית עבור חצייה בין-מערכתית היא, באופן משמעותי, פחות מ- 1. לכן, היעדר זיהוי פלורסנטיות עשוי להיגרם עקב שיעור גבוה של המרה פנימית S1 → S0, מה שעשוי גם להיות קשור למאפיין מטען-מעבר משמעותי של מצב העירור; וזאת, כתוצאה מחוזק כוח נטילת-האלקטרון של קבוצת ה –NO2.

יש לציין שניטרוארומטיים רבים עוברים פוטודגרדציה (photodegradation). למשל, 9-ניתרואנתרסין הופך לאנתרקינון בעת אילומינציה.

3.4.2.4 סלפונטים

מסיסות במים של פלורופורים רבים ניתנת להשגה על ידי השתלת קבוצות סלפונט. למרבה המזל, קבוצות אלו משפיעות רק במעט על המאפיינים הפלורסנטיים של מולקולת האם (parent). באופן כללי, במקרה זה ישנה הסטה קלה לאדום בטווח הפלורסנטי, המבנה הוויבראציונלי מטושטש, והתשואה הקוונטית הפלורסנטית פוחתת.

לבסוף, יש להדגיש שקשה לחזות את המאפיינים הפלורסנטיים של הידרוקרבונים ארומטיים המכילים יותר ממתמיר אחד. לא ניתן לעשות אקסטרפולציה פשוטה להשלכות אלו על בסיס מתמירים אינדיבידואליים. למשל, למרות הנוכחות של קבוצת ניטרו, o- ו m-ניטרואנילין ו3-ניטרו-N, N-דימתילנילין מציגים פלורסנטיות.

3.4.3

תרכובות הטרוציקליות

תרכובות הנקראות אזרנים (azarenes) המכילות אטום אחד או יותר של חנקן הטרוציקלי (כמו פירידין, קווינולין, אקרידין) הן בעלות מעברי π—π* נמוכים, מה שמסביר את הערך הנמוך של התשואות הקוונטיות הפלורסנטיות שלהן אצל הידרוקרבונים.

למרות זאת, המאפיינים הפלורסנטיים של תרכובות אלו תלויי-תמיסה. בממיסים פרוטים (protic) כמו אלכוהול, קשרי מימן יכולים להיווצר בין אטומי חנקן ומולקולות התמיסה. דבר זה גורם להיפוך של מצבי  ה n—π* וה- π—π* הנמוכים-ביותר. בעוד שהמעבר הנמוך-ביותר הופך להיות בעל המאפיין π—π* בתמיסות אלו, התשואה הקוונטית הפלורסנטית גבוהה בהרבה מאשר בתמיסות הידרוקרבון.

יש לציין כי דחיסות האלקטרונים באטום החנקן מופחתת בזמן העירור, כך שהיכולת ליצור קשרי מימן נמוכה יותר במצב זה. מצב הבסיס הוא לפיכך יציב יותר בקשרי מימן מאשר במצב העירור. התוצאה היא היסט-אדום של הטווחים כאשר זזים בין תמיסות לא-קוטביות לתמיסות המוסרות קשרי מימן.

בכמה תרכובות הטרוציקליות כמו אקרידין, קשה להבדיל בין פס הספיגה n—π* לבין פסי הספיגה היותר עוצמתיים π—π*.

ניתן להשיג הרבה נגזרות מעניינות של קווינולין ואקרידין על ידי התמרה. במיוחד, 8-הידרוקסיקווינולין (אוקסין) הוא הסוכן המורכב השני בחשיבותו לאחר EDTA. סלפונציה בעמדה 5 מובילה לתרכובת ניתנת להמסה במים המציגה תכונות פלורוגניות יוצאות מן הכלל (כלומר העצמת פלורסנטיות) בעת הרכבה עם יונים מתכתיים (לדוגמא אלומיניום).

כאשר הטרו-חנקן נקשר באופן פרטני לאטומי פחמן בהטרוציקל, כמו בטבעות פירול (pyrrole) (למשל אינדול, קרבזול), למעברים המערבים אלקטרונים לא-קושרים יש תכונות דומות לאלו של מעברי π—π*. למעשה, המסלול הלא-נקשר עומד ביחס של זווית ישרה למישור הטבעת, מה שמאפשר לו לחפוף את מסלולי ה-π  אצל אטומי הפחמן השכנים. בדרך זו ניתן להסביר את התשואה הקוונטית הפלורסנטית הגבוהה יחסית של קרבזול ואינדול. טריטופן הוא נגזרת חשובה של אינדול, והתכונות הפוטופיזיות שלה נלמדו רבות בגלל החשיבות שלה במחקרים פלורסנטיים על חלבונים.

התכונות של ההטרוציקלים הנקשרים המכילים חמצן וגופרית (למשל דיבנזפורן, דיבנזותיופן) יכולות לקבל פירוש דומה.

הרבה פלורורים בהם נעשה שימוש מעשי הם הטרוציקליים: קומרינים, רודמינים, פירונינים, פלורסינים, אוקסזינים, ועוד. נציג כעת מספר דוגמאות.

לקומרין לבדו יש תשואה קוונטית נמוכה, אבל התמרה נכונה מובילה לתרכובות פלורסנטיות הפולטות באזור הכחול-ירוק (400-550 nm). התמרה בעמדה 4 על ידי קבוצת מתיל מובילה לאומבליפרון. 7-הידרוקסיקומרינים רגישים במיוחד ל pH. לדוגמא, 4ניתן לעשות שימוש במתיל-7-הידרוקסיקומרין (4-מתילאומבליפרון) כפלורסנט בדיקת pH (ראו פרק 10).

7-אמינוקומרינים מעניינים במיוחד מכיוון שהם מחזיקים בקבוצה תורמת-אלקטרון (קבוצת אמינו) המוטה לעבר קבוצה לוקחת—אלקטרון (קבוצת קרבוניל). יוצא מכך מעבר מטען נגרם-אור (photoinduced) (ראו סעיף 3.4.4). אמינוקווינוקסלינונים ואמינובנזוקסזינונים מציגים תכונות דומות.

שני הסוגים הידועים של צבעים פלורסנטיים במיוחד, רודמינים ופלורסינים, הם נגזרות של קסנטין.

רודמינים (למשל רודמין 6G, רודמין B) היו מבין הראשונים בהם נעשה שימוש בצבע פלורסנטי באמצעות לייזר. בניגוד לקומרינים, טווחי הספיגה והפליטה שלהם דיי צרים והסט סטרוקס קטן. הם פולטים פלורסנטיות בטווח של 500-700 nm.

ראוי לציין שקבוצת קרבוקסיפניל של רודמינים מעורבת רק מעט בהטיה של מערכת האלקטרון π מכיוון שהיא כמעט ועומדת בזווית ישרה לטבעת הקסנתנית מסיבות סטריות (steric). לפיכך, החלפה של קבוצה זו על ידי אטום מימן לא אמורה להשפיע בצורה משמעותית על התכונות הפוטו-פיזיקליות. למעשה, התרכובות הנוצרות, הנקראות פירונינים, מציגות תכונות כמעט זהות לאלו של רודמינים תואמים: טווחי הספיגה והפליטה שלהם מוסטים ב 1-3 nm ביחס לרודמינים, והיסט סטוקס קטן במעט.

המשפחה השנייה של צבעי קסנטין היא פלורוסינים והנגזרות שלהם. הפלורוסין עצמו הוא תמיסת אלכוהול עם רמת פלורסנטיות נמוכה. מנגד לה, מלח האלקלי המושג על ידי הוספת אלקלי מציג את המאפיין הפלורסנטי הצהוב-ירוק הידוע של הפלורוסין דיאניון (אורנין). פלורסין והנגזרות שלו כמו אאוסין Y ןאריתרוסין Y ידועים להיות רגישים במיוחד ל pH ולפיכך יכולים לשמש לבדיקות pH  פלורסנטי (ראו פרק 10).

בפירונינים, החלפת אטום הפחמן של הטבעת המרכזית (מנגד לאטום המימן) באטום חנקן מייצרת צבעי אוקסזין, בהם עושים שימוש כצבעי לייזר הפולטים בטווח של 600-750nm .

3.4.

תרכובות העוברות העברת מטען אינטרה-מולקולרית (ICT) ורוטציה פנימית כתוצאה מחשיפה לאור (photoinduced)          

עירור של פלורופור גורם לתנועה של אלקטרון ממסלול אחד לאחר. אם המסלול הראשון והאחרון נפרדים במרחב, המעבר האלקטרומגנטי מלווה בשינוי כמעט מידי ברגע הדיפול של הפלורופור. כאשר הפלורופור מחזיק בקבוצה תורמת-אלקטרון (לדוגמא, C = O, –CN >), העלייה ברגע הדיפול יכולה להיות משמעותית. כתוצאה מכך, מצב העירור אליו מגיעים בעת העירור (הנקרא מצב פרנק-קונדון או מצב עירור מקומי, LE) לא נמצא באיזון עם מולקולות התמיסה שמסביב, כל עוד הן קוטביות. במדיום נוזלי מספיק, מולקולות התמיסה מסתובבות במהלך זמן-החיים של מצב העירור עד שקליפת הסולבציה (solvation) מגיעה לאיזון תרמו-דינמי עם הפלורופור. כך מושג באופן רגוע מצב-מעבר-מטען-אינטרה-מולקולרי (ICT).  

רגיעת תמיסה זו (solvent relaxation) מסבירה את העלייה בהיסט-האדום של הטווח הפלורסנטי ככל והקוטביות של התמיסה גוברת. נדון בהשפעה של קוטביות על פליטה פלורסנטית בפרק 7, יחד עם בדיקות קוטביות. בנוסף, כאשר קולטן קטיון נקשר למעבר מטען אינטרה-מולקולרי פלורופורי, כך שהקטיון הקשור יכול להיות להגיב או עם הקבוצה התורמת או עם הקבוצה המקבלת, ה-ICT מופרע; ניתן לעשות שימוש בשינויים הנובעים בתכונות הפוטופיזיות של הפלורופור על מנת לזהות קטיונים (ראו סעיף 10.3.3).    

רגיעה לעבר מצב ICT עשויה להיות מלווה על ידי רוטציה פנימית בתוך הפלורופור. הדוגמא העיקרית והמעניינת ביותר היא 4-N,N-dimethylaminobenzonitritile (DMABN).

המולקולה הזו הייתה מושא למחקרים רבים מכיוון שהיא מציגה פלורסנטיות דואלית בתמיסות קוטביות, וזאת למרות הפשטות שלה. ניתן להסביר את התופעה המסקרנת הזו באופן הבא (Lippert et al. 1987). במצב הבסיס, המולקולה כמעט מישורית, מה שתואם את ההטיה המקסימלית בין קבוצת הדימתילאמינו וטבעת הפניל. לפי עיקרון פרנק-קונדון, מצב העירור המקומי (LE) עדיין מישורי, אולם רגיעת תמיסה מתרחשת יחד עם רוטציה בקבוצת הדימתילאמינו עד שהיא מתפתלת בזוויות ישרות וההטיה נעלמת. במצב ה- TICT הנובע מכך (מעבר מטען אינטרה-מולקולרי מפותל), אשר מיוצב על ידי מולקולות התמיסה הקוטבית, ישנה הפרדה בסך כל המטען בין קבוצת הדימתילאמינו ומחצית הסיאנופניל (סכמה 3.3).

בנוסף לפס הפלורסנטי שהוא תוצאה של פליטה ממצב ה-LE (פס ‘נורמלי’), ניתן להבחין בפס פליטה התואם את הפליטה ממצב ה TICT באורכי-גל גבוהים יותר (פס ‘אנומלי’) (תמונה 3.4).

ניתן להדגים את הנחת הפיתול על ידי השוואה בין מאפיינים פלורסנטיים של תרכובות 2 ו- 3 במודל הגשר וה- DMABN (1) בתמיסה קוטבית: לא יתכן פיתול בתרכובת 2, וניתן להבחין בפלורסנטיות LE בלבד; התרכובת המפותלת 3 מציגה רק את הפס הפלורסנטי TICT. בניגוד לכך, DMBAN מראה פלורסנטיות גם של LE וגם של TICT.

רוטציה פנימית, המלווה או לא מלווה רגיעת-תמיסה, יכולה להתרחש אצל פלורופורים רבים,  אבל פלורסנטיות דואלית ופיתול זווית ישרה (הדרושים עבור הפרדת מטען מלאה) הם יוצאים מן הכלל. במקרים רבים נעשות פניות (לעיתים אפילו פוגעניות!) אל הסמכות של מצבי TICT (פלורסנטי או לא) על מנת לפרש את התכונות הפוטופיזיות של פלורופורים; במיוחד אלו המחזיקים במחצית אנילינו. כאשר יש מספר אפשרויות לרוטציה פנימית, במולקולה שעברה עירור, הפירוש של התכונות הפוטופיזיות נעשה קשה. למשל, במקרה של DCM (מרוסיאנין ידוע ושכיח בשימוש כצבע לייזר), ישנה אפשרות למספר רוטציות על קשרים יחידים. בנוסף, פוטואיזומריזציה (פיתול על הקשר הכפול) יכולה להתרחש; תהליך זה הוא ערוץ הדיכוי העיקרי אצל תמיסות לא-קוטביות, אבל הוא יעיל במיוחד בתמיסות קוטביות בהן מצב ה ICT יציב. ICT יעיל מאוד יכול בהחלט לקרות בין קבוצת דימטלאמינו לקבוצת דיסיאנומתילן, כפי שניתן לראות על ידי רגע הדיפול ב- DCM אשר גבוה הרבה יותר במצב העירור מאשר במצב הבסיס (ההבדל הוא בערך 20 D). סטילבנים תורמים/מקבלים כמו DCS מציגים התנהגות דומה.

מעבר-מטען-אינטרה-מולקולרי ורוטציה פנימית יכולים גם להתרחש במולקולות לא-קוטביות ומאוד סימטריות. דוגמא בולטת לכך היא 9,9’-bianthryl. תרכובת זו למעשה מציגה פלורסנטיות דואלית, והפס הממוקם באורכי-גל גבוהים יותר מציג הסט-אדום גדול יותר ככל שקוטביות התמיסה גוברת, מה שמצביע על מאפיין דיפולרי גבוה (מצב TICT). לפיכך, הסימטריה הגבוהה של ביאנטריל נשברת כאשר נוצר מצב העברת המטען.

צבעי טריפנילמתאן כמו ירוק malachite הם צבעים ציאנינים (cyanine) המחזיקים במבני תהודה שווים יחד עם אטום חנקן טעון ולא-טעון. כתוצאה מכך, הם סימטריים ביחס לחלוקת המטען. לצבעים אלו יש פוטופיזיקה מורכבת. התשואות והדעיכות הקוונטיות הפלורסנטיות שלהם רגישות מאוד לצמיגות התמיסה, מה שניתן להסביר באמצעות הדיפוזיה הסיבובית של טבעות הפניל המתרחשת לצד פוטנציאל חסר-מחסום, עם קצב דעיכה לא-קרינתית, התלוי בזווית הפיתול. לפיכך, התשואה הקוונטית הפלורסנטית תלויה בצמיגות התמיסה, אבל הרוטציות הפנימיות לא משקפות את הצמיגות המקרוסקופית של התמיסה, עקב חשיבות השפעות הנפח החופשי. נדון בנקודה זו בפרק 8.

צבע הדיפנילמתאן המוחלף, אורמין O, פולט פלורסנטיות חלשה בתמיסות נוזליות, אבל זו הופכת לחזקה במדיומים צמיגיים או קשיחים. במקור, נעשה בו שימוש על מנת לבדוק את הצמיגות של דגימות פולימרים צמיגיים. ניתן להסביר תלות כה חזקה בצמיגות התמיסה באותו האופן בו הסברנו את צבעי הטריפנילמתאן.

ככלל, רוטציות פנימיות מספקות ערוצים נוספים עבור דיכוי לא-קרינתי. גישור מבנה הטריפנילמתאן עם אטום חמצן מפחית את האפשרות של רוטציה פנימית. התרכובות הנוצרות כתוצאה מכך הן רודמינים עם תשואות קוונטיות פלורסנטיות גבוהות הרבה יותר. ניתן להפחית עוד יותר את הרוטציה פנימית באמצעות הכללת אטומי חנקן בטבעת יולודיל, לדוגמא אצל רודמין 101. יוצא מכך כי התשואה הקוונטית הפלורסנטית של רודמין 101 גבוהה יותר (0.92 באתנול) מזו של רודמין B (0.54 באתנול). בנוסף, בניגוד לרודמין B, התשואה הקוונטית הפלורסנטית של רודמין 101 כמעט ולא-תלויה בטמפרטורה ולכן היא מועדפת לספירה קוונטית בספקטרופלורומטרים.            

Key words: fluorescence, fluorophores, phosphorescent quantum yield, molecular structure, hydrocarbons, excitation spectra.  

Molecular fluorescence: principles and applications

פלורסנציה מולקולרית: עקרונות ויישומים

3.2.3

השפעת טמפרטורה

 באופן כללי, עלייה בטמפרטורה גורמת לירידה בתשואה קוונטית פלורסנטית ובזמן החיים, מכיוון שתהליכים לא-קרינתיים יותר יעילים בטמפרטורות גבוהות (התנגשות עם מולקולות תמיסה, וויברציות וסיבובים אינטרה-מולקולריים, ועוד). לרוב, ניסויים עומדים בהסכמה עם הווריאציה הלינארית:

ln(1/φF—1) versus 1/T.

כפי שהוזכר למעלה, ניתן להבחין בפוספורסנטיות תחת תנאים מסוימים בלבד, מכיוון ששלשת המצבים מבוטלים לגמרי על ידי התנגשויות עם מולקולות-תמיסה (או חמצן ולא-טהורים), מאחר וזמן החיים שלהם ארוך. ניתן להעלים את השפעות אלו על ידי תמיסה קפואה או מטריקס נוקשה (לדוגמה פולימר) בטמפרטורת החדר. העלאת התשואה הקוונטית הפוספורסנטית על ידי קירור יכולה להגיע עד לגורם של ³10, בעוד שגורם זה בדרך כלל לא יותר גבוה מפחות או יותר 10 עבור תשואה קוונטית פלורסנטית.

לסיכום, זמן חיים ותשואה קוונטית הם מאפיינים עיקריים בעלי חשיבות רבה. ברור מאליו כי ככל והתשואה הקוונטית הפלורסנטית גבוהה יותר, כך יותר קל להבחין בתרכובת פלורסנטית. יש להדגיש, שבשלב המעובה, פרמטרים רבים יכולים להשפיע על תשואות קוונטיות וזמני חיים: טמפרטורה, חומציות, קוטביות, צמיגות, קשירת מימן, נוכחות של מרווים, ועוד. יש לשים לב לאפשרות של פרשנות מוטעית היכולה לנבוע מהשפעות של כמה גורמים בו-זמנית (למשל, שינויים בצמיגות עקב ווריאציה בטמפרטורה).

3.3

פליטה וטווחי עירור  

3.3.1

אינטנסיביות פלורסנטית מצב-קבוע

טווחי פליטה ועירור נמדדים על ידי ספקטרופלורומטר (ראו פרק 6). מקור האור הוא מנורה הפולטת זרם פוטונים קבוע, כלומר כמות קבועה של פוטונים עבור יחידת זמן, בלי להתחשב באנרגיה שלהם. הבה נציין כ- No את הכמות הקבועה של מקרי הפוטונים הנקלטים, במהלך זמן נתון, ביחידת נפח של דגימה בה ריכוז הפלורופור הוא  [A] (No and [A] in mol L -1). αΝο מייצג את הפוטונים הנקלטים עבור יחידת נפח המעורבת בתהליך העירור –

(נוסחה)

הבה נזכור כי קבוע משוואת הקצב (pseudo-first order rate constant)...

295.00 

מק"ט 4b8b8b04e7d4 קטגוריה
מק"ט 4b8b8b04e7d4 קטגוריה

295.00 

סיוע בכתיבת עבודה מקורית ללא סיכונים מיותרים!

כנסו עכשיו! הצטרפו לאלפי סטודנטים מרוצים. מצד אחד עבודה מקורית שלכם ללא שום סיכון ומצד שני הקלה משמעותית בנטל.