The Ly6-uPAR protein Bouncer is necessary and sufficient for species-specific fertilization

החלבון Ly6/uPAR “באונסר” הינו הכרחי ומספיק להפרייה תלוית-מין

שרה הרברג, כריסטה ר. גרט, אלכסנדר שלייפר ואנדריאה פאולי

תמצית

הפרייה היא מרכיב בסיסי ברבייה זוויגית, אך המנגנונים המולקולריים שלה אינם מובנים כהלכה. מצאנו כי החלבון Ly6/uPAR המבוטא באואוציטים, אותו אנו מכנים “באונסר”, הינו גורם חיוני להפרייה בדגי זברה. באונסר הצמוד לממברנה מסייע לקישור בין הזרע לביצית, ולכן הוא חיוני לכניסת זרע אל תוך הביצית. באופן ייחודי, באונסר אינו רק דרוש לאינטראקציית זרע-ביצית אלא גם מספיק על מנת לאפשר הפרייה בין-מינית בין דגי זברה לדגי מדאקה, שני מינים שהתפצלו לפני יותר מ-200 מיליון שנה. מחקרנו מזהה אפוא את באונסר כגורם מכריע בהפרייה תלוית-מין בדגים. החלבון ההומולוגי הקרוב ביותר לבאונסר בבעלי ארבע רגליים, SPACA4, מוגבל למטען התורשתי הזכרי בהפרייה פנימית בחולייתנים, מה שמעלה אפשרות כי הממצאים שלנו בדגים הינם רלוונטיים גם לביולוגיה אנושית.

מבוא, תוצאות ודיון

הפרייה, אשר במסגרתה שתי גמטות מתמזגות ליצירת זיגוטה חד-תאית באורגניזמים עם רבייה זוויגית, היא יעילה במיוחד אך תלוית-מין. אסטרטגיה זו מבטיחה רבייה מוצלחת ואת הישרדותם של מינים נפרדים. עם זאת, האמצעים איתם הטבע ממלא את הדרישות הסותרות לכאורה האלו, במיוחד ברמה המולקולרית, נותרו בגדר מסתורין. עד כה, החלבונים היחידים בחולייתנים אשר ידועים כחיוניים לקישור זרע-ביצית הם IZUMO1 המבוטא בזרע וחלבוני JUNO ו-CD9 בממברנה של הביצית. קישור בין IZUMO1 ו-JUNO מסייע להיצמדות הזרע לביצית ביונקים, בעוד תפקידו של CD9 בתהליך זה אינו ברור. למרות שתבחיני קישור אין ויטרו מראים כי IZUMO1 אנושי מתקשר ביעילות רבה יותר ל-JUNO אנושי מאשר JUNO של עכבר, טרם זוהתה פונקציה אין ויוו של סיוע בהבדלה המינית עבור אף אחד מגורמים אלה.

על מנת לזהות גורמים הכרחיים להפרייה בחולייתנים, בדקנו את האוסף של גנים מקודדי חלבונים צפויים המבוטאים באואוציטים ו/או אשכים בדגי זברה. גן אחד בעל אקסון יחיד בלט בשל ביטויו הגבוה באואוציטים של דגי זברה (תרשים 1A) ונוכחותם של רצפים הומולוגיים בחולייתנים אחרים. על בסיס פנוטיפ אובדן התפקוד שלו (ראו להלן), כינינו גן זה בשם באונסר (bncr) בהשראת השם המקובל של שומר בכניסה לבר. למרות שאין כל אנוטציה גנטית של באונסר בגנום העדכני ביותר של דגי זברה (GRCz11), מצאנו בניתוחים של ריצוף RNA (RNA-seq) והכלאה אין סיטו (תרשימים S1A, B), מידע על פרופילים של ריבוזומים, וניתוח אתר התחלתי של שעתוק המבוסס על CAGE (cap analysis gene expression) כי באונסר הוא תעתיק אימהי המייצר חלבון בוגר של 80 חומצות אמינו המעוגן על ידי גליקוסילפוספטידילינוסיטול (GPI) (תרשים 1A). בהתאם לשני אתרים צפויים של גליקוזילציית-N (תרשים 1A), נוגדן ספציפי לבאונסר זיהה באונסר שעבר גליקוזילציה בביצית (תרשים 1B).

חיפוש מתחם חלבון סיווג את באונסר כחברת במשפחת-העל של חלבוני Ly6/uPAR (קולטן מפעיל פלסמינוגן מסוג Ly6/אורוקינאז), הכוללת מגוון חלבונים כגון רעלנים, אימונורגולטורים, וקולטני פני התא. משפחת חלבונים זו מאופיינת על ידי מתחם של 60 עד 80 חומצות אמינו הכולל שמונה עד עשרה ציסטאינים מרוכזים היוצרים מבנה בצורת שלוש אצבעות (תרשימים 1A, C; S2A). מלבד ציסטאינים אלו, חומצות אמינו אחרות הן שונות ביותר בין החלבונים ממשפחת-העל הזו (תרשימים 1C; S2A, B). חיפושי BLASTP עם באונסר של דגי זברה וניתוחי רצף פילוגנטי העלו אפשרות כי SPACA4 הוא החלבון ההומולוגי הקרוב ביותר ביונקים, זוחלים ודו-חיים (תרשימים 1C; S2A-C; S1, 2 וטבלה S1). בבני אדם, SPACA4/SAMP14 (חלבון אקרוזום הזרע המקושר לממברנה 4/חלבון ממברנה של אקרוזום הזרע 14) זוהה לראשונה במחקר פרוטאומיקה כחלבון של אקרוזום הזרע, ובניסויים אין ויטרו רמז על תפקוד אפשרי בהפרייה. עם זאת, הפונקציה והחשיבות של SPACA4 אין ויוו אינן ידועות.

מתוך סקרנות לגבי הגילוי כי באונסר בדגי זברה מתבטא באואוציטים, וכי ההומולוג הקרוב ביותר שלו בבני אדם מדווח בזרע, ניתחנו את דפוסי הביטוי של הומולוגים אחרים של באונסר/SPACA4. מצאנו כי חולייתנים עם הפרייה חיצונית (כגון דגים ודו-חיים) מפגינים ביטוי המוגבל לאואוציטים, בעוד שכל החולייתנים עם הפרייה פנימית שנותחו (כגון זוחלים ויונקים) מפגינים ביטוי ייחודי לאשכים (תרשימים 1C; S2A). יחדיו, תוצאות אלו זיהו את באונסר ו- SPACA4 כהומולוגים עם דפוסי ביטוי תלויי-זוויג מנוגדים בחולייתנים עם הפרייה חיצונית מול אלו עם הפרייה פנימית.

על מנת לחקור את הפונקציה של באונסר, השתמשנו ב- CRISPR/Cas9כדי לייצר דגי זברה עם באונסר מושתק. עיצבנו קו מוטנטי יציב עם אלל של באונסר הנושא מחיקה של 13 נוקלאוטידים, אשר מבטלת את הפקתו של חלבון באונסר בוגר (תרשימים 1B, S3A). זיווג של זכרים ונקבות בעלי קרבה משפחתית, שהינם הטרוזיגוטיים עבור באונסר (bncr+/-), יצר בוגרים הומוזיגוטיים מוטנטיים (bncr-/-) ביחס מנדליאני של 25%~, מה שמעלה אפשרות כי באונסר אינו הכרחי להתפתחות. עם זאת, ניסויי זיווג אין ויוו הראו כי רק שבע מתוך 3024 ביציות (0.11%) של נקבות הומוזיגוטיות התפתחו לכדי עוברים בשלב ההתפצלות, בניגוד למרבית הביציות מנקבות הטרוזיגוטיות או מזן הבר, או מנקבות מזן הבר שהופרו על ידי זכרים הומוזיגוטיים (תרשימים 1D, E; S3A, B). יש לציין כי מצב של כמעט עקרות בקרב נקבות נמנע באמצעות ביטוי נרחב של באונסר טרנסגני בלתי-מתויג, או המתויג על ידי חלבון ירוק זרחני (GFP) (תרשימים 1D, E; S3A, C), מה שמאשר כי הפגם שהובחן אכן נוצר בשל היעדר חלבון באונסר. ביטוי נרחב של מוטנט של באונסר שלא יכול לעבור גליקוזילציה (GFP-BncrN32A,N84A; תרשימים S3A, D) מנע גם הוא מצב של כמעט עקרות בנקבות (תרשים 1E); ממצא זה מדגים כי גליקוזילציה של באונסר אינה תורמת לתפקודו. לכן, חלבון באונסר המבוטא באואוציטים הינו הכרחי לרבייה יעילה בדגי זברה.

ביציות של דגי זברה מופעלות במגע עם מצע השרצה, באופן עצמאי מנוכחותם של זרעים. לא ניכרה השפעה על הפעלת ביציות בנקבות bncr-/-, כפי שניתן היה לראות בהרמה רגילה של הכוריון (מעטפת המגן החיצונית בעוברי דגים), הוצאת גוף קוטבי וזרימה ציטופלסמית (תרשימים S4A-C; סרט S1). יתרה מכך המיקרופיל, פתח בכוריון המשמש כנקודת הכניסה היחידה של זרע לביציות של דגי זברה, נוכח בביציות bncr-/-, וגודלו דומה לזה בביציות מזן הבר (תרשים S4D). תוצאות אלו מעלות אפשרות כי באונסר אינו נחוץ להפעלת ביציות ולהיווצרות מיקרופילים.

מכיוון שביציות מנקבות bncr-/- הינן נטולות פגמים מורפולוגיים ניכרים, אך אינן מתפתחות מעבר לשלב החד-תאי, ייתכן כי באונסר נחוץ להפרייה ו/או התחלה של מחזורי ההתפצלות הראשוניים. על מנת להבחין בין אפשרויות אלו, ראשית שאלנו האם זרע יכול להיכנס לביציות נטולות באונסר. הפרייה אין ויטרו (IVF) של ביציות מזן הבר וחסרות באונסר עם זרע מתויג על ידי MitoTracker אפשרה לנו לזהות זרע רק בביציות מזן הבר (50%), אך כלל לא בביציות חסרות באונסר (תרשים 2A), מה שמעלה אפשרות כי באונסר משחק תפקיד בכניסת זרע במהלך ההפרייה. בהתאם לרעיון כי הפונקציה היחידה של באונסר היא לאפשר לזרע להיכנס לביצית, שליחת הזרע לביציות חסרות באונסר באמצעות הזרקת זרע תוך-ציטופלסמית (ICSI) עקפה את הצורך בבאונסר והפעילה מחדש את ההתפתחות העוברית מעבר לשלב החד-תאי (תרשימים 2B, S3B). הפונקציה העיקרית של באונסר היא אפוא לאפשר כניסת זרע במהלך ההפרייה.

על מנת לזכות בתובנות נוספות לגבי תפקודו של באונסר, הערכנו את המקומיות שלו. בהתאם לעיגון GPI הצפוי שלו, דימות קונפוקלי הראה כי באונסר בתפקוד מלא המתויג על ידי GFP (תרשים 1E) היה ממוקם בממברנת הביצית ובשלפוחיות בתוך הביצית (תרשים 3A). בנוסף, ביטוי נרחב של גרסה של באונסר ללא עוגן הממברנה בקצה הקרבוקסילי (GFP-BncrnoTM) לא מנעה מצב של כמעט עקרות בקרב נקבות bncr-/- (תרשימים S3A, C), מה שמעלה אפשרות כי ההגבלה המקומית של באונסר לממברנה היא חיונית לתפקודו.

הצורך בבאונסר בממברנת הביצית מרמז על כך שהוא יכול לקדם את גישתו של הזרע לביצית או את הקישור/מיזוג בין הזרע לביצית. דימות תאים חיים הראה כי זרעים רבים המתויגים על ידי MitoTracker נשלחים למיקרופיל באופן עצמאי מבאונסר (תרשים 3B; סרט S2). על כן, באונסר אינו מהווה אות אטרקטיבי חיוני המדריך זרעים אל עבר הביצית/המיקרופיל.

במהלך דימות חי, זרעים רבים נכנסו בו זמנית לפתח הצר של המיקרופיל, כך שהיה בלתי אפשרי לבצע ניתוח מפורט של יכולת הקישור של הזרע לביצית. כדי לחקור את תפקידו הפוטנציאלי של באונסר בקישור זרע-ביצית, חשפנו את כל פני הביצית לזרע על ידי הסרת הכוריון. זרעים שתויגו על ידי MitoTracker נותרו צמודים לפני השטח של ביציות מזן הבר במצבורים גדולים (מעל עשרה זרעים) (תרשימים 3C, D). בניגוד לכך, רק מעט זרעים (10>) נותרו צמודים למרבית הביציות חסרות הבאונסר (P < 0.002) (תרשימים 3C, D). תוצאות אלו מעלות אפשרות כי באונסר מזרז קישורי זרע-ביצית.

באונסר מפגין רמה גבוהה של שונות בין רצפי חומצות אמינו במיני דגים שונים, בדומה לחלבונים אחרים המעורבים בהבדלה מינית ביונקים (תרשים S5A). דבר זה מעלה את האפשרות המעניינת כי באונסר יכול לתרום להיבדלות המינית של ההפרייה בדגים. על מנת לבחון היפותזה זו, ייצרנו דגי זברה bncr-/- שמבטאים באופן נרחב באונסר של דגי מדאקה (bncr-/-; tg[ubi:medaka-bncr]), אשר להלן נקראים דגי באונסר מדאקה טרנסגני. מין המדאקה נבחר בשל המרחק האבולוציוני הגדול שלו מדגי זברה (כ-200 מיליון שנה), חוסר יכולתו ליצור בני כלאיים עם דגי זברה, והזהות הנמוכה (40%) של חומצות אמינו בין חלבוני הבאונסר הבוגרים בדגי זברה ובמדאקה (תרשים 4A). ביטוי של באונסר מדאקה בנקבות bncr-/- לא עזר לפוריות באופן יעיל במהלך הכלאה דגי זברה זכרים מזן הבר (שיעור הפרייה ממוצע של 0.45%, לעומת 0.11% בנקבות bncr-/- ו-78.6% לנקבות מזן הבר) (תרשים 4B), מה שתומך בהיפותזה שלנו כי באונסר יכול להשפיע על אינטראקציה תלוית-מין של גמטות. כדי לבחון אפשרות זו ישירות, ביצענו סדרה של ניסויי IVF. כצפוי, ביציות דגי זברה מזן הבר הפגינו שיעורי הפרייה גבוהים עם זרע של דגי זברה (שיעור ממוצע של 48.3%), אך לא הופרו על ידי זרע של מדאקה (תרשים 4C). בנוסף, ביציות דגי זברה bncr-/- לא הופרו על ידי אף סוג זרע (תרשים 4C). יש לציין כי ביציות מנקבות באונסר מדאקה טרנסגני הופרו על ידי זרע של מדאקה, אך לא של דגי זברה (תרשים 4C), וביציות מנקבות המבטאות באונסר של מדאקה ושל דגי זברה יכלו להיות מופרות על ידי שני סוגי הזרע (תרשים S5B). שיעור ההפרייה הממוצע של כל הנקבות עם באונסר מדאקה טרנסגני (15) שנבחנו היה 3.9% (תרשים S5B). בעוד שש מתוך 15 הנקבות היו עקרות (שיעור הפרייה ממוצע נמוך מ-0.5%; תרשים S5C), ביציות מתשע הנקבות הנותרות הופרו על ידי זרע מדאקה בשיעור ממוצע של 5.7% (תרשים 4C). שיעורי פוריות של נקבות באונסר מדאקה טרנסגני אינדיבידואליות היה בקורלציה עם רמות הביטוי של RNA שליח של באונסר מדאקה בביציות (תרשים S5C), מה שתומך בקשר סיבתי בין ביטוי באונסר מדאקה לבין כניסת זרע מדאקה. העוברים שנוצרו היו הכלאות דג זברה-מדאקה ולא עוברי דג זברה הפלואידיים (תרשים S5D). עוברי כלאיים עברו התפצלות תאית וגסטרולציה (תרשים S5E) והפגינו יצירת ציר קדמי-אחורי לאחר 24 שעות (תרשימים 4D; S5F) אך לא שרדו מעבר ל-48 שעות. תוצאות אלו מדגימות כי באונסר הינו חיוני ומספיק לסיוע בהפרייה תלוית-מין בדגים. כמו מאבטח, באונסר מאפשר כניסה של זרע מאותו המין באופן החלטי, בעוד שהוא מותיר זרע מזן אחר בחוץ. זהו הדיווח הראשון על חלבון באורגניזם כלשהו שמאפשר כניסה של זרע מזן אחר.

הגילוי שלנו, לפיו ביטוי חריג של באונסר של מין אחר הינו מספיק כדי לאפשר הפרייה בין-מינית, מעלה במידה ברורה אפשרות כי לבאונסר יש אינטראקציה תלוית-מין ישירה עם הזרע. בנוסף, שיעור ההפרייה הממוצע הנמוך (5.7%) של ביציות דגי זברה המבטאות באונסר מדאקה מרמז כי גורמים אחרים תורמים ככל הנראה לאינטראקציית זרע-ביצית תלוית-מין. זיהוי הגורמים הללו והפרטנר לאינטראקציה של באונסר בזרע יהיה חיוני להבנת מנגנוני ההבדלה המינית בהפרייה.

עד כה, החלבונים היחידים הצמודים לממברנת זרע וביצית בחולייתנים, שהיו ידועים באינטראקציה שלהם, היו IZUMO1 ו-JUNO ביונקים. עם זאת, עדיין לא ברור האם שני חלבונים אלו משחקים תפקיד בסיוע להפרייה תלוית-מין אין ויוו. באורגניזמים רבים, ההיבדלות המינית של ההפרייה נוצרת דרך גישור בין החלבונים בממברנת הזרע לבין אלו במעטפת הביצית. לדוגמה, בקיפודי ים, חלבון המעטפת החלמונית EBR1         (חלבון קולטן של בינדין ביצית 1) נצמד באופן ספציפי לחלבון בינדין בממברנת הזרע. בדומה לכך, חלבון מעטפת הביצית VERL במין הרכיכה אבלון צמוד באופן תלוי-מין לליסין, חלבון קטן המופרש מהזרע. בעוד לליסין אין הומולוגים ידועים בחולייתנים, VERL מפגין הומולוגיה מבנית לחלבון מעטפת הביצית ZP2 ביונקים, אשר הוכח כמעורב בקישור תלוי-מין של זרע למעטפת הביצית בעכברים ובבני אדם. מעבר לכך, מצד הזרע, חלבון הזרע האקרוזומלי זונאדסין ביונקים נצמד באופן תלוי-מין למעטפת הביצית, על אף שאינו נחוץ להפרייה. בניגוד לחלבונים אלו, באונסר מסייע לקישור תלוי-מין של הזרע לממברנת הביצית, לא למעטפת הביצית.

באונסר ו-SPACA4, שני חברים במשפחת-העל הגדולה Ly6/uPAR, מפגינים דפוסי ביטוי מנוגדים בחומר התורשתי באורגניזם עם הפרייה חיצונית מול הפרייה פנימית. הסיבה לכך אינה ברורה, אך ניתן לשער כי במינים עם הפרייה חיצונית, ביטוי באונסר באואוציטים תורם לבחירת בן זוג עבור נקבות לאחר רבייה (הידועה גם כבחירת בן זוג נקבית קריפטית). חולייתנים עם הפרייה חיצונית לא יכולים להבטיח כי רק זרע מאותו המין יגיע לביצית על ידי בחירת בן זוג לפני רבייה. חלבונים המבוטאים באואוציטים כמו באונסר יכולים אפוא לעזור בבחירת זרע מאותו המין. עבודתנו על באונסר גם מעלה את האפשרות המעניינת כי SPACA4 יכול לשחק תפקיד חשוב בהפרייה ביונקים, אם כי מצד הזכר. למרות שלא דווח עדיין על גורם משבית של Spaca4 במכרסמים, רעיון זה תואם עם מיקומו של SPACA4 בממברנה האקרוזומלית הפנימית, ועם הפיחות הניכר בקישור ומיזוג זרע-ביצית אין ויטרו על ידי הדגרה של זרע עם נוגדן ל- SPACA4. ניסויים עתידיים לגבי הפונקציה של SPACA4 ביונקים  אין ויוו במהלך הפרייה יספקו אפוא עניין רב. בהתחשב בכך ששני הגנים מוגבלים לחומר התורשתי, ממצאינו בדגים יכולים להיות רלוונטיים ישירות לגבי הפרייה ביונקים.

תרשים 1. זיהוי באונסר בדגים.

(A) ביטוי ומאפיינים גנומיים של באונסר. מוצגים נתיבי סיקור עבור ריצוף RNA, פרופילי ריבוזומים (RPF) ונתוני CAGE. הקואורדינטות הגנומיות מבוססות על GRCz10. SP, פפטיד סימון; TM, האזור הטרנס-ממברני; כתום, קשרים דיסולפידים צפויים; צהוב, אתרי גליקוזילציית-N צפויים; טורקיז, אתרי התפצלות טרנסאמידאז צפויים.

(B) חלבון באונסר אנדוגני שעובר גליקוזילציה. באונסר אנדוגני מזוהה בביצית דג הזברה על ידי נוגדן ספציפי במשקל מולקולרי גבוה מהצפוי (~20 kDa) אך נע מטה לעבר הרמה הצפויה (10 kDa) לאחר טיפול באנזימי דה-גליקוזילציה. אף אות לבאונסר לא מזוהה בביציות של נקבות bncr-/- מוטנטיות. (C) סידור רצפי החלבון של המתחם הבוגר של בני משפחת חלבוני באונסר/SPACA4. מלבד הציסטאינים השמורים היטב (כתום מסמל קשרים דיסולפידים צפויים), באונסר/ SPACA4 מראה שונות גבוהה בחומצות אמינו בקרב מינים שונים (ID%, אחוז זהות הרצף למתחם הבוגר של באונסר בדגי זברה). טווח המתחם הבוגר המוצג כאן מבוסס על התחזית לבאונסר בדגי זברה. בכל המינים עבורם היה זמין מידע ביטוי (ביטוי אנושי מבוסס על פורטל GTEx; תגיות רצף מבוטא מבוססות על NCBI), RNA של bouncer/Spaca4 מוגבל לחומר התורשתי של הזכר (סמל: זרע) או הנקבה (סמל: ביצית). לרצפים ותוספות ראו נתונים S1 ו-S2 וטבלה S1. קיצורי חומצות אמינו:

A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; Y, Tyr.

(D ו-E) היעדר באונסר גורם למצב של כמעט עקרות בקרב נקבות דג הזברה. (D) תמונות מייצגות של עובר מתפתח בשלב של שמונה תאים מנקבה מזן הבר, וביצית שנעצרה בשלב החד-תאי מנקבה bncr-/- שעה וחצי לאחר רבייה. (E) באונסר אשר מבוטא באופן טרנסגני, בלתי מתויג על ידי מקדם אוביקוויטין, מתויג על ידי GFP, וללא גליקוזילציה מציל את הפנוטיפ המוטנטי. הנתונים הם בממוצע SD ±; n = מספר הביציות. ***P < 0.0001 (מבחן קרוסקאל-וואליס עם מבחן ההשוואות המרובות של דאן); n.s., בלתי משמעותי.

תרשים 2. באונסר אחראי לכניסת זרע לביצית.

(A) זרע לא נכנס לביציות bncr-/-. משמאל: מערך הניסוי. זרע מזן הבר הוכתם בתווית MitoTracker ובא בשימוש ב-IVF של ביציות מזן הבר ו-bncr-/-. מוצגות תמונות מייצגות (חץ: סימון MitoTracker, מוגדל בתיבה הלבנה). מימין: אחוז הביציות המופרות, כפי שנראה בנוכחות של זרע אחד מתויג על ידי MitoTracker, שלושה סימני DAPI מוגדלים (הגרעין הזכרי, הגרעין הנקבי, גוף קוטבי). ממוצעים של SD ± ניכרים. (B) ICSI יכול להציל ביציות bncr-/-. משמאל למעלה: מערך הניסוי. זרע מזן הבר הוזרק לביציות מזן הבר או bncr-/-. התפצלות התא נרשמה לאחר שלוש שעות. משמאל למטה: תמונות מייצגות. מימין: אחוז הביציות שהפגינו התפצלות תא. ממוצעי SD ± ניכרים. n = מספר הביציות הכולל; N = מספר השכפולים הביולוגיים.

תרשים 3. באונסר מסייע לקישור בין הזרע לביצית.

(A) באונסר מתמקם בממברנת הביצית ובשלפוחיות. דימויים קונפוקליים של ביציות המבטאות באונסר המתויג ב-GFP (ירוק) ו- lyn-Tomato(ממברנה, אדום) במהלך הפעלת הביצית מראים כי באונסר מתמקם בממברנת הביצית סביב המיקרופיל (החץ הלבן המצביע מטה) ולשלפוחיות (החץ הלבן הזוויתי בפאנל של באונסר עם GFP). עיגול אפור, גרעין הביצית. (B) באונסר אינו הכרחי לגישה של הזרע. משמאל: מערך הניסוי. מימין: סדרת זמן מייצגת של מספר זרעים מזן הבר המתויגים ב- MitoTracker(מגנטה) מגיעים לאזור המיקרופיל של ביציות מזן הבר (למעלה) ו- bncr-/-(למטה).

(C) ביציות bncr-/- הינן לקויות בקישורי זרע-ביצית. משמאל: מערך הניסוי. ביציות מופעלות וללא כוריון מזן הבר ו- bncr-/- הודגרו עם זרע מזן הבר מתויג ב- MitoTrackerונשטפו בעדינות. מימין: תמונות מייצגות של ביצית מזן הבר (למעלה, ניקוד של מעל 10) וביצית bncr-/- (למטה) עם זרע צמוד אחד. האזורים בתוך המסגרת מוצגים גם בהגדלה.

(D) כימות קישורי זרע-ביצית. הביציות סווגו בתור 10< זרעים צמודים או 10> זרעים צמודים. הנתונים הם בממוצע של  SD ± (P < 0.002, מבחן מאן-ויטני; n = מספר הביציות; N = מספר השכפולים הביולוגיים).

תרשים 4. באונסר מסייע להפרייה תלוית-מין.

(A) באונסר בוגר במדאקה ודגי זברה כולל רק 40% זהות של רצפי חומצות אמינו. כתום מסמל קשרים דיסולפידים צפויים; הקו הכתום המקוטע מסמל קשר דיסולפידי צפוי בדג זברה אך לא במדאקה. (B) באונסר מדאקה לא מציל באופן יעיל את ההפרייה הפגומה של נקבות דג זברה bncr-/-. ממוצעי SD ± ניכרים (מבחן קרוסקאל-וואליס עם מבחן ההשוואות המרובות של דאן:

wild-type (wt) x wt versus bncr-/- x wt, adj. P**** < 0.0001; wt x wt versus medaka Bouncer x wt, adj. P**** < 0.0001; bncr-/- x wt versus medaka Bouncer x wt, n.s.

n = מספר הביציות; N = מספר השכפולים הביולוגיים). (C) באונסר מדאקה מספיק כדי לאפשר כניסה של זרע מדאקה לביציות דג זברה. זרע מדאקה לא הפרה ביציות דג זברה מזן הבר, אך לביציות דג זברה שביטאו באונסר מדאקה היה שיעור הפרייה ממוצע של 5.7% בניסויי IVF. מוצגים נתונים לגבי תת-הקבוצה של נקבות שביטאו באונסר מדאקה (תשע מתוך 15) שהיו פוריות (ראו תרשים S5B עבור נתונים לגבי כל 15 הנקבות שנבחנו). הנתונים הם בממוצע של SD ± (מבחן קרוסקאל-וואליס עם מבחן ההשוואות המרובות של דאן: זרע מדאקה על ביציות דגי זברה מול ביציות באונסר מדאקה, adj. P**** < 0.0001; זרע דג זברה על ביציות באונסר מדאקה מול זרע מדאקה על ביציות באונסר מדאקה, adj. P**** < 0.0001; זרע מדאקה על ביציות דג זברה bncr-/- מול ביציות באונסר מדאקה, adj. P** = 0.0052; n = מספר הביציות; N = מספר השכפולים הביולוגיים). (D) הפריית ביציות דג זברה המבטאות רק באונסר מדאקה יוצרת עוברי כלאיים של מדאקה ודג זברה. משמאל: עוברי דג זברה מזן הבר המופרים על ידי זרע דג זברה. במרכז: עוברי דג זברה מזן הבר לא מופרים על ידי זרע מדאקה ונרקבים לאחר 24 שעות. מימין: ביציות דג זברה המבטאות רק באונסר מדאקה מופרות על ידי זרע מדאקה ומתפתחות לכדי עוברי כלאיים. hpf, שעות לאחר ההפרייה.